吳中杰，謝連科，王晶輝，黃仁亮

（1 國(guó)網(wǎng)山東省電力公司電力科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250002；2 天津大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

隨著酚類物質(zhì)在木材防腐、農(nóng)藥、消毒劑等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，酚類化合物已成為土壤和地下水中常見(jiàn)的有機(jī)污染物[1]。因其具有致癌、生殖毒性、神經(jīng)毒性等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康及生態(tài)環(huán)境[2]。濕式過(guò)氧化氫催化氧化法是目前較為行之有效的酚類有機(jī)廢水處理方法[3?4]。其中，濕式過(guò)氧化氫氧化反應(yīng)催化劑——羥基硝酸銅[Cu2(OH)3NO3]的主要合成方法有Cu(NO3)2與NaOH 溶液反應(yīng)沉淀法[5]、Cu(NO3)2與尿素水解法[6]、Cu(NO3)2溶液與CuO 反應(yīng)法[3]、Cu(NO3)2溶液水熱法[7]等。但是，過(guò)氧化氫等氧化劑的加入不僅提高了有機(jī)廢水處理成本，更對(duì)環(huán)境造成了不可控的影響。因此，開(kāi)發(fā)以空氣為氧化劑的污染物降解催化劑是未來(lái)高級(jí)氧化工藝的重點(diǎn)研究方向。

漆酶作為一種多銅氧化酶，可以實(shí)現(xiàn)多胺、多酚類有機(jī)物的單電子氧化與氧氣的四電子還原[8?9]。因此，漆酶是一種可用于水處理及土壤修復(fù)領(lǐng)域的綠色催化劑[10]。然而，漆酶具有催化穩(wěn)定性差、重復(fù)利用性低、成本高等缺點(diǎn)，限制了其環(huán)境催化應(yīng)用。為提高漆酶的重復(fù)利用性，科研人員開(kāi)發(fā)出多種漆酶固定化技術(shù)[11?13]。雖然酶固定化大大提高了漆酶的重復(fù)利用性，但是由于蛋白質(zhì)在復(fù)雜環(huán)境下的穩(wěn)定性較差，天然酶的催化穩(wěn)定性仍是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

納米酶是一種具有酶催化活性的納米材料，因其具有多功能性、低成本、高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)引起廣泛關(guān)注[14]。基于多種納米材料及其衍生物的納米酶被相繼研究報(bào)道，如貴金屬[15]、金屬氧化物[16]和碳基納米材料[17]等，并被用于病毒檢測(cè)[18]、重金屬離子檢測(cè)[19]、有機(jī)磷化學(xué)試劑降解[20]和滅菌[21]等領(lǐng)域。相比天然酶，納米酶體現(xiàn)出更好的催化穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。

本文以尿素水解過(guò)程中產(chǎn)生的異氰酸根離子為模板劑，與Cu(NO3)2溶液反應(yīng)制備具有漆酶活性的多級(jí)結(jié)構(gòu)羥基硝酸銅[H?Cu2(OH)3NO3]納米酶（圖1）。相比傳統(tǒng)Cu(NO3)2與尿素水解法制備的羥基硝酸銅，其比表面積更大，催化活性更高。通過(guò)TEM（透射電子顯微鏡）、SEM（掃描電子顯微鏡）、FTIR（傅里葉變換紅外光譜）、XPS（X 射線光電子能譜）和XRD（X射線衍射）等表征手段，對(duì)其表面結(jié)構(gòu)及內(nèi)部組成進(jìn)行研究；通過(guò)漆酶特征反應(yīng)，考察H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性、穩(wěn)定性、重復(fù)利用性；并考察其氧化降解實(shí)際污染物（2,4?二氯苯酚和對(duì)苯二酚）的催化效率。此外，通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)與理論分析，研究H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機(jī)理。

