何晶，邱春媚，黃遠(yuǎn)英，殷光玲，張旭光

湯臣倍健股份有限公司（廣州 510663）

近年來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐年增長，作為重大疾病深受關(guān)注和討論[1]。以骨密度為關(guān)鍵詞檢索，截至2022年8月，關(guān)于骨密度的注冊保健食品有700余例，這些保健食品的主要功能成分為氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、鈣等。補(bǔ)鈣是治療及預(yù)防骨質(zhì)疏松的重要方式[2-3]。氨基葡萄糖可以促進(jìn)軟骨合成與軟骨細(xì)胞生長，增加骨骼鈣質(zhì)攝取量，刺激黏多糖生化合成，增強(qiáng)滑膜液黏度，減輕患者疼痛[4-6]。硫酸軟骨素可以逆轉(zhuǎn)軟骨損壞，增加關(guān)節(jié)滑液。軟骨素通過對(duì)環(huán)氧化酶-2進(jìn)行抑制，減輕關(guān)節(jié)的發(fā)炎情況；減少纖維蛋白血栓的形成，促進(jìn)軟骨下骨血循環(huán)[6]。軟骨素與氨基葡萄糖協(xié)同作用，進(jìn)一步提高改善效果，并且聯(lián)合使用安全性加高，不會(huì)增加不良反應(yīng)，兩者的聯(lián)合使用在骨關(guān)節(jié)產(chǎn)品中較為常見[5,7]。姜黃在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，具有悠久的使用歷史[8]，其具有廣泛的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。研究表明，姜黃對(duì)骨質(zhì)疏松有一定治療作用，主要是抗炎機(jī)制，以及對(duì)酶類，NF-κB、OPG/RANKL、FoxO3a/Wnt、Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad2/3等信號(hào)通路的調(diào)控[9-11]。

通過研究一種氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度的影響，探究氨糖、軟骨素、鈣及姜黃在增加骨密度方面的協(xié)同作用，并對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)估，為骨關(guān)節(jié)產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

樣品為棕黃色片劑，人體推薦攝入量4.14 g/d，按體重折合劑量0.069 g/（kg·bw）。樣品中功效成分添加量約為氨基葡糖硫酸鉀鹽1 500 mg，硫酸軟骨素500 mg，鈣160 mg，姜黃素40 mg，其余為輔料用于片劑成型。樣品粉碎后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

骨密度試驗(yàn)：SPF級(jí)雌性SD大鼠（來源）。安全毒理試驗(yàn)：SPF級(jí)昆明種小鼠，SD大鼠（來源）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

contrAA700連續(xù)光源原子吸收光譜儀（德國Analytik Jena）；HOLOGIC雙X線骨密度儀（美國HOLOGIC）；AU680全自動(dòng)生化分析儀（美國BECKMAN COULTER）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 骨密度試驗(yàn)

1.2.1.1 卵巢切除

大鼠以30 mg/（kg·bw）的劑量注射戊巴比妥鈉溶液，麻醉，切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后注射青霉素。假手術(shù)組切除約0.5 g脂肪，保留雙側(cè)卵巢。卵巢切除后5 d，進(jìn)行陰道涂片檢查。

1.2.1.2 受試物給予

試驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分組：假手術(shù)組、卵巢切除+溶劑對(duì)照組、卵巢切除+碳酸鈣對(duì)照組、卵巢切除+樣品低劑量組[0.345 g/（kg·bw）]、卵巢切除+樣品中劑量組[0.690 g/（kg·bw）]、卵巢切除+樣品高劑量組[2.070 g/（kg·bw）]。假手術(shù)組和卵巢切除+溶劑組給予等體積的1%羧甲基纖維素，卵巢切除+碳酸鈣對(duì)照組經(jīng)口給予與樣品高劑量組相同鈣含量的碳酸鈣。自試驗(yàn)開始，灌胃對(duì)應(yīng)的受試液，試驗(yàn)時(shí)間為90 d。

1.2.1.3 動(dòng)物生長發(fā)育指標(biāo)

每周稱量動(dòng)物體重。

1.2.1.4 股骨骨密度及骨鈣含量的測定

試驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，剝離股骨，烘烤至恒重，檢測股骨中點(diǎn)處、遠(yuǎn)心端的骨密度。

稱量股骨的總質(zhì)量后，檢測骨鈣含量。

1.2.2 安全毒理試驗(yàn)

1.2.2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受劑量法，選用20只試驗(yàn)小鼠，雌雄各半。每日經(jīng)口灌胃2次（間隔4 h），每次0.2 mL/（10 g·bw），累積達(dá)20.00 g/（kg·bw）。初次灌胃前禁食16 h，灌胃后觀察2周，記錄試驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)。

1.2.2.2 Ames試驗(yàn)

試驗(yàn)采用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102菌株，以多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶（S-9）為體外代謝活化系統(tǒng)。試驗(yàn)劑量為5 000，1 000，200，40和8 μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變，溶劑對(duì)照和陽性突變劑對(duì)照（2-氨基芴、9-芴酮、疊氮鈉、1、8-二羥基蒽醌、絲裂霉素C）。于37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿菌落數(shù)。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

取25只試驗(yàn)小鼠，隨機(jī)分為5組×5只。陽性對(duì)照：0.04 g/（kg·bw）環(huán)磷酰胺；陰性對(duì)照：1%羧甲基纖維素。試驗(yàn)組劑量分別為10.00，5.00和2.50 g/（kg·bw）。連續(xù)5 d，每天灌胃1次，末次灌胃后的第30天處死動(dòng)物，取副睪涂片，每只計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算畸變的發(fā)生率。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以X±S表示。數(shù)據(jù)采用方差分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差不齊則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)化，若仍達(dá)到未方差齊，則采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)大鼠體重的影響

