張磊磊 謝周良 權(quán)曉強 丁付燕

（河南省人民醫(yī)院心臟中心，華中阜外醫(yī)院，鄭州大學(xué)華中阜外醫(yī)院成人心臟外科，鄭州 450003）

急性心肌梗死是全球除癌癥外導(dǎo)致人類死亡的主要原因［1］。急性心肌梗死的標準治療方法是打開阻塞的冠狀動脈及時進行再灌注治療，但該方法會造成心臟的額外損傷，稱為缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷，大大降低了患者的再灌注治療效果［2］。I/R 損傷是一個復(fù)雜的病理過程，再灌注后炎癥因子的異常釋放、心肌細胞的大量凋亡及自由基的大量生成均能進一步加重心臟損傷［3］。研究表明miRNA 在I/R 損傷中發(fā)揮重要作用，其通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路及靶基因表達成為心肌I/R 損傷的潛在治療靶點［4］。最新研究顯示，miR-155-5p參與調(diào)控心肌I/R 損傷［5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin 1，SIRT1）-腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）通路不僅與脂質(zhì)代謝有關(guān)，而且參與調(diào)控心肌I/R 損傷［6-7］。丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TⅡA）是唇形科植物丹參的主要活性物質(zhì)，具有擴展血管、降低血壓、抗血栓等功能，在冠心病、心率過速等心血管疾病中有顯著的治療效果［8］。相關(guān)文獻顯示，TⅡA有助于減輕心肌I/R 損傷，但其具體作用機制尚不完全明確，目前尚未見TⅡA 通過調(diào)節(jié)SIRT1-AMPK通路在心肌I/R 損傷中發(fā)揮作用的報道［9］。本研究擬利用H9c2 心肌細胞構(gòu)建I/R 損傷模型，初步探討TⅡA 對H9c2 心肌細胞I/R 損傷的保護作用及其與miR-155-5p、SIRT1-AMPK 通路的調(diào)控關(guān)系，旨在為心肌I/R 損傷的臨床治療提供新的靶點和實驗依據(jù)，為完善TⅡA 保護心肌細胞I/R 損傷的分子機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 H9c2心肌細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。H9c2 細胞復(fù)蘇后置于添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；TⅡA購自成都儀睿生物科技有限公司；miR-155-5p 模擬物（miR-155-5p mimics）及其陰性對照（miR-NC）購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000 購自美國Thermo Fisher Scientific公司；AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑盒購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技公司；TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17、乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司；SIRT1、AMPK、p-AMPK、β-actin 抗體及對應(yīng)二抗購自美國Abcam 公司。細胞培養(yǎng)箱購自廣州南方生化醫(yī)學(xué)儀器有限公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀購自上海普迪生物技術(shù)有限公司；酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；流式細胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建與分組 對數(shù)生長期的H9c2細胞采用缺氧/復(fù)氧的方法構(gòu)建I/R 損傷模型：首先將H9c2細胞置于不含糖的DMEM 培養(yǎng)基中，于缺氧培養(yǎng)箱（參數(shù)設(shè)置為：37 ℃、1%O2、5%CO2）中持續(xù)培養(yǎng)4 h；然后將細胞更換至高糖的DMEM 培養(yǎng)基中，在正常培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。TⅡA 溶解于DMSO，并調(diào)節(jié)濃度至10 μmol/L。將造模成功的H9c2 細胞隨機分為模型組、TⅡA 組（加入10 μmol/L TⅡA 干預(yù)24 h）、TⅡA+miR-NC 組（細胞轉(zhuǎn)染miR-NC 后加入10 μmol/L TⅡA 干預(yù)24 h）、TⅡA+miR-155-5p mimics 組（細胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics 后加入10 μmol/L TⅡA 干預(yù)24 h），TⅡA 的干預(yù)濃度和時間是在參考文獻［10］的基礎(chǔ)上通過預(yù)實驗所確定，另取常規(guī)培養(yǎng)的H9c2 細胞（添加等量DMSO）作為對照組，miRNA 轉(zhuǎn)染的具體操作按照Lipofectamine 3000說明書嚴格進行。