圖1 多級(jí)結(jié)構(gòu)羥基硝酸銅[H?Cu2(OH)3NO3]納米酶的合成示意圖

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

尿素和Cu(NO3)2·3H2O，天津元立化工有限公司；2,4?二氯苯酚（2,4?DP）、4?氨基安替吡啉（4?AP）、2?嗎啉乙磺酸（MES）、對(duì)苯二酚，上海阿拉丁生化科技有限公司；漆酶（laccase），Sigma?Aldrich。上述試劑均為分析純，直接用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的合成方法

6g 尿素溶于50mL 水中，轉(zhuǎn)移至三頸瓶中，100℃油浴下劇烈攪拌6h。1.32g Cu(NO3)2·3H2O 溶于50mL 水中，逐滴加入尿素溶液中，攪拌10min后，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至燒杯中，常溫下攪拌20min后，離心水洗，乙醇洗，60℃干燥。

1.3 表征方法

掃描電子顯微鏡圖像（SEM）由場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM，Regulus 8100，日立高科技公司）在4kV加速電壓下拍攝。在掃描電鏡觀察之前，所有樣品均使用E1045鉑涂層機(jī)（日立高科技公司）濺射鉑涂層。透射電子顯微鏡圖像（TEM）由場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（JEM?2100F，日本電子） 在200kV加速電壓下拍攝。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Agilent Cary 3500，美國(guó)）測(cè)量紫外光譜數(shù)據(jù)。通過(guò)X 射線衍射儀（Bruker，德國(guó)）測(cè)量X 射線衍射（XRD）數(shù)據(jù)，以5°/min從10°掃描到80°。通過(guò)裝備了單色Al靶源（hν=1486.6eV）的XPS分光儀（Kratos Axis Supra）測(cè)量X射線光電子譜（XPS）。

1.4 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化活性

通過(guò)酚類物質(zhì)與4?氨基安替吡啉（4?AP）發(fā)生的顯色反應(yīng)，考察H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化活性。具體而言，2,4?二氯苯酚（2,4?DP）的水溶液（1mg/mL,100μL）、4?氨基安替吡啉（4?AP）的水溶液（1mg/mL,100μL）和2?嗎啉乙磺酸（MES）緩沖溶液（30mmol/L，pH=6.8,700μL）混合，隨后向上述混合溶液中分別加入H?Cu2(OH)3NO3納米酶的水分散液和漆酶的水溶液（均為1mg/mL,100μL），在25℃下反應(yīng)1h 后，將反應(yīng)混合液離心（12000r/min, 3min）分離出納米酶催化劑，測(cè)試上清液在510nm下的吸光度。

1.5 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)

不 同 濃 度（10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL 和100μg/mL）的2,4?二氯苯酚與0.15mg/mL的4?氨基安替吡啉（在所有測(cè)試中均保持過(guò)量）在0.1mg/mL H?Cu2(OH)3NO3納米酶或漆酶催化下反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)初始速率。采用米氏方程[式(1)]計(jì)算得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Km和vmax）。

式中，v為表觀初始反應(yīng)速率；Km為米氏常數(shù)；vmax為初始最大反應(yīng)速率；[S]為底物濃度。

1.6 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化穩(wěn)定性和重復(fù)利用性

（1）酸堿穩(wěn)定性測(cè)試方法 H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶分別在不同pH（3～13）的緩沖溶液中孵化7h，之后再考察其催化活性。相對(duì)活性是分別參照H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶在pH=7 時(shí)的催化活性。

（2）溫度穩(wěn)定性測(cè)試方法 H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的水分散液分別置于30～90℃、45min條件下分離出來(lái)測(cè)試催化活性。以H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶在30℃下的催化活性作為參照。

（3）時(shí)間穩(wěn)定性測(cè)試方法 H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶在常溫下分散于水中，每三天測(cè)一次催化活性。

（4）鹽溶液穩(wěn)定性測(cè)試方法 向上述2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉的催化反應(yīng)體系中加入不同質(zhì)量的NaCl，使NaCl 終濃度為0mmol/L、150mmol/L、300mmol/L 和500mmol/L，考察其反應(yīng)1h后的上清液在510nm下的吸光度。

（5）有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測(cè)試方法 向上述2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉的催化反應(yīng)體系中加入不同量的乙醇（體積分?jǐn)?shù)分別為0、25%、50%、70% 和100%），考察其反應(yīng)1h 后的上清液在510nm下的吸光度。

