徐兆坤 李 敏 羅海霞 （寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750021）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一種由活細(xì)胞分泌，具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，無(wú)法復(fù)制的納米級(jí)顆粒［1］。EVs 最初在真核生物中被發(fā)現(xiàn)，攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等多種物質(zhì)，根據(jù)大小、生物特征及形成過(guò)程被分為外泌體、微囊泡和凋亡小體［2］。近年來(lái)的研究顯示，來(lái)自古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物三大生命領(lǐng)域的細(xì)胞都能夠分泌EVs［3］。細(xì)菌按細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異可分為革蘭氏陰性菌（G-菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌）。G-菌的細(xì)胞壁由兩層被周質(zhì)空間隔開(kāi)的內(nèi)外兩層脂膜組成，而G+菌僅有一層脂膜并且被厚層肽聚糖和磷脂壁酸組成的細(xì)胞壁包圍［4-5］。20 世紀(jì)60 年代，人們從G-菌大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了EVs，有研究者認(rèn)為G-菌的EVs 是通過(guò)外膜擠壓產(chǎn)生的，因此稱(chēng)其為外膜囊泡（outer-membrane vesicles，OMVs）［6-9］。由于G+菌缺少外膜且存在厚細(xì)胞壁，G+菌一度被認(rèn)為無(wú)法產(chǎn)生EVs，直到1990 年才出現(xiàn)關(guān)于G+菌產(chǎn)生EVs的研究報(bào)道［10］。G+菌產(chǎn)生的EVs 一般被稱(chēng)為膜囊泡（membrane vesicles，MVs），之后科學(xué)界統(tǒng)一將其規(guī)范命名為EVs［1］。

近年來(lái)G+菌來(lái)源的EVs（G+-EVs）引起了廣泛關(guān)注，多項(xiàng)研究表明金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌及單核增生李斯特菌等G+菌均可分泌EVs［11-14］。與真核細(xì)胞和G-菌分泌的EVs 類(lèi)似，G+-EVs同樣包含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)及代謝產(chǎn)物等生物活性分子，直徑為20～500 nm［15］。然而不同菌屬來(lái)源的EVs 直徑大小、組成、生物發(fā)生及功能存在差異，這表明EVs的分泌雖然是一種保守的生物現(xiàn)象，但仍具有物種特異性［3，16］。因此推進(jìn)G+-EVs 的研究進(jìn)程對(duì)于全面理解EVs在細(xì)胞生命歷程中的地位有重要的意義。大量的研究表明G+-EVs 在生物膜形成、水平基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）、耐藥性及對(duì)宿主細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)等方面扮演了重要角色，在疫苗開(kāi)發(fā)、相關(guān)疾病治療以及藥物遞送等領(lǐng)域也具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值［17-22］。本文對(duì)近年來(lái)G+-EVs 在生物發(fā)生、組成、功能及應(yīng)用等方面的研究進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 G+-EVs的生物發(fā)生