1.2.2 qRT-PCR 檢測miR-155-5p 表達水平 提取各組處理后的H9c2 細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix 配制PCR 反應(yīng)體系，采用qRT-PCR 儀進行PCR 擴增，實驗結(jié)果以U6為內(nèi)參進行歸一化，并采用2-ΔΔCt法計算miR-155-5p 的相對表達水平。U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-155-5p 正向引物：5'-GTATCCAGTGCGTGTCGTGG-3'，反向引物：5'-GTATCCAGTGCGTGTCGTGG-3'。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 將H9c2細胞接種至96 孔板，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，并按照1.2.1方法進行處理，然后分別加入MTT 試劑10 μl，37 ℃下培養(yǎng)4 h，最后用酶標儀檢測波長為450 nm 時各孔的光密度（OD）值，并計算其細胞活力。細胞活力（%）=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組H9c2細胞制備成細胞懸液，置于圓底管中（細胞密度為1×105個/ml），先加入5 μl Annexin V，反應(yīng)15 min后，再加入5 μl PI，然后使用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況，并用Flow Jo 軟件對數(shù)據(jù)進行定量分析。Annexin V 單獨染色表示細胞發(fā)生早期凋亡，Annexin V/PI雙染表示細胞處于晚期凋亡。凋亡率（%）=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 ELISA 檢測炎癥因子、心肌細胞損傷標志物及氧化應(yīng)激標志物水平 將處理后的各組H9c2 細胞進行離心，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17、心肌細胞損傷標志物LDH 和氧化應(yīng)激標志物MDA、SOD水平。

1.2.6 Western blot 檢測SIRT1、AMPK 蛋白表達分別提取1.2.1中各組H9c2細胞總蛋白，采用SDSPAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，使用5%～8%的脫脂牛奶阻斷印跡1 h，加入SIRT1、AMPK、p-AMPK、β-actin 抗體，4 ℃培養(yǎng)過夜，緩沖液沖洗膜3 次后加入對應(yīng)二抗，2 h 后采用ECL 檢測系統(tǒng)和NIH Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TⅡA 通過miR-155-5p 對H9c2 細胞增殖的影響 與對照組相比，模型組miR-155-5p 表達顯著升高，細胞活力顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，TⅡA組miR-155-5p表達顯著降低，細胞活力顯著升高（P<0.05）；與TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組相比，TⅡA+miR-155-5p mimics組miR-155-5p表達顯著升高，細胞活力顯著降低（P<0.05），見表1。

表1 MTT法檢測各組H9c2細胞活力（±s，n=6）Tab.1 H9c2 cell viability of each group detected by MTT method （±s， n=6）

表1 MTT法檢測各組H9c2細胞活力（±s，n=6）Tab.1 H9c2 cell viability of each group detected by MTT method （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics miR-155-5p Cell viability/%100.00±0.11 67.49±5.231）93.67±8.462）92.58±8.15 52.94±4.283）4）1.00±0.03 1.56±0.211）1.03±0.082）1.05±0.12 2.89±0.433）4）

2.2 TⅡA 通過miR-155-5p 對H9c2 細胞損傷的影響 圖1、表2顯示，模型組細胞凋亡率、LDH活性較對照組明顯升高（P<0.05）；TⅡA 組細胞凋亡率、LDH 活性較模型組明顯降低（P<0.05）；TⅡA+miR-155-5p mimics 組細胞凋亡率、LDH 活性較TⅡA+miR-NC組和TⅡA組明顯升高（P<0.05）。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組H9c2細胞凋亡Fig.1 Apoptosis of H9c2 cells in each group detected by flow cytometry

表2 流式細胞術(shù)和ELISA檢測各組H9c2細胞凋亡和LDH水平（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis and LDH level of H9c2 cells in each group were detected by flow cytometry and ELISA（±s， n=6）

表2 流式細胞術(shù)和ELISA檢測各組H9c2細胞凋亡和LDH水平（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis and LDH level of H9c2 cells in each group were detected by flow cytometry and ELISA（±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

LDH/（U·L-1）352.36±51.42 745.86±72.831）426.51±43.152）431.27±45.24 1 123.42±124.383）4）Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics Apoptosis rate/%4.23±0.11 23.68±3.451）7.35±1.232）8.17±1.46 29.58±2.143）4）

