蔣文明，李金平，尹 馨，彭 程，劉 朔，李 陽(yáng)，于曉慧，王靜靜，劉華雷

[中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南方)，山東 青島 266032]

2013年3月，我國(guó)發(fā)生人間H7N9感染病例，同時(shí)家禽中也檢測(cè)到H7N9病毒，雖然動(dòng)物試驗(yàn)證明從家禽中分離到的H7N9病毒對(duì)家禽是無(wú)致病力的，但還是給家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。隨著H7N9病毒的演變，2017年以來(lái)，H7N9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)由弱毒株變異為強(qiáng)毒株，并導(dǎo)致多地暴發(fā)了H7N9亞型高致病性禽流感疫情[1,2]。免疫疫苗后疫情雖然得到有效控制，但家禽疫情仍時(shí)有發(fā)生，對(duì)H7N9及早做出診斷是切實(shí)做好疫病防控和保障養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要基礎(chǔ)。因此，建立H7N9亞型AIV的快速檢測(cè)方法是十分必要的。

目前AIV的分子診斷主要依靠反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和熒光定量RT-PCR方法[3]。RT-PCR檢測(cè)時(shí)容易造成實(shí)驗(yàn)室污染且只能定性檢測(cè)，敏感性也相對(duì)較低；熒光定量RT-PCR方法在定量分析時(shí)需要使用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。更準(zhǔn)確和更靈敏的檢測(cè)技術(shù)是分子檢測(cè)的發(fā)展方向，與第1代普通PCR和第2代熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR作為第3代PCR技術(shù)，在檢測(cè)復(fù)雜來(lái)源樣品中極低含量核酸分子和直接絕對(duì)定量方面具有無(wú)可比擬的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)[4]。數(shù)字PCR主要原理是通過(guò)DNA有限稀釋法和泊松分布的統(tǒng)計(jì)原則來(lái)準(zhǔn)確計(jì)算DNA的濃度，大大降低了體系中反應(yīng)抑制因子的影響[5]。目前數(shù)字PCR已廣泛應(yīng)用到病原微生物檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究等研究領(lǐng)域[6-14]。根據(jù)數(shù)字PCR反應(yīng)單元形成的原理，目前其主要分為3種：微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)、芯片式數(shù)字PCR和微流控芯片式數(shù)字PCR[15]。本研究通過(guò)對(duì)ddPCR檢測(cè)H7亞型AIV的引物和探針濃度、退火溫度、升降溫速度、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間等反應(yīng)條件的優(yōu)化，以及特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)，建立了基于ddPCR技術(shù)的H7亞型AIV的檢測(cè)方法，為H7亞型AIV的早期、快速、定量檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段，為H7亞型AIV的防控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒 經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活的H7N9、H5N6、H9N2亞型AIV、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存。

1.2 主要儀器與試劑 數(shù)字PCR儀一體機(jī)(DQ24 Pro)，購(gòu)自蘇州思納福醫(yī)療科技有限公司；熒光定量PCR儀(QuantStudio 5)，購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。RNA提取試劑盒，購(gòu)自濟(jì)凡生物科技(蘇州)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；pMD18-T載體，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；數(shù)字PCR試劑和耗材，均購(gòu)自蘇州思納福醫(yī)療科技有限公司。

1.3 引物和探針 根據(jù)GenBank和GISAID公開(kāi)的H7亞型AIV的血凝素(Hemagglutinin，HA)基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針。上游引物H7-F：CTA ATT GAT GGT TGG TAT GGT TTC，下游引物H7-R：AAT TGC CGA TTG AGT GCT TTT，探針H7-P：FAM-CAG AAT GCA CAG GGA GAG GGA ACT GCT-BQH1。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取H7N9病毒RNA，作為模板，采用一步法RT-PCR試劑盒，以上、下游引物(H7-F和H7-R)擴(kuò)增HA基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為87 bp；使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后連接至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-H7，通過(guò)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切進(jìn)行鑒定。使用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度后按照公式(1)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。

Copies/μL=6.02×1023×dsDNA質(zhì)量濃度(ng/μL)×10-9÷相對(duì)分子質(zhì)量(g/mol)

(1)