有研究者認(rèn)為細(xì)菌EVs 可能是菌體死亡裂解后，脂膜自發(fā)形成的囊泡結(jié)構(gòu)，隨后有研究者用熱滅活細(xì)菌進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明了EVs的形成依賴(lài)于具有新陳代謝活性的細(xì)胞，這說(shuō)明EVs 的形成是活性細(xì)胞生命活動(dòng)中的正常生理過(guò)程［14，23-25］。大量關(guān)于G-菌的研究顯示，G-菌分泌EVs受多種基因的調(diào)控，大腸桿菌分泌EVs 的過(guò)程涉及至少100 個(gè)基因，這也提示G+-EVs 的生物發(fā)生也極有可能由一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控［26-29］。LEE 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞增生李斯特菌中，轉(zhuǎn)錄因子σB（transcription factor σB，sigB）基因缺失突變株EVs 分泌減少，且其形態(tài)與野生株分泌的EVs存在差異。變形鏈球菌中編碼4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶的sfp基因、表面活性素合成酶同系物基因bacA、二腺苷酸環(huán)化酶編碼基因dac及磷酸二酯酶編碼基因pdeA的缺失均可顯著增加變形鏈球菌EVs 的產(chǎn)量，而與之相反的是桿菌肽合成酶同系物基因bacA2的缺失導(dǎo)致變形鏈球菌EVs的產(chǎn)量顯著降低［31］。還有研究證明A組鏈球菌中雙組分系統(tǒng)CovRS 也具有調(diào)控EVs 形成的功能［25］。不同的物種還可能存在物種內(nèi)特定的基因調(diào)節(jié)EVs 的形成，酚溶性調(diào)節(jié)蛋白（phenol soluble modulins，PSM）是一類(lèi)具有表面活性劑活性的蛋白家族，可分為α 型和β 型。金黃色葡萄球菌缺失了psmα后，其培養(yǎng)上清中的EVs 顯著減少，說(shuō)明psmα對(duì)于金黃色葡萄球菌分泌EVs 具有重要調(diào)節(jié)作用，而psmβ卻沒(méi)有這種功能［32］。更有趣的是，雖然在其他葡萄球菌中也存在psmα，但目前的結(jié)果顯示psmα僅在金黃色葡萄球菌中具有調(diào)節(jié)EVs 的功能［32-34］。作為高度保守的調(diào)節(jié)因子sigB可能在G+-EVs 的產(chǎn)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但尚無(wú)法確定是否存在保守的EVs 調(diào)節(jié)基因或系統(tǒng)適用于絕大多數(shù)G+菌，上述研究都表明G+-EVs 的產(chǎn)生確實(shí)是一種涉及多基因的復(fù)雜調(diào)控系統(tǒng)。除了基因調(diào)控，環(huán)境條件的變化對(duì)EVs 的產(chǎn)生方式也存在影響。NAGAKUBO 等［35］研究發(fā)現(xiàn)含分枝桿菌酸的谷氨酸棒桿菌響應(yīng)不同的環(huán)境條件，通過(guò)不同途徑形成不同類(lèi)型的EVs。在絲裂霉素C（MMC）處理下，谷氨酸棒桿菌通過(guò)內(nèi)溶素（肽聚糖降解酶）觸發(fā)的細(xì)胞裂解誘導(dǎo)EVs的形成；在添加青霉素或缺少生物素的生長(zhǎng)條件下，谷氨酸棒桿菌包膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而誘導(dǎo)谷氨酸棒桿菌通過(guò)菌膜起泡形成EVs，更重要的是這些途徑在其他含霉菌酸的細(xì)菌（如恥垢分枝桿菌、紅球菌）中是保守的［35］。

由于G+菌細(xì)胞壁的特性，EVs 產(chǎn)生后如何穿過(guò)厚的細(xì)胞壁分泌到細(xì)胞外這個(gè)問(wèn)題仍未得到準(zhǔn)確的解釋。目前，關(guān)于G+-EVs 釋放到外界的方式存在三種觀點(diǎn)：①G+-EVs 從質(zhì)膜上釋放后，可能因膨脹壓力而被迫穿過(guò)細(xì)胞壁，這種情況下，G+-EVs 的釋放受到細(xì)胞壁孔徑和厚度的調(diào)節(jié)。金黃色葡萄球菌膨脹壓力的降低減少了EVs 的釋放，這表明低滲環(huán)境可在囊泡分泌過(guò)程中發(fā)揮重要作用［36］。②隨G+-EVs 釋放的細(xì)胞壁修飾酶可通過(guò)改變細(xì)胞壁狀態(tài)釋放EVs。G+菌細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)依賴(lài)于合成和降解的平衡，由轉(zhuǎn)肽酶（penicillin-binding proteins，PBPs）和自溶素等蛋白協(xié)調(diào)［37-38］。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌及痤瘡丙酸桿菌所分泌的EVs 都包含PBPs 和自溶素［39-41］，金黃色葡萄球菌中PBPs 的缺陷導(dǎo)致EVs 產(chǎn)量增加，而自溶素突變導(dǎo)致EVs大小發(fā)生變化［32］。這表明細(xì)胞壁修飾在囊泡釋放中可能起著關(guān)鍵作用。③G+-EVs 可以發(fā)生形態(tài)改變，可能通過(guò)比EVs 直徑更窄的通道，G+-EVs 可經(jīng)通道進(jìn)而被釋放［4］。由于起步較晚，G+-EVs 生物發(fā)生的相關(guān)研究仍然較少，其生物發(fā)生機(jī)制仍待闡明。