2.3 TⅡA 通過miR-155-5p 對H9c2 細胞炎癥反應(yīng)的影響 與對照組比較，模型組TNF-α和IL-17水平升高，IL-4 和IL-10 水平降低（P<0.05）；與模型組比較，TⅡA 組TNF-α 和IL-17 水平降低，IL-4 和IL-10水平升高（P<0.05）；與TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組比較，TⅡA+miR-155-5p mimics 組TNF-α 和IL-17 水平升高，IL-4和IL-10水平降低（P<0.05），見表3。

表3 ELISA檢測各組H9c2細胞炎癥因子水平（±s，ng/L，n=6）Tab.3 ELISA detection of H9c2 cell inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n=6）

表3 ELISA檢測各組H9c2細胞炎癥因子水平（±s，ng/L，n=6）Tab.3 ELISA detection of H9c2 cell inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

IL-17 11.26±1.12 19.65±0.891）12.14±1.162）12.35±1.23 33.56±2.053）4）Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics TNF-α 22.43±1.05 43.56±2.141）26.35±1.422）27.06±1.53 52.89±2.373）4）IL-4 44.35±2.36 32.51±1.841）43.56±2.412）42.78±2.35 28.47±1.383）4）IL-10 65.49±1.57 56.27±1.251）63.85±1.622）62.58±1.65 49.34±1.133）4）

2.4 TⅡA 通過miR-155-5p 對H9c2 細胞氧化應(yīng)激標志物的影響 模型組MDA含量顯著高于對照組，SOD 活性顯著低于對照組（P<0.05）；TⅡA 組MDA含量明顯低于模型組，SOD 活性明顯高于模型組（P<0.05）；TⅡA+miR-155-5p mimics 組MDA 含量顯著高于TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組，SOD 活性顯著低于TⅡA組和TⅡA+miR-NC組（P<0.05），見表4。

表4 ELISA檢測各組H9c2細胞MDA、SOD水平（±s，n=6）Tab.4 MDA and SOD levels of H9c2 cells in each group detected by ELISA （±s， n=6）

表4 ELISA檢測各組H9c2細胞MDA、SOD水平（±s，n=6）Tab.4 MDA and SOD levels of H9c2 cells in each group detected by ELISA （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics MDA/（mmol·ml-1）SOD/（U·ml-1）137.45±5.78 85.64±3.261）134.58±9.422）133.68±8.79 46.95±9.533）4）5.02±0.13 13.24±3.211）7.16±1.542）7.21±1.65 21.45±2.673）4）

2.5 T ⅡA 通 過miR-155-5p 對H9c2 細 胞SIRT1-AMPK 通路的影響 如圖2所示，模型組SIRT1蛋白表達明顯低于對照組，p-AMPK/AMPK 值明顯小于對照組（P<0.05）；TⅡA 組SIRT1蛋白表達明顯高于模型組，p-AMPK/AMPK 值明顯高于模型組（P<0.05）；TⅡA+miR-155-5p mimics 組SIRT1 蛋白表達明 顯 低 于T ⅡA 組 和T ⅡA+miR-NC 組，p-AMPK/AMPK 值明顯小于TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組（P<0.05）。

3 討論

心肌缺血發(fā)生時，進行再灌注治療有助于減小患者心肌梗死面積并保護心臟功能，但再灌注治療過程中往往會誘發(fā)更嚴重的心肌損傷，進而加速心臟功能惡化［11］。心肌I/R 損傷的調(diào)控機制十分復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心肌細胞凋亡起關(guān)鍵作用。文獻顯示TⅡA 具有抗炎、抗氧化等作用，能夠通過提高SOD 活性、降低IL-1β 表達減輕心肌 I/R損傷［12］。miR-155 參與調(diào)控心血管疾病的進展，研究發(fā)現(xiàn)敲低miR-155 可有效降低大鼠心肌I/R 損傷和H9c2 細胞缺氧/復(fù)氧損傷［13］。此外，近期研究顯示TⅡA 可通過抑制miR-155 表達改善骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。而miR-155-5p 是miR-155 的亞型之一，本研究猜測TⅡA 可能通過調(diào)控miR-155-5p 改善心肌細胞I/R損傷。

