王川東，張君奇，劉丁源，馬媛媛，李鋒，宋浩

（1 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2 天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心和系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；3 天津大學(xué)（青島）海洋工程研究院有限公司，山東 青島 266237；4 天津大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，常見于農(nóng)作物秸稈、雜草、木材廢料及其他固體廢棄物中，是儲量豐富、廉價易得的可再生資源[1?2]。植物光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)大部分為木質(zhì)纖維素類，其資源化開發(fā)有“不與人爭糧，不與糧爭地”的優(yōu)勢，可用于工業(yè)生產(chǎn)醇類、微生物油脂和有機酸等化學(xué)品。與纖維素水解生成的葡萄糖相比，半纖維素水解產(chǎn)生的木糖更難被微生物利用，例如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能很容易地利用纖維素水解生成的葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇，但難以利用木糖[3?4]，這極大地限制了木質(zhì)纖維素資源的利用。因此，構(gòu)建木糖?葡萄糖共利用工程菌株是解決該問題的有效方法之一。相比原核生物，真核生物戊糖代謝途徑涉及復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)，需要更多的酶及輔因子參與，使得在酵母中構(gòu)建高效戊糖代謝途徑難度較大[5]。因此，木糖及葡萄糖共利用宿主菌的開發(fā)有待進一步進行。目前，除酵母外，木糖?葡萄糖共利用菌株的開發(fā)已經(jīng)在酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、大腸桿菌（Escherichia coli）等多種微生物中被報道[6?8]。本文主要綜述了近年來木糖及葡萄糖共利用工程菌株的構(gòu)建策略及在醇類、微生物油脂、γ?聚谷氨酸和有機酸合成領(lǐng)域的進展，總結(jié)了限制木糖?葡萄糖共利用效率的主要瓶頸及其解決方法，為提高木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源化利用和可再生能源化學(xué)品的產(chǎn)業(yè)化合成提供參考。

1 天然微生物木糖及葡萄糖共利用現(xiàn)狀

自研究發(fā)現(xiàn)細菌、酵母菌能發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇以來，現(xiàn)已知有兩百多種微生物可以代謝木糖，包括酵母菌、新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）、假單孢桿菌（Pseudomonas）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及大腸桿菌等。其中既能利用木糖又能利用葡萄糖的酵母菌是研究重點，主要包括樹干畢赤酵母（Schefersomyces stipites）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、馬爾薩尼克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）及絲狀假絲酵母（Candida lusitaniae）等[9?12]。

天然微生物的底物偏好性會影響木糖?葡萄糖共利用發(fā)酵性能。Saravanan等[13]對比了漢遜達布氏酵母 （Dabaryomyces hansenii var hansenii）、吉利蒙假絲酵母（Candida guillermondii）和嗜鞣管囊酵母（P.tannophilus）以玉米芯、稻草和小麥秸稈為原料生產(chǎn)木糖醇的動力學(xué)過程。利用Logistic 細胞生長模型、底物利用動力學(xué)模型及Luedeking?Piret產(chǎn)物生成模型分析，發(fā)現(xiàn)P.tannophilus發(fā)酵玉米芯水解液時，木糖醇產(chǎn)量更高，說明木糖醇產(chǎn)量受底物利用效率影響。不同來源的木質(zhì)纖維素水解液中糖含量的差異是影響底物利用效率的關(guān)鍵，湯斌等[14]發(fā)現(xiàn)C.shehataeTZ8?13 利用木糖及葡萄糖共發(fā)酵產(chǎn)乙醇時，葡萄糖被優(yōu)先利用，且木糖和葡萄糖質(zhì)量比為1∶1時乙醇產(chǎn)量較高。Agbogbo 等[15]發(fā)現(xiàn)樹干畢赤酵母（S.stipites）的葡萄糖利用也優(yōu)先于木糖，并且葡萄糖大部分供給細胞生長，木糖則主要用于產(chǎn)物合成。該研究表明，水解液中混糖比例的不同會影響底物利用效率及乙醇產(chǎn)量，因此水解液的高效利用需要底物適應(yīng)能力更強的菌株。

研究表明，S.stipites不僅可以代謝木糖和葡萄糖，還能代謝甘露糖、半乳糖、纖維二糖、甘露聚糖及木聚糖低聚物等[16?19]，工業(yè)應(yīng)用價值較高。但是，S.stipites對乙醇、弱酸及糠醛等抑制劑耐受度低，限制了其發(fā)酵性能，采取適當(dāng)?shù)脑项A(yù)處理和脫毒方法有助于促進水解液糖化和去除抑制劑[20?21]。例如，利用稀硫酸處理糖化后的玉米秸稈水解液，補加氫氧化銨中和水解液中的酸后，使得乙醇轉(zhuǎn)化率從0.32g/g 提高至0.44g/g（乙醇/木糖和葡萄糖）[22]。但是，能高效共利用木糖及葡萄糖發(fā)酵制備化學(xué)品的天然菌株較少，且普遍存在底物偏好性強、碳分解代謝物阻遏（carbon catabolite repression, CCR）、產(chǎn)量低等問題[14?15,18]，因此，構(gòu)建底物譜更廣、混合糖利用率更高的木糖?葡萄糖共利用工程菌株是產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的必然要求。