2 G+-EVs的組成

EVs 中包含多種組分，合適的EVs 分離純化方法對(duì)于解析EVs 的組成至關(guān)重要，差速超速離心結(jié)合密度梯度離心的方法仍是目前最被認(rèn)可和采用的G+-EVs 分離提取方案［39，42］。除此之外，也可采用差速離心結(jié)合尺寸排阻色譜法或其他方式分離EVs。與G-菌來(lái)源EVs 類(lèi)似，G+-EVs 中同樣包含蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等具有生物活性的分子［16］。不同細(xì)菌來(lái)源的EVs 中包含物存在顯著差異，甚至同一種菌在不同培養(yǎng)條件下分泌的EVs 其內(nèi)容物也同樣存在差異［43］。

2.1 蛋白質(zhì) LEE 等［39］首次在金黃色葡萄球菌分泌的EVs 中鑒定出90 種蛋白質(zhì)，其中大部分是細(xì)胞質(zhì)蛋白。之后另外的研究者進(jìn)一步分析了金黃色葡萄球菌分泌的EVs，表明與EVs 相關(guān)的蛋白質(zhì)超過(guò)200種，其中160種是細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)［45］。EVs攜帶的蛋白既可以包裹于EVs內(nèi)部又可以錨定在EVs的膜上，根據(jù)EVs 的起源，EVs 膜相關(guān)蛋白應(yīng)該來(lái)自于細(xì)胞質(zhì)膜，而EVs 內(nèi)的蛋白則應(yīng)該是在EVs 發(fā)生過(guò)程中包裝的細(xì)胞質(zhì)蛋白［11，46］。有研究顯示，EVs、全菌及細(xì)菌細(xì)胞膜之間蛋白組成存在差異［25，47］。在A組鏈球菌EVs 所包含的蛋白中，有3 種是EVs 所特有的［25］?？莶菅挎邨U菌中，有30 種蛋白質(zhì)只與EVs相關(guān)，而與細(xì)菌細(xì)胞無(wú)關(guān)［48］。單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛋白質(zhì)組成分析顯示，296 種蛋白質(zhì)存在于全細(xì)胞中，16種蛋白質(zhì)僅存在于EVs［49］。除此之外，在不同培養(yǎng)條件下，相同菌株產(chǎn)生的EVs 中蛋白質(zhì)組成也存在較大差異，這說(shuō)明可能存在特定的分選轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，將不同的蛋白整合至EVs［11，14，25，47，50］。EVs蛋白的功能分析表明，EVs 中常見(jiàn)的蛋白質(zhì)類(lèi)型與細(xì)菌能量產(chǎn)生、營(yíng)養(yǎng)吸收以及翻譯等代謝過(guò)程相關(guān)［40-41，51］。然而這些蛋白的具體作用目前報(bào)道仍然較少。比較有趣的是，對(duì)于一些致病性G+菌，某些毒力蛋白在EVs 中被富集，比如單核增生李斯特菌EVs富集了李斯特菌溶血素O（LLO），金黃色葡萄球菌EVs富集了α-溶血素（Hla），毒力蛋白在EVs中的存在影響了致病菌感染宿主的過(guò)程，這也說(shuō)明EVs是致病菌毒力組成中的重要部分［14，52］。

2.2 核酸 目前關(guān)于EVs 攜帶核酸的報(bào)道主要來(lái)自于G--EVs，已經(jīng)證明在G--EVs 中存在DNA 和RNA（如mRNA、rRNA和tRNA），而G+-EVs中攜帶核酸的報(bào)道仍然較少［53］。WEN 等［31］發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌EVs 攜帶DNA，這些DNA 主要分 布 于EVs 表面，RESCH 等［25］發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌EVs 攜帶了多種RNA。EVs 中的核酸來(lái)源于原菌體，但與全菌細(xì)胞相比可能存在顯著差異，B 組鏈球菌來(lái)源的EVs 攜帶DNA，其中包括成孔毒素編碼基因cfb，但并未檢測(cè)到其他毒力基因或管家基因［54］。相對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，化膿性鏈球菌EVs中207種RNA存在差異，其中120種RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在EVs中豐度更高［25］。這似乎顯示EVs 可以有選擇地包裝細(xì)胞基因，并將其分泌至細(xì)胞外。與這些研究不同的是，WANG 等［55］發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌Dietzia sp.DQ12-45-1b 產(chǎn)生的EVs 中同樣包含DNA，測(cè)序結(jié)果顯示EVs中的DNA 組裝長(zhǎng)度為3 792 433 bp，覆蓋了全菌基因組的99.23%，這些結(jié)果說(shuō)明EVs可以作為載體包裝幾乎整個(gè)細(xì)菌基因組，這些基因組基因可能進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中，提示G+菌可能存在未知的機(jī)制調(diào)控EVs 中的核酸組成和運(yùn)輸。包含在EVs中的核酸對(duì)于致病菌的毒力同樣十分重要，金黃色葡萄球菌EVs 中含有DNA 和sRNA，具有激活宿主細(xì)胞模式識(shí)別受體的能力，并促進(jìn)上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子［56-57］。這進(jìn)一步說(shuō)明了病菌致病過(guò)程的復(fù)雜性以及EVs在此過(guò)程的重要性。