以上所有催化活性測(cè)試方法均采用2,4?二氯苯酚與4?氨基安替吡啉在室溫下反應(yīng)1h 后，測(cè)試其上清液在510nm下的吸光度。

（6）H?Cu2(OH)3NO3納米酶重復(fù)利用性考察方法 2,4?二氯苯酚水溶液（1mg/mL, 100μL）、4?氨基安替吡啉水溶液（1mg/mL, 100μL）、MES緩沖溶液（30mmol/L, pH=6.8, 700μL）、H?Cu2(OH)3NO3納米酶分散液（1mg/mL, 100μL）在常溫下混合反應(yīng)1h后，離心分離（12000r/min, 3min）水洗，進(jìn)行下一次催化循環(huán)。

1.7 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶催化降解酚類污染物

2,4?二氯苯酚（1mg/mL, 200μL）水溶液和對(duì)苯二酚水溶液（1mg/mL, 200μL）分別與MES 緩沖溶 液（30mmol/L, pH=6.8, 1400μL）、 去 離 子 水（200μL）、H?Cu2(OH)3NO3水分散液或漆酶溶液（1mg/mL, 200μL）混合。隨后以10mL/min 的速率向反應(yīng)體系中通入氧氣，降解2,4?二氯苯酚與對(duì)苯二酚。每次取50μL 離心（12000r/min, 3min）后，采用高效液相色譜分析降解效率。

采用配備紫外檢測(cè)器（SPD?20A, Japan）的高效液相色譜（Shimadzu, Japan）檢測(cè)2,4?二氯苯酚和對(duì)苯二酚濃度。液相色譜檢測(cè)方法為C18色譜柱（Zorbax SB?C18, 250mm×4.6mm，i.d. 5μm, Agilent,USA），流動(dòng)相為甲醇∶水（7∶3，體積比），流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm，柱溫箱為40℃，進(jìn)樣前，樣品通過(guò)0.22μm 濾膜去除不溶物。

2 結(jié)果與討論

2.1 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的結(jié)構(gòu)表征

H?Cu2(OH)3NO3是一種長(zhǎng)條狀納米片（一級(jí)結(jié)構(gòu)）[圖2(a)]，這種長(zhǎng)條狀結(jié)構(gòu)可以組裝在一起形成納米團(tuán)簇狀的宏觀結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)）[圖2(b)]。該多級(jí)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

圖2 H?Cu2(OH)3NO3的TEM圖和SEM圖

為進(jìn)一步研究H?Cu2(OH)3NO3中的化學(xué)鍵，H?Cu2(OH)3NO3的FTIR 紅 外 光 譜 如 圖3(a)所 示。H?Cu2(OH)3NO3在3532cm-1處的伸縮振動(dòng)表明OH?的存在；在1415cm-1、1385cm-1、1342cm-1處的三重峰為Cu2(OH)3NO3的特征峰，且與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[6,22]；在2198cm-1處的峰表明存在異氰酸根，與傳統(tǒng)尿素法合成的Cu2(OH)3NO3材料[6]不同。因?yàn)槟蛩胤纸猱a(chǎn)生氨氣和異氰酸，異氰酸在酸性和中性條件下分解為CO2，在堿性條件下生成異氰酸根[6]。傳統(tǒng)尿素合成法將尿素與硝酸銅混合后加熱，制備片層狀的Cu2(OH)3NO3，因?yàn)橄跛徙~的加入會(huì)使體系處于中性，所以異氰酸分解為CO2。而本文先使尿素在100℃下分解6h，產(chǎn)生的氨氣溶于水，體系為堿性，從而使異氰酸充分分解為異氰酸根，隨后逐滴加入硝酸銅制備多級(jí)結(jié)構(gòu)的H?Cu2(OH)3NO3。綜上所述，推測(cè)異氰酸根的存在促進(jìn)了多級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。證明尿素分解模板法與傳統(tǒng)尿素法的最大區(qū)別在于充分利用模板劑異氰酸根的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用。