2 木糖及葡萄糖代謝途徑簡介

2.1 木糖代謝途徑

研究發(fā)現(xiàn)，具備木糖代謝能力的微生物體內(nèi)一般有4種木糖代謝途徑，包括木糖氧化還原酶途徑（XR 途徑）、異構(gòu)酶途徑（XI 途徑）、Weimberg 途徑（WBG途徑）和Dahms途徑[23?26]，見圖1。此外，近期在E. coli中建立了木糖?1?磷酸酯（X?1?P）及核糖?1?磷酸酯（R?1?P）途徑，實現(xiàn)了二碳化合物的合成。其中，原核和真核生物中木糖利用能力較強的菌株E.coli[27]和S.stipites[18]分別借助XI 和XR途徑代謝木糖。在XI途徑中，木糖首先被XylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶（xylose isomerase, XI）轉(zhuǎn)化為木酮糖，隨后被XylB編碼的木酮糖激酶（xylulokinase, XK）磷酸化，產(chǎn)生5?磷酸木酮糖進入磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP）[23]。

類似于XI 途徑，在XR 途徑中，木糖先被NAD(P)H 依賴的木糖還原酶（xylose reductase, XR,Xyl1基因編碼）轉(zhuǎn)化為木糖醇，進一步在木糖醇脫氫酶（xylose dehydrogenase, XDH,Xyl2 基因編碼）作用下轉(zhuǎn)化為木酮糖，后被XK（Xks1 基因編碼）催化生成5?磷酸木酮糖，進入PPP，見圖1。XR及XI 途徑是構(gòu)建木糖利用工程菌株的常用途徑。例如，Sekar 等[28]利用定向進化激活了電活性微生物希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）的木糖代謝能力。Li 等[29]采用合成生物學(xué)策略，在希瓦氏菌（S.oneidensis）中異源過表達XR 及XI 途徑相關(guān)基因，獲得了能夠利用木糖為碳源生長產(chǎn)電的工程希瓦氏菌株，克服了S.oneidensis不能利用五碳糖的限制。

圖1 木糖及葡萄糖共利用代謝途徑與發(fā)酵產(chǎn)品

相比于前兩種代謝途徑，來自于新月柄桿菌（C.crescentus）的WBG途徑各反應(yīng)步驟有較大的熱力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能負向差值（表1），使得各步反應(yīng)更容易自發(fā)進行；且終產(chǎn)物為α?酮戊二酸（AKG），可以繞過PPP 直接進入三羧酸循環(huán)（TCA），代謝流程相對較短；此外，該途徑不產(chǎn)生二氧化碳，沒有碳損失[30?32]。WBG 途徑中D?木糖經(jīng)五步酶促反應(yīng)被氧化成AKG（圖1），D?木糖首先在木糖脫氫酶（CcXylB基因編碼）的作用下被氧化成D?木糖?γ?內(nèi)酯，然后在基因XylC編碼的D?木糖?γ?內(nèi)酯酶（xylonolactonase, XLA）催化下轉(zhuǎn)化為中間體D?木糖酸鹽，進而在D?木糖酸脫水酶（D?xylonate dehydratase, XAD,XylD基因編碼）和2?酮?3?脫氧?D?木糖酸脫水酶（KDX dehydratase,KDXD,XylX基因編碼）參與下進行兩次脫水反應(yīng)，產(chǎn)生2?酮?3?脫氧?D?木糖酸（2?keto?3?deoxy?D?xylonate, KDX），之后生成α?酮戊二酸半醛（α?ketoglutarate semialdehyde, KGSA）。最后，被α?酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSA dehydrogenase, KGSADH,CcXylA基因編碼）以NAD(P)+依賴的方式氧化成AKG，進入TCA[25,30?32]。因此，碳流進入細胞中樞代謝的節(jié)點不同于XI 和XR 途徑。目前，在枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、E.coli、惡臭假單孢桿菌（Pseudomonas putida）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等宿主菌中構(gòu)建該途徑，獲得了D?1, 2, 4?丁三醇（BT）、γ?聚谷氨酸（γ?PGA）、綠膿菌素、鼠李糖脂、乙醇酸鹽、木糖酸鹽、AKG、L?鳥氨酸等產(chǎn)品[31?37]。

表1 Weimberg途徑標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變化[30]

發(fā)現(xiàn)于Pseudomonas的Dahms途徑與WBG途徑前半部分相同，不同的是反應(yīng)進行到KDX 之后轉(zhuǎn)化為乙醇醛和丙酮酸，見圖1。

X?1?P 和R?1?P 途徑能在一定程度上繞過復(fù)雜的內(nèi)源PPP，直接裂解木糖[38?39]，具有合成二碳化合物的天然優(yōu)勢[40?41]。兩條途徑中木糖均先被異構(gòu)化為木酮糖，X?1?P途徑中木酮糖被磷酸化為木酮糖?1?磷酸，之后經(jīng)醛解生成乙醇醛和二羥丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP）。不同的是R?1?P 途徑中木酮糖差向異構(gòu)化形成核糖，再進行磷酸化和醛解轉(zhuǎn)化為乙醇醛和DHAP。