2.3 脂質(zhì) 脂質(zhì)是EVs的重要組成，但不同種屬來(lái)源的EVs所攜帶的脂質(zhì)含量或種類(lèi)均存在差異。脂質(zhì)組學(xué)分析表明，炭疽芽孢桿菌EVs 富含肉豆蔻酸和棕櫚酸，肺炎鏈球菌EVs富含短鏈飽和脂肪酸，單核細(xì)胞增生李斯特菌EVs富含磷脂酰乙醇胺和鞘脂等不飽和脂肪酸［14，40，58］。短鏈飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸會(huì)影響膜曲率和膜流動(dòng)性，脂肪酸種類(lèi)和含量的差異可能會(huì)影響EVs 在G+菌中的釋放過(guò)程，但這些脂質(zhì)成分的具體作用則需要進(jìn)一步探究。

2.4 其他成分 除了蛋白質(zhì)、核酸以及脂質(zhì)外，G+-EVs 還攜帶其他生物活性分子，如肽聚糖、鳥(niǎo)氨酸、檸檬酸鹽、肌醇等物質(zhì)［16］。CAO 等［59］對(duì)酸性條件下變形鏈球菌EVs中代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甜菜堿、海藻糖和左旋肉堿等壓力保護(hù)劑在EVs 中上調(diào)，這為探究G+菌在環(huán)境壓力下的存活機(jī)制提供了參考。目前關(guān)于G+-EVs 中糖類(lèi)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物相關(guān)功能的研究還處于起步階段，是一個(gè)需要進(jìn)一步探索的領(lǐng)域。

3 G+-EVs的功能

多項(xiàng)研究顯示G+-EVs 的功能主要由其攜帶的酶、脂蛋白、核酸以及各種毒素決定，包括參與細(xì)菌生物膜形成、HGT 及抗生素抗性等生理過(guò)程，也參與致病菌感染期間對(duì)宿主細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程［14，45-47］。

3.1 生物膜形成 生物膜被認(rèn)為是環(huán)境中微生物的重要狀態(tài)，賦予細(xì)菌抵御外界極端環(huán)境的生存能力，并促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)定植［18，60］。G+-EVs 攜帶的成分：細(xì)胞外DNA（eDNA）、黏附相關(guān)蛋白以及脂質(zhì)等均可參與生物膜的形成［61-62］，向培養(yǎng)基中添加變形鏈球菌EVs 后，顯著增強(qiáng)了變形鏈球菌的生物膜形成［31］，更有研究者成功從枯草芽孢桿菌和羅伊氏乳桿菌生物膜中分離出EVs［48，63］。eDNA 是生物膜基質(zhì)的重要部分之一［64］，LIAO等［65］證明變形鏈球菌可以產(chǎn)生攜帶eDNA 的EVs，WEN 等［31］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌EVs 攜帶的eDNA 存在于EVs 表面，pH升高導(dǎo)致了變形鏈球菌生物膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的釋放，但當(dāng)變異鏈球菌生物膜用DNaseⅠ處理后，沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象，這表明eDNA 和蛋白質(zhì)在變形鏈球菌生物膜內(nèi)相互作用，并且eDNA 的存在可以顯著減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的釋放，這也間接說(shuō)明攜帶了eDNA 的EVs 在生物膜的形成和穩(wěn)定性中的作用。更有趣的是變形鏈球菌中的EVs不僅有利于其自身生物膜的形成，而且有助于白色念珠菌生物膜的形成［66］。然而與之相反的是，楊麗玉等［67］在研究中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自單核增生李斯特菌的EVs 對(duì)其自身生物膜的形成具有顯著的抑制作用，不同基因突變株來(lái)源的EVs均可表現(xiàn)出對(duì)生物膜形成的抑制作用，并且這些EVs 對(duì)自身菌生物膜形成的抑制作用最為顯著。群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌適應(yīng)高密度生存的策略之一，產(chǎn)生稱(chēng)為自誘導(dǎo)劑的群體感應(yīng)分子有助于細(xì)菌黏附和生物膜形成［21］。在金黃色葡萄球菌中，群體感應(yīng)相關(guān)的agr基因座控制細(xì)菌EVs 蛋白和毒力因子的組成，表明agr基因座與EVs 產(chǎn)生以及生物膜形成之間的聯(lián)系［39，68-69］。這些研究充分說(shuō)明EVs在生物膜形成的過(guò)程具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而不僅僅作為組成參與其中。