本研究構(gòu)建了H9c2 心肌細胞I/R 損傷模型，結(jié)果顯示，模型組miR-155-5p 表達顯著升高，細胞活性顯著降低；TⅡA 處理后細胞活性顯著升高；在TⅡA 組的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics 上調(diào)miR-155-5p 表達后，細胞活力明顯下降，提示TⅡA 可能通過抑制miR-155-5p 提高H9c2 心肌細胞活力。心肌細胞異常凋亡是導(dǎo)致心肌I/R 損傷的主要原因之一，研究表明在心肌I/R 損傷大鼠模型中細胞凋亡率明顯升高［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組細胞凋亡率明顯升高；TⅡA可降低細胞凋亡率，而上調(diào)miR-155-5p使TⅡA 處理后的細胞凋亡率再次升高，說明TⅡA可能通過抑制miR-155-5p 降低H9c2 心肌細胞凋亡。

減輕炎癥反應(yīng)、抑制機體的氧化應(yīng)激是治療I/R損傷的關(guān)鍵。TNF-α 的大量積累會誘發(fā)IL-17 等促炎因子表達，從而加劇炎癥反應(yīng)，促進細胞凋亡［16］。IL-4、IL-10 是細胞中的抗炎因子，其含量增加對心肌損傷有改善作用［17］。LDH 在機體細胞中廣泛存在，與細胞的氧化還原反應(yīng)有關(guān)，可作為標志物評估心肌細胞損傷［18-19］。在心肌發(fā)生I/R 損傷時會產(chǎn)生大量自由基，自由基發(fā)生過氧化反應(yīng)最終會生成MDA，因此MDA 水平的檢測有助于評定細胞的氧化損傷程度；而SOD 可清除細胞中的氧自由基，從而使細胞發(fā)揮正常生理功能［20］。本研究結(jié)果顯示，TⅡA 處理可減輕H9c2細胞的炎癥因子和氧化應(yīng)激標志物水平，miR-155-5p mimics 的加入使TⅡA 處理后的相關(guān)因子水平得到逆轉(zhuǎn)，提示TⅡA 能夠有效降低H9c2心肌細胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，其機制與下調(diào)miR-155-5p表達有關(guān)。

據(jù)報道，SIRT1-AMPK 通路不僅與心血管疾病、糖尿病、肝損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還與氧化應(yīng)激進程及能量代謝相關(guān)［7，21-23］。SIRT1活化后可激活LKB1，而LKB1 表達上調(diào)能夠提高AMPK 的磷酸化水平，從而抑制心肌梗死誘導(dǎo)的心肌凋亡和心肌能量代謝紊亂［23］。WANG 等［24］研究發(fā)現(xiàn)山楂酸通過激活SIRT1/AMPK 信號通路改善I/R 損傷大鼠的心臟功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p 負調(diào)控SIRT1 表達，且miR-155-5p 通過抑制SIRT1 信號通路促進梗阻性腎病腎間質(zhì)纖維化［25］?；诖耍狙芯客茰y上調(diào)miR-155-5p 對H9c2 心肌細胞I/R 損傷的促進作用與SIRT1-AMPK 通路有關(guān)。本研究通過Western blot 分析發(fā)現(xiàn)，TⅡA 處理可使模型組細胞中SIRT1 蛋白表達及AMPK 磷酸化水平（p-AMPK/AMPK）顯著升高；miR-155-5p mimics 的干預(yù)則逆轉(zhuǎn)了TⅡA 對SIRT1 蛋白表達及AMPK 磷酸化水平的影響，提示TⅡA 可能通過下調(diào)miR-155-5p 激活SIRT1-AMPK通路，緩解H9c2心肌細胞的I/R損傷。

綜上所述，TⅡA可通過抑制miR-155-5p表達改善H9c2 心肌細胞I/R 損傷，這可能與激活SIRT1-AMPK 通路有關(guān)，為心肌I/R 損傷的機制研究和臨床治療提供了新的實驗依據(jù)。