2.2 葡萄糖代謝途徑

葡萄糖作為大多數(shù)生物的主要碳源，在微生物體內(nèi)的代謝途徑主要有EMP 途徑（Embden?Meyerhof?Parnas pathway, EMP, 又稱糖酵解）、HMP途徑（hexose monophophate pathway, HMP），ED 途徑（entner?doudoroff pathway, ED） 及PK 途 徑（phospholytic ketase pathway, PK）[42]，見圖1。其中EMP 途徑是微生物中普遍存在的代謝途徑。在無氧條件下葡萄糖被分解為丙酮酸，在此期間每分解1分子葡萄糖產(chǎn)生2分子丙酮酸及2分子ATP。

在微生物HMP 途徑中，葡萄糖經(jīng)過幾步氧化反應(yīng)產(chǎn)生核酮糖?5?磷酸和CO2，核酮糖?5?磷酸經(jīng)同分異構(gòu)化或差向異構(gòu)化產(chǎn)生核糖?5?磷酸或木酮糖?5?磷酸，在無氧情況下發(fā)生碳架重排，產(chǎn)生己糖磷酸和丙糖磷酸。該途徑是許多微生物木糖代謝的必經(jīng)之路。

ED 途徑是一種EMP 途徑的替代途徑，在研究Pseudomonas時發(fā)現(xiàn)，存在于一些缺乏完整EMP 途徑的微生物中。ED 途徑為微生物特有，海洋菌中較多[43]，在革蘭氏陰性菌中分布較廣，如嗜糖假單孢菌（Ps.saccharophila）、銅綠假單孢菌（Ps.aeruginosa）、林氏假單孢菌（Ps.lindneri）、熒光假單孢菌（Ps.fluorescens）、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌（Alcaligenes eutrophus）、運動發(fā)酵單孢菌（Zymomonas mobilis）等。該途徑只需四步反應(yīng)即可快速代謝葡萄糖，獲得由EMP 途徑經(jīng)十步反應(yīng)才能形成的丙酮酸，但產(chǎn)能水平較低，1 分子葡萄糖分解為2 分子丙酮酸時，只凈得1分子ATP和1分子NADH[42?43]。在葡萄糖促進因子（glf基因編碼）協(xié)助下葡萄糖被轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，在葡萄糖激酶（glk基因編碼）催化下被氧化成葡萄糖?6?磷酸（G?6P），同時消耗1 分子ATP，然后在葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（Zwf基因編碼）作用下脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?1, 6?二磷酸（1G?6P），1G?6P 被磷酸葡萄糖酸脫水酶（edd基因編碼）催化脫水生成2?酮?3?脫氧?6 磷酸葡萄糖酸（KDPG），進而在KDPG醛縮酶（eda基因編碼）作用下轉(zhuǎn)化為甘油醛三磷酸和丙酮酸，在有氧條件進入TCA 或進行無氧乙醇發(fā)酵，見圖1。ED 途徑代謝流程較少，在微生物宿主中構(gòu)建更容易，是木糖?葡萄糖共利用工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品的重要途徑。

磷酸解酮酶途徑是明串珠菌在異型乳酸發(fā)酵中分解已糖和戊糖的途徑。該途徑的特征酶是磷酸解酮酶，根據(jù)解酮酶的不同，具有磷酸戊糖解酮酶的稱為PK 途徑，具有磷酸己糖解酮酶的稱為HK途徑。

2.3 木糖及葡萄糖共利用代謝途徑

構(gòu)建木糖及葡萄糖共利用工程菌株是提高木質(zhì)纖維素原料資源化利用效率的重要方法，可用于醇、油脂和有機酸等多種化學(xué)品的生物合成，見圖1。EMP 或ED 途徑是基因工程菌株構(gòu)建葡萄糖代謝模塊的常用途徑，而木糖XR、XI及WBG途徑則常被用來與葡萄糖代謝途徑組合，構(gòu)建木糖?葡萄糖共利用工程菌株。野生型酵母可以利用葡萄糖，且具有抗逆性強、培養(yǎng)周期短、遺傳操作簡單等優(yōu)點，可作為底盤菌，用于開發(fā)木糖?葡萄糖共利用工程菌株。但是，復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)和酶催化系統(tǒng)增加了在酵母中構(gòu)建異源戊糖或己糖代謝途徑的難度。因此，研究者將木糖?葡萄糖共利用研究擴展至原核及其他真核底盤菌，如E.coli、C.tyrobutyricum、C.glutamicum、B.subtilis、Pseudomonas及少根根霉（Rhizopus arrhizus）等。目前在乙醇、BT、木糖醇及丁醇等醇類合成，乳酸、富馬酸[44]、酮酸[45]、三羥基丙酸（3?HP）[46]、丁酸、檸檬酸等有機酸及γ?PGA、微生物油脂生產(chǎn)中成功應(yīng)用，見表2。