3.2 耐藥性 細(xì)菌通常對(duì)抗生素敏感，但作為適應(yīng)性反應(yīng)的一部分，在一些條件下細(xì)菌可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性，EVs 在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［70］。來(lái)自枯草芽孢桿菌的EVs 富含Sun Ⅰ蛋白（也稱(chēng)為YolF），賦予枯草芽孢桿菌對(duì)羊毛硫抗生素的抗性，而EVs中脂肽抗生素表面活性素的存在使EVs不穩(wěn)定，導(dǎo)致EVs中的活性分子被釋放出來(lái)，可能有助于枯草芽孢桿菌耐藥性的形成［48，71］。對(duì)鏈霉素敏感的單核細(xì)胞增生李斯特菌產(chǎn)生的EVs能夠以劑量依賴(lài)性的方式保護(hù)單核細(xì)胞增生李斯特菌免受抗生素甲氧芐氨嘧啶和鏈霉素的殺傷作用，使其能夠在鏈霉素存在下存活［19］。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，金黃色葡萄球菌EVs 含有一種降解β-內(nèi)酰胺所需的酶BlaZ［39］，EVs 通過(guò)酶降解環(huán)境中β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素從而達(dá)到耐藥的目的［72］，而β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素如氟氯西林和頭孢洛林的使用會(huì)進(jìn)一步增加金黃色葡萄球菌EVs 的產(chǎn)量。因此，EVs 通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素抗性因子在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。

3.3 HGT HGT 又稱(chēng)為側(cè)向基因轉(zhuǎn)移（lateral gene transfer，LGT），指生物將遺傳物質(zhì)傳遞給其他細(xì)胞而非其子代的過(guò)程。HGT 通過(guò)遺傳物質(zhì)的移動(dòng)、抗生素抗性和毒力因子的傳播等過(guò)程，在許多生物體的進(jìn)化中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)菌中，除了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合外，攜帶核酸的EVs 在細(xì)胞之間的融合是HGT 的另一種機(jī)制，并已在G-細(xì)菌中被證明［18，73］。有報(bào)道顯示，存在EVs 介導(dǎo)的從鮑曼不動(dòng)桿菌、貝氏不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌向大腸桿菌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移［74］。EVs在物種間基因轉(zhuǎn)移的潛力取決于受體物種吸收和維持水平獲得的核酸的能力，短的線性染色體片段和重復(fù)的DNA 序列被包裝至EVs以便輸出到細(xì)胞外［75］。纖維素分解瘤胃球菌類(lèi)囊泡顆粒攜帶雙鏈DNA，這些與類(lèi)囊泡顆粒相關(guān)的DNA 主要是大小在20～90 kb 的線性分子群，使用瘤胃球菌屬的培養(yǎng)物上清液中含有囊泡的部分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，恢復(fù)了突變菌株YE71 降解結(jié)晶纖維素的能力，這種能力可以遺傳并傳遞給后代［75］。通過(guò)EVs進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性形成的重要因素，細(xì)菌的抗生素抗性基因可以通過(guò)EVs 轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌。例如大腸桿菌分泌攜帶抗生素黏菌素、蜂毒肽抗性基因的EVs 處理后，使銅綠假單胞菌和抗輻射不動(dòng)桿菌也獲得了相應(yīng)的耐藥性［76］。同樣，G+-EVs也含有多種基因，極可能在類(lèi)似的耐藥性形成或傳播中起著至關(guān)重要的作用。KIM等［77］發(fā)現(xiàn)用來(lái)自枯草芽孢桿菌的親脂性探針標(biāo)記的EVs可以與其他枯草芽孢桿菌細(xì)胞融合，DEAN 等［78］發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌EVs與德氏乳桿菌或大腸桿菌膜融合。在芽孢桿菌屬物種中，大約112 個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因在HGT 中發(fā)揮進(jìn)化作用，10 種前噬菌體參與細(xì)菌致病性基因的轉(zhuǎn)移機(jī)制［79］。蛋白質(zhì)組分析顯示噬菌體蛋白被包裝到EVs 中作為枯草芽孢桿菌的HGT 介質(zhì)［80］。這些證據(jù)提示，在G+細(xì)菌中也可能存在通過(guò)EVs 進(jìn)行HGT的機(jī)制，并且EVs 中所包含的RNA 也可能發(fā)生類(lèi)似的機(jī)制，受體細(xì)菌可以暫時(shí)使用EVs 傳遞的RNA 產(chǎn)生相應(yīng)表型［53］。