1.5 ddPCR反應(yīng)條件優(yōu)化

1.5.1 引物和探針濃度的優(yōu)化 設(shè)置ddPCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：One-step ddPCR supermix 5.0 μL，Reverse transcriptase 2.0 μL，300 mmol/L DTT 1.0 μL，模板(H7N9亞型AIV核酸)2.0 μL；引物和探針組成設(shè)置3個(gè)組合，分別為600和150 nmol/L、900和250 nmol/L、1 200和350 nmol/L；用水補(bǔ)齊至20.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：50 ℃ 20 min；95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；12 ℃ 60 min；升降溫速率設(shè)置為2.0 ℃/s。

1.5.2 退火溫度的優(yōu)化 根據(jù)1.5.1引物和探針濃度的優(yōu)化結(jié)果配制反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置4個(gè)不同退火溫度：50 ℃、53 ℃、55 ℃、58 ℃，其他程序同1.5.1。

1.5.3 升降溫速度的優(yōu)化 根據(jù)1.5.1引物和探針濃度的優(yōu)化結(jié)果配制反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序采用1.5.2優(yōu)化好的退火溫度，設(shè)置3個(gè)升降溫速度：1.0 ℃/s、2.0 ℃/s、3.0 ℃/s，其他程序同1.5.1。

1.5.4 反轉(zhuǎn)錄時(shí)間的優(yōu)化 根據(jù)1.5.1引物和探針濃度的優(yōu)化結(jié)果配制反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置2個(gè)反轉(zhuǎn)錄時(shí)間：15 min和20 min，其他反應(yīng)參數(shù)為優(yōu)化后的反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將1.4中制備好的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至100、101、102、103和104copies/μL，利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，以ddPCR檢測(cè)的實(shí)際拷貝數(shù)為縱坐標(biāo)，建立ddPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6月14日，全球高新技術(shù)工程和工業(yè)領(lǐng)域的重要領(lǐng)軍者法國(guó)登萊秀集團(tuán)（Groupe?Delachaux）宣布已經(jīng)于5月29日在武漢成立了新的工廠，以滿足亞洲市場(chǎng)不斷增長(zhǎng)的需求和實(shí)現(xiàn)公司在亞太地區(qū)擴(kuò)張的目標(biāo)。截止2017年年末，亞太地區(qū)的銷(xiāo)售額已經(jīng)占其總銷(xiāo)售額的29%。登萊秀集團(tuán)武漢工廠占地面積14?000?m2，雇傭人數(shù)超過(guò)200人。該工廠生產(chǎn)登萊秀集團(tuán)在鐵路基礎(chǔ)設(shè)施以及能源和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)設(shè)施領(lǐng)域的全系列產(chǎn)品，是登萊秀集團(tuán)全球唯一在同一廠房?jī)?nèi)生產(chǎn)這兩種類(lèi)型產(chǎn)品的工廠。該工廠是登萊秀集團(tuán)在亞洲的旗艦，充分體現(xiàn)了集團(tuán)的技術(shù)實(shí)力，以及在管理、環(huán)境和安全方面的最佳實(shí)踐。

1.7 特異性試驗(yàn) 提取H7、H5、H9亞型AIV、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，用建立的ddPCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)，分析該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 選取4個(gè)不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣本重復(fù)檢測(cè)8次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

1.9 敏感性試驗(yàn) 將1.4中制備好的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋(10-8～10-13)，利用優(yōu)化后的ddPCR方法檢測(cè)敏感性。同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)試驗(yàn)，比較2種檢測(cè)方法的靈敏性。

1.10 臨床樣本的檢測(cè) 利用建立的ddPCR方法對(duì)60份臨床疑似H7亞型AIV感染樣品進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用雞胚分離方法進(jìn)行病毒分離，比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 以H7N9亞型AIV RNA為模板，擴(kuò)增得到HA基因片段，連接至pMD18-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，電泳結(jié)果顯示，插入片段的大小與預(yù)期一致(圖1)，測(cè)序結(jié)果正確，重組質(zhì)粒命名為pMD18-H7。使用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計(jì)算重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為8×1011copies/μL。

圖1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18-H7雙酶切鑒定

2.2 ddPCR反應(yīng)條件優(yōu)化 對(duì)引物和探針濃度、退火溫度和升降溫速率等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，引物和探針?lè)磻?yīng)濃度分別為900 nmol/L和250 nmol/L、退火溫度為55 ℃、升溫速率為2.0 ℃/s、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間為20 min時(shí)，H7亞型AIV核酸樣品拷貝值最高，數(shù)值最穩(wěn)定，為ddPCR最優(yōu)反應(yīng)條件(圖2)。