表2 微生物木糖及葡萄糖共利用生產(chǎn)化學(xué)品

續(xù)表2

3 木糖?葡萄糖共利用發(fā)酵產(chǎn)品合成

3.1 醇類

3.1.1 乙醇

第二代生物乙醇的制備是木質(zhì)纖維素最具前景的應(yīng)用領(lǐng)域。酵母菌因細胞壁厚、營養(yǎng)要求低、體積大，在乙醇發(fā)酵中更具有優(yōu)勢[17]。S.cerevisiae和S.stipites因能利用多種碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乙醇，且便于遺傳操作、乙醇耐受性強，使其成為極具潛力的乙醇發(fā)酵菌株。例如，S.stipites能夠利用多種木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇[64]，S.cerevisiae可以代謝木質(zhì)纖維素水解液中的多種糖[65]。但S.cerevisiae缺乏木糖利用能力，因此，將木糖代謝途徑引入S.cerevisiae是構(gòu)建木糖?葡萄糖共利用工程菌的可行方法。Wahlbom 等[66]將來自S.stipitis的Xyl1 基因和里氏木霉（Trichoderma reesei）的Xyl2 基因轉(zhuǎn)入S.cerevisiae中，經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變篩選后，得到的重組菌可以利用木糖生產(chǎn)少量乙醇，但轉(zhuǎn)化率僅為0.25g/g（乙醇/木糖），且副產(chǎn)物木糖醇較多。Shi 等[67]將C.shehatae的Xyl1 和Xyl2 基 因 克 隆 到S.cerevisiae中，也存在木糖代謝能力差、副產(chǎn)物較多的問題。為了進一步疏通木糖代謝流、減少副產(chǎn)物，杜仁鵬等[10]選擇發(fā)酵性能優(yōu)良的S.cerevisiaeW5和具有木糖代謝能力的C.shehatae為原始菌株，利用原生質(zhì)融合和基因工程育種方法，克隆Xyl1基因，提高了葡萄糖及木糖共利用產(chǎn)乙醇的效率。

除了高效的糖代謝途徑外，宿主菌的抗逆性與底物適應(yīng)性也是影響糖代謝效率的關(guān)鍵。K.marxianus因具有耐高溫和可代謝多種底物的優(yōu)點，有較高的應(yīng)用價值[68]。洪炯課題組[69?71]首次鑒定了K.marxianus木糖代謝途徑的3 個關(guān)鍵酶——木糖脫氫酶、XK 及XDH，推動了K.marxianus在木糖發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用。韓錫銅等[72]對比了K.marxianus和S.cerevisiae6525利用不同碳源的情況，篩選出高效的戊糖發(fā)酵菌株K.marxianusDL1，相比S.cerevisiae6525，K.marxianusDL1 利用己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）和戊糖（木糖、阿拉伯糖）生長更快、乙醇產(chǎn)率更高，在20g/L 糖條件下，K.marxianusDL1 的細胞量及乙醇產(chǎn)量分別是S.cerevisiae6525 的 近2 倍 和1.70 倍。Chupaza 等[11]對 比 了K.marxianus、C.lusitaniae、S.stipitis及S.cerevisiae利用絲狀滿江紅產(chǎn)乙醇的過程。除S.cerevisiae外，其他三種酵母菌都能利用葡萄糖和木糖混合物，且K.marxianus產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率最高，分別為26.80g/L 和0.43g/g（乙醇產(chǎn)量/初始單糖）。其次是C.lusitaniae產(chǎn)量為23.20g/L，轉(zhuǎn)化率為0.37g/g。S.stipitis因抗逆性較差，產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率相對較低，分別為18.20g/L 和0.29g/g。S.cerevisiae只能利用混合物中的葡萄糖，而不能利用木糖，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量最低，僅為13.7g/L，轉(zhuǎn)化率為0.22g/g。這表明菌株的抗逆性和底物偏好影響著底物利用效率和乙醇產(chǎn)量。

3.1.2 D?1, 2, 4?丁三醇

D?1, 2, 4?丁三醇（BT）是一種具有三個親水羥基的四碳多元醇，是重要的非天然精細化學(xué)品，在醫(yī)藥、軍工、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[73?76]。相比傳統(tǒng)的化學(xué)合成法，生物法反應(yīng)條件溫和、原料廉價易得、污染小，更符合綠色循環(huán)發(fā)展的要求。以木糖為底物的四步生化反應(yīng)是目前最高效的BT 生物合成路線（圖2），研究較多的宿主菌為E.coli、K.pneumoniae、S.cerevisiae、Ps.fragi等。Cao 等[33]在E.coli中共表達來自C.crescentus的CcXylB、XylC基因，E.coli的木糖脫水酶基因YjhG、醛還原酶基因AdhP以及P.putida的2?酮酸脫羧酶基因MdlC，同時敲除XylA和XylB基因以減少木糖分解代謝分流，構(gòu)建的工程菌株以20g/L 木糖為原料，補料分批發(fā)酵BT 產(chǎn)量為3.92g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為27.7%（BT/木糖）。

圖2 木糖及葡萄糖共利用合成D?1, 2, 4?丁三醇（BT）代謝途徑及其代謝旁路[74?77]