H?Cu2(OH)3NO3的XRD 如 圖3(b)所 示，與Cu2(OH)3NO3的標(biāo)準(zhǔn)XRD 卡片完全對(duì)應(yīng)，證明H?Cu2(OH)3NO3的成功合成。

XPS用于分析H?Cu2(OH)3NO3中Cu元素的價(jià)態(tài)及元素分布。精細(xì)XPS 能譜數(shù)據(jù)如圖3(c)所示，933.6eV 和953.4eV 的峰分別屬于Cu2+的Cu 2p3/2和Cu 2p1/2電子。結(jié)合能較低的931.7eV（2p3/2）和951.4eV（2p1/2）證明存在Cu+或Cu0。為進(jìn)一步分析H?Cu2(OH)3NO3中Cu 元素價(jià)態(tài)，Cu LMM 俄歇譜如圖3(d)所示，574.6eV 的峰表明存在Cu+；569.2eV的峰表明存在Cu2+，且Cu+約占13.4%，Cu2+約占86.6%。

圖3 H?Cu2(OH)3NO3的結(jié)構(gòu)表征

2.2 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性

采用文獻(xiàn)[23]報(bào)道的酚類化合物與4?氨基安替吡啉（4?AP）發(fā)生顯色反應(yīng)來(lái)考察H?Cu2(OH)3NO3和漆酶的催化活性。2,4?二氯苯酚（2,4?DP）在反應(yīng)中被氧化，4?氨基安替吡啉與其氧化產(chǎn)物結(jié)合形成紅色的產(chǎn)物，相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如圖4(a)所示。H?Cu2(OH)3NO3在不同pH 下的催化活性，如圖4(b)所示。在pH=6 和6.8 時(shí)，H?Cu2(OH)3NO3具有較高的催化活性。因此，選擇在接近中性（pH=6.8）的條件下考察其催化活性。

為考察多級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)Cu2(OH)3NO3催化性能的影響，在相同質(zhì)量濃度下測(cè)定H?Cu2(OH)3NO3和傳統(tǒng)尿素法合成的Cu2(OH)3NO3催化2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉顯色反應(yīng)的吸光度。結(jié)果表明，H?Cu2(OH)3NO3催化反應(yīng)的吸光度是傳統(tǒng)Cu2(OH)3NO3催化反應(yīng)吸光度的1.85倍[圖4(c)]，證明H?Cu2(OH)3NO3的多級(jí)結(jié)構(gòu)增大了比表面積，暴露出更多的活性位點(diǎn)，從而顯著增強(qiáng)其催化活性。

圖4 H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性

通過(guò)調(diào)整底物濃度測(cè)定H?Cu2(OH)3NO3和漆酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，研究H?Cu2(OH)3NO3的催化動(dòng)力學(xué)特性（圖5）。并通過(guò)米氏方程得到Km和vmax，如表1 所示。相比漆酶，H?Cu2(OH)3NO3具有更高的vmax值，說(shuō)明其具有更高的反應(yīng)速率。但是其Km值較大，說(shuō)明H?Cu2(OH)3NO3的底物親和力低于漆酶。這可能與其剛性結(jié)構(gòu)對(duì)底物的親和力弱于漆酶動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)底物的誘導(dǎo)契合效應(yīng)有關(guān)。

圖5 H?Cu2(OH)3NO3和漆酶室溫下催化2,4?二氯苯酚（2,4?DP）和4?氨基安替吡啉反應(yīng)的Lineweaver?Burk圖

表1 常溫下H-Cu2(OH)3NO3和漆酶催化2,4-二氯苯酚和4-氨基安替吡啉反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

2.3 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的催化穩(wěn)定性和重復(fù)利用性

在酶催化劑的實(shí)際應(yīng)用中，穩(wěn)定性和重復(fù)利用性同樣至關(guān)重要。因此，研究H?Cu2(OH)3NO3納米酶在不同pH、溫度、儲(chǔ)存時(shí)間、離子強(qiáng)度、乙醇溶劑中催化2,4?二氯苯酚與4?氨基安替吡啉顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。