圖2 ddPCR反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至100、101、102、103和104copies/μL，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)重復(fù)檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，計(jì)算出相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2>0.99，線性關(guān)系良好，表明該檢測(cè)方法可靠。

圖3 ddPCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn) 用建立的ddPCR方法分別對(duì)H7、H5、H9亞型AIV、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，H7亞型AIV檢測(cè)結(jié)果為862 copies/μL，其他病原均為0 copy/μL，表明該檢測(cè)方法特異性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)均小于3%(表1)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 ddPCR重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 敏感性試驗(yàn) 將制備好的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋(10-8～10-13)，利用優(yōu)化后的ddPCR方法檢測(cè)，最低檢測(cè)下限為0.8 copies/μL，ddPCR方法敏感性比熒光定量PCR(qPCR)方法高10倍(表2)，表明建立的ddPCR方法敏感性較好。

表2 ddPCR與熒光定量PCR方法敏感性比較

2.7 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)臨床上疑似感染H7亞型AIV的60份樣品進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，12份檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，48份為陰性，與雞胚分離方法結(jié)果一致，符合率為100%,表明建立的ddPCR方法可以對(duì)臨床樣品進(jìn)行有效檢測(cè)，并可進(jìn)行定量分析。

3 討論

2007年以來(lái)，H7N9亞型高致病性禽流感疫情時(shí)有發(fā)生，且病毒不斷變異，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[16]。疫苗使用后，病毒的隱蔽性更強(qiáng)，導(dǎo)致病毒感染早期不易被發(fā)現(xiàn)，更準(zhǔn)確和更靈敏的檢測(cè)手段是未來(lái)發(fā)展方向。數(shù)字PCR作為第3代PCR技術(shù)，具有更高靈敏度和直接絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)。數(shù)字PCR作為新一代分子診斷手段，越來(lái)越多地被應(yīng)用于病原檢測(cè)等領(lǐng)域[11,12]。目前，利用ddPCR技術(shù)對(duì)H7亞型AIV的研究和應(yīng)用相對(duì)較少。

引物和探針濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致拷貝數(shù)降低，濃度過(guò)高則會(huì)抑制PCR反應(yīng)。退火溫度過(guò)低會(huì)影響引物和探針與模板的結(jié)合效率，溫度過(guò)高會(huì)影響微滴的擴(kuò)增效率。升降溫速度過(guò)快會(huì)影響微滴的穩(wěn)定性，也會(huì)影響數(shù)字PCR擴(kuò)增效率，升降溫速度過(guò)快或過(guò)慢均會(huì)影響試驗(yàn)效果，導(dǎo)致陽(yáng)性微滴散亂。本研究針對(duì)H7亞型AIVHA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并進(jìn)行了最佳引物探針濃度、最佳退火溫度、最佳升降溫速度、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間等反應(yīng)條件的摸索，建立了H7亞型AIV ddPCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，最佳引物濃度和探針濃度分別為900 nmol/L和250 nmol/L，最佳的退火溫度為55 ℃，最佳升降溫速度為2.0 ℃/s，最佳反轉(zhuǎn)錄時(shí)間為20 min。

特異性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的ddPCR方法具有良好的特異性，與其他常見(jiàn)禽病病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，僅能檢測(cè)出H7亞型AIV，且重復(fù)性較好。該方法的檢測(cè)結(jié)果與重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，表明該方法具有良好的線性關(guān)系和可信度。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的ddPCR方法最低檢測(cè)限度為0.8 copies/μL，敏感性比qPCR高10倍，具有較高的靈敏度，表明該方法在早期感染或潛伏感染檢測(cè)以及免疫效果評(píng)估中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)60份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的ddPCR方法可以對(duì)臨床樣品中的病毒含量進(jìn)行絕對(duì)定量，并與雞胚分離方法結(jié)果一致。因此，本研究建立的ddPCR方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，能夠快速檢測(cè)到樣本中含量極低的H7亞型AIV，適用于H7亞型AIV的痕量檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、診斷方法評(píng)估、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制、免疫效果評(píng)估，為H7亞型AIV的科學(xué)防控和研究提供了有力的技術(shù)儲(chǔ)備。