生物法合成BT 存在合成途徑活性較低、副產(chǎn)物多及忽略宿主生長對BT 合成的影響等問題。王金保[73]從合成途徑、輔因子和底物供給三個層面優(yōu)化，在E.coliMG1655 中表達異源CcXylB和MdlC，敲除XylA和2?酮酸醛縮酶基因YjhH和YagE，適量過表達Zwf，敲除MtfA，失活轉(zhuǎn)氫酶基因PntAB使輔因子供應(yīng)平衡，成功構(gòu)建木糖及葡萄糖共利用工程菌BT?02，BT 產(chǎn)量達7.23g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為55%（BT/木糖），首次確定了PPP 是為BT 合成供給NADPH的主要途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，敲除XylA、XylB、YagE及YjhH基因可以削弱木糖分支代謝和副產(chǎn)物途徑，有利于碳流向BT合成途徑[74]。孫雷等[75]篩選獲得了來自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的2?酮酸脫羧酶（KivD基因編碼），大幅提高了3?脫氧?D?甘油?戊酮糖酸的脫羧反應(yīng)速率。優(yōu)化后BT 合成效率雖有提高，但游離質(zhì)粒誘導(dǎo)表達成本較高，且CCR 使細胞無法同時利用木糖和葡萄糖高效積累目的產(chǎn)物。改造葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system,PTS）可有效緩解CCR 現(xiàn)象[76]。針對上述限制因素，諸葛斌課題組[47,77]以缺失YagE、YjhH的菌株為基礎(chǔ)，通過Red系統(tǒng)將外源基因KivD、CcXylB整合至E.coli基因組的XylA、XylB、ptsHI、ptsG、crr位點，利用廉價的乳糖替代IPTG 誘導(dǎo)表達，構(gòu)建的工程菌E.coliW031 可利用木糖?葡萄糖混合糖（30g/L 木糖、10g/L 葡萄糖）發(fā)酵合成BT，產(chǎn)量為3.90g/L，轉(zhuǎn)化率為30%，減少了副產(chǎn)物分流和質(zhì)粒表達成本，為后續(xù)規(guī)?；瘧?yīng)用打下了基礎(chǔ)。

CCR 限制了以E.coli為宿主開發(fā)木糖?葡萄糖共利用工程菌合成BT 的研究。K.pneumoniae具有木糖及葡萄糖混合糖利用效果好、CCR 較弱、生長速度快等優(yōu)點。因此，以K.pneumoniae為宿主構(gòu)建合成BT 的工程菌，可提高混合糖利用能力。李玉石等[78]將來源于C.crescentus的CcXylB和L.lactis的KivD基因及E.coliW3110 的YjhG基因克隆至K.pneumoniaeZG25，并敲除了XylA減少碳分流，構(gòu)建的工程菌發(fā)現(xiàn)增加葡萄糖能夠提高生物量、減少木糖酸積累，以30g/L 木糖和10g/L 葡萄糖為底物共發(fā)酵時，BT 產(chǎn)量達4.52g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為21%（BT/木糖）。

此外，Yukawa等[79]利用C.crescentus的CcXylB、XylD及L.lactis的KdcA和Adh基因編碼的異源四酶催化反應(yīng)，由木糖合成BT，將KdcA基因的多個拷貝整合到酵母基因組，增強工程菌性狀穩(wěn)定性。但是，異源BT合成途徑的引入會導(dǎo)致NADH/NADPH失衡或缺乏，因此過表達S.cerevisiae的Pos5 基因（編碼NADH 激酶）緩解了NADH/NADPH 不平衡問題，用低濃度的葡萄糖和木糖支持NADH 供應(yīng)，工程菌以木糖為原料，BT 產(chǎn)量為6.60g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為57%（BT/木糖）?？梢姡跇?gòu)建重組高效BT 合成路徑過程中，應(yīng)重視宿主菌的自身生長和輔酶平衡問題。

3.1.3 木糖醇

木糖醇是一種五碳糖醇，常作為甜味劑，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域。生物轉(zhuǎn)化法能夠克服傳統(tǒng)方法的污染重、資源消耗大的缺點，且反應(yīng)條件更易控制[48,80]。

CCR作用導(dǎo)致野生型E.coli不能同時利用木糖和葡萄糖[49]，限制了木糖醇產(chǎn)量，但E.coli能利用廉價培養(yǎng)基快速生長、遺傳操作簡單，依然具有研究價值[81]。Kim 等[8]將E.coliMG1655 經(jīng)適應(yīng)性進化獲得了缺失阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（araC）的突變菌株GX50，其中木糖轉(zhuǎn)錄激活因子基因XylR、木糖ABC 轉(zhuǎn)運體基因XylFGH及木糖XI 途徑基因XylA、XylB組成型表達。此外，還獲得了四個額外的突變，包括XylA和乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶pyrE基因間突變、編碼阿拉伯糖和質(zhì)子轉(zhuǎn)運體的araE和十一碳烯基?二磷酸酶活性的ybjG基因的錯義突變。最終，菌株GX50能夠利用空棕櫚果束纖維水解物中的木糖和葡萄糖生產(chǎn)木糖醇，轉(zhuǎn)化率為0.99g/g（木糖醇/木糖）。