3.4 免疫調(diào)節(jié) G+-EVs 中攜帶了脂蛋白和毒素等多種免疫相關(guān)分子，這是其誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的前提。金黃色葡萄球菌EVs中含有誘導(dǎo)人類(lèi)T 細(xì)胞活化的超抗原腸毒素SeQ、脂肪酶、免疫逃避蛋白SbI、毒素（如PSMs、LukSF-PV 和LukAB）、降解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的β-內(nèi)酰胺酶以及能夠促進(jìn)組織侵襲的葡萄球菌蛋白酶A［11，39，45-46，81］。同樣，單核細(xì)胞增生李斯特菌EVs含有可協(xié)助該菌從宿主液泡中逃逸的毒素LLO［14，82］。在炭疽芽孢桿菌中，炭疽毒素致死因子（LF）、水腫因子（EF）和保護(hù)性抗原（PA）等存在于EVs，但未在培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)［40，83］。與之類(lèi)似的是肺炎鏈球菌胞質(zhì)孔形成毒素僅能通過(guò)EVs分泌在宿主細(xì)胞中釋放［47］，這些證據(jù)更加證明了EVs 在致病菌毒力組成中的重要性。更有證據(jù)表明，與某些分泌的可溶性毒素相比，在EVs 中攜帶同種毒素后可能對(duì)疾病發(fā)展的影響更大，特應(yīng)性皮炎的特征為角質(zhì)細(xì)胞壞死引發(fā)的慢性皮膚炎癥，導(dǎo)致皮膚屏障功能喪失，HONG 等［84］發(fā)現(xiàn)可溶性的金黃色葡萄球菌α 毒素或攜帶α 毒素的EVs 均誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞死亡，但只有EVs 存在才會(huì)引起小鼠真皮中角質(zhì)細(xì)胞壞死和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，這是特應(yīng)性皮炎特有的過(guò)程。這種現(xiàn)象的潛在原因可能為：毒素在EVs 中被富集，并且可以進(jìn)行更遠(yuǎn)距離的傳遞而不會(huì)被稀釋或被宿主免疫系統(tǒng)清除，可以保證毒素以更高的濃度傳遞；另一種可能是這兩種情況下，毒素與宿主細(xì)胞的作用方式可能會(huì)存在差異，可溶性毒素只能從外部攻擊宿主細(xì)胞，而與EVs 相關(guān)的毒素可以直接進(jìn)入受體細(xì)胞中，破壞宿主細(xì)胞器，并從內(nèi)部攻擊宿主細(xì)胞膜［53］。目前G+-EVs 進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式有3 種被廣泛證實(shí)，分別是動(dòng)力蛋白依賴(lài)性內(nèi)吞作用、網(wǎng)格蛋白依賴(lài)性內(nèi)吞作用以及膜融合，鑒于G--EVs已被發(fā)現(xiàn)具有多種內(nèi)化方式，G+-EVs的內(nèi)化方式則需要更多的證據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充論證［11，13，85-87］。