H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶分別在不同pH（3～13）的緩沖溶液中孵化7h 后，測(cè)試其在pH 為6.8的MES緩沖溶液中催化2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉反應(yīng)的活性，數(shù)據(jù)如圖6(a)所示。酸性和堿性條件對(duì)漆酶的穩(wěn)定性均有顯著影響，而H?Cu2(OH)3NO3在pH=5～10 的范圍內(nèi)體現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，當(dāng)pH<5時(shí)，H?Cu2(OH)3NO3會(huì)溶解于酸性溶液中；當(dāng)pH>10 時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镃u(OH)2，從而造成催化活性的急劇降低。

H?Cu2(OH)3NO3納米酶的溫度穩(wěn)定性如圖6(b)所示。在30～90℃的溫度下儲(chǔ)存45min 后，漆酶的催化活性從50℃開(kāi)始逐漸降低，在80℃下完全失活。而H?Cu2(OH)3NO3納米酶也是從50℃開(kāi)始逐漸降低，在90℃的極端條件下仍能保持50%以上的催化活性。說(shuō)明相比漆酶，H?Cu2(OH)3NO3具有更好的溫度穩(wěn)定性。

如圖6(c)所示，漆酶催化活性隨其在水中儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，12d 后完全失活。但是，H?Cu2(OH)3NO3納米酶在水中常溫儲(chǔ)存18d 后仍保持65.2%的催化活性。表明H?Cu2(OH)3NO3納米酶在水中表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

圖6 相同質(zhì)量濃度下H?Cu2(OH)3NO3和漆酶在不同pH、溫度、儲(chǔ)存時(shí)間、NaCl濃度、乙醇等條件下的催化穩(wěn)定性及H?Cu2(OH)3NO3的重復(fù)利用性

如圖6(d)所示，隨著NaCl濃度增大，漆酶的催化活性急劇降低；而H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性反而提高到原來(lái)的190%，可能是由于NaCl的存在促進(jìn)了底物2,4?二氯苯酚在H?Cu2(OH)3NO3納米酶表面的吸附，從而極大地提高了催化活性。

為研究有機(jī)溶劑對(duì)催化活性的影響，將不同含量（0、25%、50%、70%和100%，體積分?jǐn)?shù)）的乙醇與反應(yīng)物溶液混合。如圖6(e)所示，隨著乙醇含量的增大，H?Cu2(OH)3NO3納米酶與漆酶的催化活性都在逐漸降低。當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，H?Cu2(OH)3NO3和漆酶均完全失活，向反應(yīng)體系中通入氧氣，也未觀察到催化活性，表明乙醇溶液的存在會(huì)阻礙反應(yīng)的進(jìn)行。

為考察H?Cu2(OH)3NO3納米酶的重復(fù)利用性，將2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉與H?Cu2(OH)3NO3納米酶在MES 緩沖溶液中反應(yīng)1h 后，離心分離，水洗后進(jìn)入下一個(gè)反應(yīng)循環(huán)。如圖6(f)所示，H?Cu2(OH)3NO3納米酶在經(jīng)歷了12 次催化循環(huán)后，仍保持58%的催化活性。因此，H?Cu2(OH)3NO3納米酶在不同pH、溫度、儲(chǔ)存時(shí)間、離子強(qiáng)度、乙醇溶劑中均體現(xiàn)出優(yōu)于漆酶的催化穩(wěn)定性和良好的重復(fù)利用性。