相比而言，利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇產(chǎn)量更高，更適合規(guī)模化生產(chǎn)。Saravanan 等[13]以玉米芯、稻草和小麥秸稈為原料，對比了D.hansenii、P.tannophilus和C.guillermondii生產(chǎn)木糖醇，發(fā)現(xiàn)P.tannophilus利用玉米芯水解液發(fā)酵產(chǎn)量較高。為了提高木糖代謝效率和木糖醇產(chǎn)量，張佳[50]過表達來自脈孢霉和S.stipites的Xyl1基因，以及糖轉(zhuǎn)運相關(guān)基因KmFPS、CiGXF1、CiGXS1，同時敲除了K. marxianus自身的Xyl1 和Xyl2 基因，木糖和葡萄糖共利用發(fā)酵獲得了312.05g/L 木糖醇。為了進一步 克 服CCR，Zhang 等[51]過 表 達S.cerevisiae的GAL2N376F和粗鏈孢霉的Xyl1 基因，進一步敲除GPD1、KU70、PGI1和Xyl2基因，重構(gòu)了葡萄糖代謝途徑，阻斷木糖醇下游分解代謝路徑，使得構(gòu)建的工程菌株K.marxianusYZB194 可同時利用70g/L葡萄糖和140g/L 木糖，產(chǎn)生139.96g/L 木糖醇。當(dāng)培養(yǎng)溫度調(diào)至42℃進行補料分批發(fā)酵時，產(chǎn)量進一步提高至203.57g/L，轉(zhuǎn)化率為0.99g/g（木糖醇/木糖）。該研究表明，采用適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵方式，同時增強工程菌合成基因表達水平、阻斷產(chǎn)物分解代謝路徑，有利于提高木糖醇的產(chǎn)量。

3.2 微生物油脂

微生物油脂的主要成分為C16和C18系脂肪酸，是構(gòu)成和維持生命活動的基本物質(zhì)，在食品、能源領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，也被用來制備生物柴油[52,82]。常由酵母、霉菌、細菌和藻類等利用碳水化合物或碳氫化合物合成，產(chǎn)油微生物生成并儲存的油脂一般占其生物總量的20%以上[83?85]，微生物生產(chǎn)油脂的過程分為菌體增長和油脂積累兩個階段[54,86]。微生物生產(chǎn)油脂相比傳統(tǒng)油脂制備方法，具有細胞增殖速度快、生產(chǎn)周期短、原料豐富的優(yōu)勢。此外，使用融合、誘變、定向進化及合成生物學(xué)等技術(shù)優(yōu)選和調(diào)控，還可生產(chǎn)特定的功能性油脂[53,82]。在多種產(chǎn)油微生物中，產(chǎn)油酵母產(chǎn)油能力較強（20%～70%）且易于基因改造，比微藻可用碳源更豐富，比霉菌需氧量更少、重金屬離子耐受性更強，比細菌菌體更大、油脂易提取[53,87]。因此，是極具潛力的產(chǎn)油微生物。

產(chǎn)油酵母對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中不同糖分的利用偏好不同，因此，促進各種糖類同時、快速、充分利用對木質(zhì)纖維素向油脂的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[84]。張艷芬[53]采用兩段發(fā)酵模式研究了賴巴克絲孢酵母（Trichosporon laichii）、圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）和斯達氏油脂酵母菌（Lipomyces starkeyi）在不同初始碳源濃度下的產(chǎn)油特性，發(fā)現(xiàn)在木糖、葡萄糖及混合糖中，經(jīng)篩選獲得的菌株T. laichiiIEM?14 可利用葡萄糖、木糖及混合糖生產(chǎn)油脂，質(zhì)量分數(shù)最高可達82.74%，比R. toruloides和L.starkeyi具有更好的產(chǎn)油能力，同時發(fā)現(xiàn)葡萄糖有助于菌株生長，木糖則更利于油脂積累。R.toruloides以葡萄糖和木糖為基質(zhì)產(chǎn)油性能相似，均在初始糖濃度為0.40mol/L 時油脂得率最大，分別為21.62%和11.44%。與單糖相比，混合糖更適合R.toruloides生產(chǎn)油脂，在初始糖濃度為2mol/L 時油脂得率達到25.06%。L.starkeyi利用木糖產(chǎn)油效率最高，油脂得率為19.67%，而混合糖則更利于L.starkeyi菌體生長。

Ledesma?Amaro 等[52]利用“開源節(jié)流”的策略，將木糖代謝與脂質(zhì)合成基因組合調(diào)控，在解脂椰氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）中過表達外源XDH、XR 和內(nèi)源XK 促進木糖代謝，過表達GPD1基因（編碼甘油三磷酸脫氫酶，參與甘油三酯前體甘油?3?磷酸的形成）和DGA2 基因（編碼?；D(zhuǎn)移酶，促進脂質(zhì)合成），敲除POX1-6基因（編碼脂酰輔酶A 氧化酶，參與甘油三酯合成的最后一步）阻止過氧化物酶體中的β?氧化，敲除TGL4基因（編碼三?；视椭福┳钄嘀舅釓闹|(zhì)體中釋放，避免脂質(zhì)降解或利用，進一步提高了木糖利用效率與油脂產(chǎn)量。最終得到的工程菌株能夠利用木糖唯一碳源積累高達細胞干重42%的油脂，是野生型菌株的3.40 倍。該菌株在5L 生物反應(yīng)器中共利用375g/L 木糖和葡萄糖混合碳源，補料分批發(fā)酵生產(chǎn)22.50g/L 油脂，產(chǎn)率為0.06g/g（油脂/糖）。同時，產(chǎn)生67.20g/L 的檸檬酸，產(chǎn)率為0.18g/g（檸檬酸/糖）。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)木糖與葡萄糖共利用更利于檸檬酸生產(chǎn)，而木糖與甘油共利用有助于提升油脂產(chǎn)量。