攜帶多種毒力因子的G+-EVs 可刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子。Filifactor alocis是一種革蘭氏陽(yáng)性牙周病原菌，其產(chǎn)生的EVs 可促進(jìn)THP-1 細(xì)胞中CCL1、CCL2、MIP-1、ICAM-1、IL-6 及IL-8 等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且以TLR2 依賴(lài)性方式抑制成骨，參與牙周炎相關(guān)骨丟失的發(fā)病過(guò)程［88-89］。肺炎鏈球菌EVs在人單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞中以獨(dú)立于肺炎球菌溶血素的方式誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α 的產(chǎn)生［47，90］。宿主細(xì)胞炎癥因子的釋放與細(xì)胞模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）息息相關(guān)，G+-EVs 含有大量TLR2 配體，如脂磷壁酸、肽聚糖和脂蛋白，可以與細(xì)菌一起通過(guò)TLR2 發(fā)揮固有免疫調(diào)節(jié)作用［91-92］。產(chǎn)氣莢膜梭菌EVs 通過(guò)TLR2 信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-6 的釋放［93］。金黃色葡萄球菌EVs 通過(guò)TLR2 信號(hào)通路增強(qiáng)炎癥介質(zhì)的釋放，這種作用主要由EVs 中的脂蛋白所誘導(dǎo)［11，85，94］。WANG 等［11］發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌EVs 膜內(nèi)的脂蛋白刺激TLR2，導(dǎo)致NF-κB 激活，大量合成pro-IL-1β 和pro-IL-18，同時(shí)EVs 相關(guān)的成孔毒素如LukAB 和α-毒素通過(guò)K+外流激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo) 致caspase-1 激 活 并 釋 放 活 性IL-1β 和IL-18。TLR2 依賴(lài)性激活途徑似乎是G+-EVs 促炎作用中的重要信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但其他受體信號(hào)途徑可能也參與其中。BITTO 等［56］的研究結(jié)果確定，金黃色葡萄球菌EVs中包含多種微生物相關(guān)分子模式（microbeassociated molecular patterns，MAMPs），包括DNA、RNA 和肽聚糖，能夠激活細(xì)胞模式識(shí)別受體TLR2、TLR7、TLR8、TLR9 以及NOD2，并促進(jìn)上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子。除促炎反應(yīng)外，一些益生菌如副干酪乳桿菌所產(chǎn)生的EVs降低了LPS誘導(dǎo)的促炎因子IL-1α、IL-1β、及TNF-α 等細(xì)胞因子的表達(dá)，并增加了HT29 細(xì)胞中抑炎因子IL-10 和TGF-β的表達(dá)，來(lái)自其他乳酸桿菌物種的EVs 也已被證明可以抑制外周血單核細(xì)胞的促炎因子分泌［95-96］。更有趣的是，口服副干酪乳桿菌EVs 通過(guò)維持結(jié)腸長(zhǎng)度和降低疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）來(lái)預(yù)防葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，這也提示了益生菌來(lái)源的EVs 具有防治疾病的相關(guān)潛力［95］。

4 G+-EVs的潛在應(yīng)用

EVs 攜帶多種毒力因子，能夠有效刺激宿主先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，并且EVs 本身不可復(fù)制增殖，因此其具有比減毒疫苗更安全的優(yōu)勢(shì)［22］。LEE等［97］純化了馬鏈球菌株的EVs，并將其作為感染馬鏈球菌小鼠的候選疫苗進(jìn)行了免疫評(píng)估。他們通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)和反向疫苗學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)EVs中富含32種具有疫苗潛力的分子，與用熱滅活細(xì)菌免疫的小鼠相比，腹膜內(nèi)注射馬鏈球菌EVs 的小鼠被感染后的存活率更高，表明馬鏈球菌衍生的EVs 可以作為針對(duì)馬鏈球菌感染的候選疫苗。除此之外，通過(guò)對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，可以進(jìn)一步提高EVs 的安全性、免疫原性和產(chǎn)量。WANG 等［32］通過(guò)基因工程手段，得到可將毒素HlaH35L和LukE 大量包裝至EVs 的金黃色葡萄球菌突變體，突變體分泌的EVs 在小鼠中具有免疫原性，誘發(fā)溶細(xì)胞素中和抗體并為敗血癥小鼠提供了有效的保護(hù)，可作為潛在的疫苗預(yù)防治療金黃色葡萄球菌引發(fā)的相關(guān)疾病。目前G-菌相關(guān)研究中已有基于EVs 的疫苗獲得批準(zhǔn)，這也暗示了G+-EVs 作為疫苗候選者的巨大潛力［22］。