2.4 H-Cu2(OH)3NO3納米酶催化降解酚類污染物

為了進(jìn)一步研究H?Cu2(OH)3NO3納米酶對(duì)酚類污染物的降解能力，分別選擇2,4?二氯苯酚和對(duì)苯二酚作為氯酚和雙酚的模式底物。如圖7(a)所示，相比漆酶，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對(duì)2,4?二氯苯酚體現(xiàn)更高的降解活性。如圖7(b)所示，H?Cu2(OH)3NO3納米酶降解對(duì)苯二酚的最終反應(yīng)效率（42%）高于漆酶（31.5%）。但是，漆酶氧化對(duì)苯二酚的初始反應(yīng)速率更快，這可能與漆酶具有更大的底物親和力有關(guān)。此外，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對(duì)土壤與地下水中常見(jiàn)的2,6?二甲氧基苯酚和鄰氨基苯酚污染物的降解效率如圖8所示。在215min時(shí)，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對(duì)2,6?二甲氧基苯酚污染物的降解效率為87.8%，高于漆酶的降解效率[58.5%，圖8(a)]。反應(yīng)7.7h 后，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對(duì)鄰氨基苯酚污染物的降解效率為69.6%，高于漆酶的降解效率[55.9%，圖8(b)]。因此，H?Cu2(OH)3NO3納米酶具有降解土壤與地下水中酚類污染物的能力，且其降解效率接近甚至優(yōu)于漆酶。

圖7 H?Cu2(OH)3NO3與漆酶催化降解2,4?二氯苯酚和對(duì)苯二酚的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率

圖8 H?Cu2(OH)3NO3與漆酶催化降解2,6?二甲氧基苯酚和鄰氨基苯酚的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率

2.5 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機(jī)理

Solomon 等[24?25]深入研究了漆酶等多酚氧化酶的催化機(jī)理。具體而言，多酚氧化酶CuⅡ耦合的雙核活性中心先與酚類底物結(jié)合，氧化底物，生成醌類物質(zhì)，CuⅡ得到電子轉(zhuǎn)變?yōu)镃uⅠ耦合的雙核中心；隨后，氧氣分子與CuⅠ耦合的雙核中心結(jié)合，形成含氧配體的雙CuⅠ耦合結(jié)構(gòu)；最后，氧氣得到CuⅠ的電子還原為水，CuⅠ被氧化為CuⅡ，實(shí)現(xiàn)酶催化循環(huán)。

受此催化機(jī)理的啟發(fā)，本文提出了H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機(jī)理。如圖9所示，主要包括：① 酚類底物的結(jié)合；② 底物在雙CuⅡ耦合活性中心的氧化，伴隨CuⅡ被還原為CuⅠ；③ 氧氣分子與雙CuⅠ耦合中心結(jié)合，形成含氧配體的雙CuⅠ耦合結(jié)構(gòu)；④ 氧氣得到CuⅠ的電子還原為水，伴隨CuⅠ被氧化為CuⅡ，實(shí)現(xiàn)H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化循環(huán)。為了使催化機(jī)理簡(jiǎn)明易懂，H?Cu2(OH)3NO3納米酶的活性中心簡(jiǎn)化為O?Cu配位結(jié)構(gòu)。

圖9 H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機(jī)理示意圖

3 結(jié)論

本文以尿素分解產(chǎn)生的異氰酸根為模板劑成功制備了具有漆酶催化活性的多級(jí)結(jié)構(gòu)H?Cu2(OH)3NO3納米酶，并用于酚類污染物的氧化降解。主要結(jié)論如下。

（1）H?Cu2(OH)3NO3納米團(tuán)簇（1～2μm）由長(zhǎng)條狀納米片（500～900nm）構(gòu)成，其多級(jí)結(jié)構(gòu)主要與模板劑異氰酸根有關(guān)。

（2）H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性是傳統(tǒng)規(guī)整結(jié)構(gòu)Cu2(OH)3NO3的1.85 倍，其最大反應(yīng)速率是漆酶的1.27倍。在pH=5～10的體系中孵化7h后，仍能保持90%以上的催化活性。在90℃的條件下保存45min 或在水溶液中儲(chǔ)存18d 后仍能保持50%～66%的催化活性。重復(fù)利用12 次后，保持58%的催化活性。因此，H?Cu2(OH)3NO3納米酶具有良好的催化穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。

（3）H?Cu2(OH)3NO3納米酶具有降解土壤與地下水中常見(jiàn)的2,4?二氯苯酚、對(duì)苯二酚、2,6?二甲氧基苯酚和鄰氨基苯酚等酚類污染物的能力，且其降解效率接近甚至優(yōu)于漆酶。