孔祥莉等[88]發(fā)現(xiàn)L.starkeyi在一定的混合糖比例下，具有同時轉(zhuǎn)化木糖和葡萄糖積累油脂的能力，以木糖?葡萄糖混合液（質(zhì)量比1∶2）為碳源時，油脂得率超過50%。此外，Hu等[5]研究皮絲孢酵母AS 2.571（T.cutaneumAS 2.571）時，發(fā)現(xiàn)其可以同時代謝葡萄糖和木糖高效生產(chǎn)油脂，在3L攪拌槽生物反應(yīng)器中，以木糖和葡萄糖混合糖（1∶2）發(fā)酵時，油脂含量高達59%，轉(zhuǎn)化率為0.17g/g（油脂/糖），且沒有二次生長現(xiàn)象和滯后期，在不同混糖比例的搖瓶培養(yǎng)中可以同時完全利用這兩種糖。進一步研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖為唯一碳源時，細胞油脂含量、總油脂產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別為52.40%、12g/L和0.20g/g；然而，木糖為唯一碳源時，則分別降低至46.50%、9.90g/L和0.16g/g；葡萄糖?木糖混合糖時，細胞油脂產(chǎn)量略低于葡萄糖，但高于木糖。并且增加底物中木糖的占比，會略微降低油脂的生成，相比而言，使用葡萄糖生產(chǎn)油脂明顯比單獨利用木糖或葡萄糖?木糖混合物作為碳源的轉(zhuǎn)化率更高。此外，T.cutaneumAS2.571 以玉米秸稈水解液為原料產(chǎn)油脂，質(zhì)量分數(shù)達39.2%，也展現(xiàn)了其有較強的工業(yè)應(yīng)用價值，該研究為混合糖碳源發(fā)酵產(chǎn)油脂的碳源配比及更高效的木糖?葡萄糖共利用提供了參考。

為了克服木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生的抑制物的影響，Huang 等[54]將經(jīng)稀硫酸水解后的玉米芯水解物經(jīng)堿脫毒和活性炭吸附，發(fā)現(xiàn)L.starkeyi可以同時利用水解液中的木糖和葡萄糖生產(chǎn)8.10g/L的油脂。Sitepu 等[89]則利用合成水解液解決抑制問題，研究了酵母利用合成水解液（SynH）APEXTM（利用高溫、高壓和氨工藝預(yù)處理的技術(shù)）的發(fā)酵性能，發(fā)現(xiàn)APEXTM可促進部分纖維素脫結(jié)晶和半纖維素解聚，降低木質(zhì)素抗逆性，增強菌株利用玉米秸稈水解液（ACSH）的產(chǎn)油能力。大多數(shù)酵母菌株能夠在SynH 中積累油脂，只有少數(shù)能夠在ACSH 培養(yǎng)基中生長和生產(chǎn)油脂，土生隱球菌（Cryptococcus humicola） 在ACSH 中生長時，能夠產(chǎn)生高達15.50g/L 的油脂，油脂含量達到細胞干重的40%，是目前報道的最高的利用真實水解液產(chǎn)油脂的酵母之一。此外，還發(fā)現(xiàn)在SynH 培養(yǎng)基中以木糖作為唯一碳源預(yù)培養(yǎng)，可使酵母菌在隨后的水解培養(yǎng)基中更高效地利用葡萄糖和木糖。

3.3 γ-聚谷氨酸

γ?聚谷氨酸（γ?PGA）是微生物發(fā)酵產(chǎn)生的水溶性多聚氨基酸，由D?谷氨酸和L?谷氨酸單體以γ-位上的酰胺鍵聚合而成，具有良好的吸附性和生物降解性，在生物修復(fù)及醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較多[31]。谷氨酸的兩個羧基導(dǎo)致γ?PGA 的化學(xué)合成非常復(fù)雜，因此其制備主要依靠細菌發(fā)酵。用于生產(chǎn)γ?PGA 的細菌主要為芽孢桿菌，如B.subtilis、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）等[90]。