除此之外，益生菌來(lái)源的EVs具有抑菌、抑制炎癥以及改善胃腸道功能的作用，可以開(kāi)發(fā)基于益生菌EVs 的藥劑，用于一些炎癥性疾病的治療［95-96］。羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的EVs 在治療嬰兒腸絞痛、腹瀉和便秘方面具有潛在應(yīng)用［98］。HU 等［42］鑒定出羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的EVs（LrEVs）攜帶葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和絲氨酸蛋白酶等被證明有益的分子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LrEVs 通過(guò)抑制NF-κB 活性抑制了LPS 誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達(dá)，并增強(qiáng)了雞巨噬細(xì)胞中IL-10和TGF-β 的表達(dá)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明LrEVs 在改善肉雞生長(zhǎng)性能、降低死亡率、減少腸道損傷及維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要功效。同樣弗氏丙酸桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌來(lái)源的EVs也具有類(lèi)似的效果，弗氏丙酸桿菌來(lái)源的EVs 也可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB途徑減輕宿主細(xì)胞的炎癥，長(zhǎng)雙歧桿菌來(lái)源的EVs含有黏蛋白可以促進(jìn)益生菌在胃腸道的定植［99-100］。除此之外，植物乳桿菌來(lái)源的EVs 對(duì)腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)有良好的抑制效果，并且顯著降低金槍魚(yú)魚(yú)肉中總揮發(fā)性基氮（TVBN）、過(guò)氧化值（PV）及丙二醛（MDA）的水平，可以作為一種抗菌劑用來(lái)延長(zhǎng)金槍魚(yú)的保質(zhì)期［101］。各種益生菌分泌的EVs 攜帶多種活性物質(zhì)，在新型藥劑開(kāi)發(fā)中具有良好前景。

EVs 周?chē)闹|(zhì)膜為內(nèi)部活性分子提供保護(hù)，使內(nèi)容物免受核酸酶和蛋白酶等降解，具有作為藥物運(yùn)輸載體的潛能。RUBIO 等［102］使用體外腸上皮細(xì)胞模型研究枯草芽孢桿菌EVs 的轉(zhuǎn)胞吞過(guò)程，證明EVs 可以跨胃腸上皮運(yùn)輸，這種機(jī)制使EVs 能夠到達(dá)血液以進(jìn)一步輸送到腸外組織和器官，這也證明將EVs作為藥物遞送載體用于臨床治療具有實(shí)際意義。通過(guò)基因工程等手段將藥物包裝在EVs 中，利用供體細(xì)胞的抗原可以將藥物靶向傳遞至受體細(xì)胞發(fā)揮作用［21］。紫羅蘭素（violacein）是一種對(duì)G+菌有良好抑菌效果的抗生素，但由于其疏水性質(zhì)導(dǎo)致其無(wú)法自由擴(kuò)散至靶細(xì)胞中。G-紫色色桿菌將紫羅蘭素包裝至EVs 中，這使紫羅蘭素在水中的溶解度提高了1 740倍，攜帶紫羅蘭素的EVs對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺傷效果，這說(shuō)明以EVs 為載體，將紫羅蘭素等疏水性藥物運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞是一種高效的藥物傳遞方式［103］。這也可以間接說(shuō)明G+-EVs具有充當(dāng)藥物載體的潛力。

5 展望

綜上所述，G+-EVs 攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等多種物質(zhì)，在生物膜形成、耐藥性、HGT 以及致病菌感染過(guò)程中均扮演了重要角色（圖1）。然而細(xì)菌EVs 的相關(guān)研究目前仍然比較集中在G--EVs，具有厚細(xì)胞壁的G+菌產(chǎn)生的EVs 相關(guān)研究仍然很少，是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。EVs的發(fā)現(xiàn)為G+菌將生物活性成分釋放到細(xì)胞外環(huán)境提供了一種新機(jī)制，也為進(jìn)一步探索細(xì)菌的生理機(jī)制和致病機(jī)制提供了新思路。盡管近年來(lái)研究有所進(jìn)展，但G+-EVs 的許多方面仍然不清楚，如G+-EVs 的產(chǎn)生和分泌過(guò)程，特定分子在EVs 包裝富集的機(jī)制，這些都需要大量的研究去探索。使用基因工程和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)手段研究G+-EVs，進(jìn)一步拓寬對(duì)G+-EVs 的理解，將有助于新型疫苗或藥物的開(kāi)發(fā)。