由表1可見，試驗(yàn)前各組動(dòng)物的初始體重差異沒有差異顯著性（P＞0.05）。假手術(shù)組大鼠的第8周末重、試驗(yàn)?zāi)┲丶霸鲋氐陀谌軇?duì)照組，差異有顯著性（P＜0.05）。試驗(yàn)劑量組與溶劑對(duì)照組體重，增重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。通過體重及增重的階段性檢測，表明手術(shù)對(duì)大鼠產(chǎn)生影響，氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)大鼠體重未造成不良影響。

表1 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)大鼠體重的影響

2.2 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)大鼠骨長度和骨密度的影響

由表2可見，各組試驗(yàn)動(dòng)物的股骨長度無顯著差異（P＞0.05）。假手術(shù)組，高劑量組大鼠股骨中心和遠(yuǎn)心端骨密度高于溶劑對(duì)照組，差異有顯著性（P＜0.05）。高劑量氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物的干預(yù)，可促進(jìn)大鼠骨密度的增加。氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合使用，對(duì)骨密度有促進(jìn)作用。

表2 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)大鼠骨長度和骨密度的影響

2.3 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)股骨質(zhì)量和鈣含量的影響

由表3可見，各組試驗(yàn)動(dòng)物的股骨質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05）。假手術(shù)組，高劑量組骨鈣含量高于溶劑對(duì)照組，差異有顯著性（P＜0.05），高劑量氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物可提高大鼠骨鈣含量。復(fù)合物補(bǔ)充鈣，同時(shí)氨糖、軟骨素及姜黃也一定程度地促進(jìn)鈣的吸收與轉(zhuǎn)化等。

表3 氨糖軟骨素鈣姜黃對(duì)大鼠股骨重量和鈣含量的影響

2.4 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物的急性毒性試驗(yàn)

氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物[20.00 g/（kg·bw）]給試驗(yàn)動(dòng)物灌胃后，動(dòng)物未見明顯中毒癥狀，無顯著的體重變化，經(jīng)過14 d的觀察無死亡。觀察期末處死受試動(dòng)物進(jìn)行解剖未見明顯異常，包括肝、脾、腎、腸、心、肺等主要器臟。氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)雌雄小鼠的最大耐受劑量（MTD）大于20.00 g/（kg·bw），按保健食品分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]，屬無毒級(jí)。

表4 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物的急性毒性試驗(yàn)

2.5 Ames試驗(yàn)

由表5和表6結(jié)果可見，對(duì)TA97a、TA98、TA100、TA102這4株試驗(yàn)菌株，加與不加S-9，氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物的各劑量組回變菌落均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，無劑量-反應(yīng)關(guān)系，為陰性[12]，氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合使用較為安全。

表5 Ames試驗(yàn)結(jié)果（第1次）（X±S）

表6 Ames試驗(yàn)結(jié)果（第2次）（X±S）

2.6 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表7可見，氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物干預(yù)的各試驗(yàn)組的小鼠精子畸形發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較無明顯差異（P＞0.05），而陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性（P＜0.01）。試驗(yàn)表明氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)小鼠精子未造成畸形[12]，氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合經(jīng)毒理評(píng)價(jià)具有一定安全性。

表7 氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

3 結(jié)論

以0.345，0.690和2.070 g/（kg·bw）劑量的氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物給雌性去勢SD大鼠灌胃90 d，2.070 g/（kg·bw）劑量組大鼠股骨中心和遠(yuǎn)心端骨密度，骨鈣含量顯著高于溶劑對(duì)照組（P＜0.05），氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)于大鼠有增加骨密度的作用[12]。林麗萍等[7]、郁樺等[13]研究表明氨糖與軟骨素協(xié)同作用促進(jìn)骨密度，氨糖與軟骨素可通過促進(jìn)軟骨增長，提高骨骼對(duì)鈣的攝取，進(jìn)而提高骨密度。陽春華等[14]研究軟骨素加鈣的干預(yù)，表明軟骨素與鈣聯(lián)合使用可增加大鼠的骨密度。劉汝萃等[15]進(jìn)行氨糖軟骨素鈣片的大鼠骨密度的試驗(yàn)，結(jié)果表明氨糖軟骨素鈣片可顯著增加骨密度。王銅浩等[9]、李義等[11]研究姜黃對(duì)骨質(zhì)疏松的影響，表明姜黃對(duì)骨密度等具有積極影響，姜黃通過抗炎、抗氧化等機(jī)制改善骨關(guān)節(jié)健康。小鼠試驗(yàn)表明，氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物對(duì)雌雄小鼠的MTD大于20.00 g/（kg·bw），屬無毒級(jí)。Ames試驗(yàn)表明，小鼠精子畸形均為陰性。氨糖軟骨素鈣姜黃復(fù)合物屬于實(shí)際無毒[12]。黃佳寧等[16]、林麗萍等[17]、魏慶鋼[18]、李慶等[19]研究也表明氨糖、軟骨素、姜黃食用安全，毒理學(xué)試驗(yàn)為無毒級(jí)。鈣為常規(guī)膳食補(bǔ)充劑，也具有大量研究及食用歷史[20-22]。試驗(yàn)中氨糖、軟骨素、鈣及姜黃食用安全，4種原料組合使用未造成試驗(yàn)動(dòng)物異常。氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合對(duì)骨密度具有協(xié)同促進(jìn)作用，并且具有一定安全性，可應(yīng)用于保健食品等研究與開發(fā)。