發(fā)酵底物成本過高是制約γ?PGA 規(guī)?；a(chǎn)的重要因素。研究表明，采用合成生物學(xué)策略，引入低能耗代謝途徑或合成基因[91?93]是增強底物利用效率的常用方法。例如，F(xiàn)eng 等[91]在B.amyloliquefaciensNK?1 中引入節(jié)能型NADPH 依賴型谷氨酸脫氫酶（NADPH?GDH）途徑后，菌株NK?1 以蔗糖為底物生產(chǎn)γ?PGA 的產(chǎn)量增加了9.10%。廉價的木質(zhì)纖維是更為經(jīng)濟的γ?PGA生產(chǎn)原料[94]，Halmschlag 等[31]改造B.subtilis的木糖XI 途徑，引入更為高效的異源木糖WBG 途徑，選擇木糖誘導(dǎo)和葡萄糖抑制的PX43 啟動子元件組合，使得細胞生長和γ?PGA 的產(chǎn)生解耦，有利于在生長階段從葡萄糖獲得更高的生物催化劑供應(yīng)，并在葡萄糖耗盡后誘導(dǎo)γ?PGA 合成酶的表達，構(gòu)建了能高效利用木糖的工程菌。在37℃、0.50L 攪拌槽生物反應(yīng)器中，分批發(fā)酵γ?PGA 產(chǎn)量較野生型菌株提高了6倍。借助Cobra Toolbox 和Matlab 對菌株的代謝通量分析優(yōu)化后，以D?木糖和D?葡萄糖混合物（木糖占80%）為底物，γ?PGA 產(chǎn)量為5g/L，C摩爾轉(zhuǎn)化率為0.26（γ?PGA中碳/糖中碳）。

為了驗證工程菌株的木質(zhì)纖維素底物的利用能力，F(xiàn)ang 等[55]利用B.amyloliquefaciensJX?6 以玉米秸稈和豆粕為固體基質(zhì)生產(chǎn)γ?PGA，將產(chǎn)量從10kg 提高到37.50kg，在50L 和150L 曝氣式連續(xù)攪拌固態(tài)生物反應(yīng)器中γ?PGA 產(chǎn)量最高，分別為116.88g/kg 和102.48g/kg。但是，隨著發(fā)酵體系擴大，γ?PGA 產(chǎn)量下降，可能是反應(yīng)器容量增大導(dǎo)致發(fā)酵參數(shù)和細菌群落的變化，影響了底物利用和產(chǎn)量。為了進一步簡化生產(chǎn)工藝流程，該課題組深入研究工程菌株的環(huán)境適應(yīng)能力，發(fā)現(xiàn)B.amyloliquefaciensJX?6 對底物和發(fā)酵條件具有良好的適應(yīng)性，在非滅菌條件也可實現(xiàn)γ?PGA 的高效生產(chǎn)。

3.4 有機酸

3.4.1 富馬酸

富馬酸（FA）是由丁烯衍生的羧酸，作為重要的聚合原料，應(yīng)用于食品、醫(yī)療、飼料及化學(xué)合成中間體領(lǐng)域[6,44,56]。生物轉(zhuǎn)化法因原料儲量豐富、可再生的優(yōu)點，成為工業(yè)生產(chǎn)FA 的更好選擇[57,95?96]。生物發(fā)酵制備FA常用的原料是葡萄糖和淀粉類，以木質(zhì)纖維素原料為底物生產(chǎn)FA 可以實現(xiàn)廢物利用，進一步降低原料成本[6,44,96]。但是，以木糖為底物生產(chǎn)FA相比葡萄糖有待進一步提高。Kautola 等[97]利用R.arrhizus以木糖為碳源發(fā)酵僅得到16.40g/L的FA。Wen等[56]采用定向進化獲得一株優(yōu)良的菌株R.arrhizusRH7?13，不同于之前的菌株通過呼吸作用利用木糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳提高生物量和能量供應(yīng)的方式，該菌株突變后，更傾向于利用木糖促進細胞生長的方式來增強FA 生產(chǎn)，可將發(fā)酵木糖制備FA 的產(chǎn)量提高至28.48g/L，木糖消耗量達到83%，轉(zhuǎn)化率達到46%（FA/木糖）。為了進一步提高FA 產(chǎn)量，該課題組[44]利用選擇培養(yǎng)基從R.arrhizusRH7?13 篩選得到R.arrhizusRH7?13?9#，能更高效地利用木糖生產(chǎn)45.31g/L FA，轉(zhuǎn)化率為73%。

木糖?葡萄糖共利用發(fā)酵比單糖發(fā)酵更利于纖維素原料的充分利用。但是，當(dāng)前的研究多局限于葡萄糖或木糖單獨發(fā)酵生產(chǎn)FA，而對木糖?葡萄糖混糖共利用制備FA 的研究相對較少。為了減少發(fā)酵批次，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解物中木糖及葡萄糖混合物的同步利用，該課題組[6]以高濃度木糖分離篩選獲得的新菌株R.arrhizusRH7?13?9#，并研究了其混糖協(xié)同發(fā)酵過程，利用80g/L 葡萄糖發(fā)酵得到37.52g/L FA。進一步優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)混合糖利用過程中葡萄糖仍然是首選糖，但葡萄糖的添加不僅加速了FA 的生成，還增加了副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)量；而木糖的加入不利于副產(chǎn)物乙醇的生產(chǎn)。因此，確定了最佳木糖/葡萄糖質(zhì)量比為75/25，碳氮質(zhì)量比為800/1，F(xiàn)A 產(chǎn)量可達46.78g/L。探究了混糖比例與FA 產(chǎn)量的關(guān)系，為高效利用纖維素原料規(guī)?；a(chǎn)FA提供了參考。

3.4.2 乳酸

乳酸是廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織印染等領(lǐng)域的多用途有機酸[58?59,98]。米根霉（Rhizopus oryzae）營養(yǎng)要求低、產(chǎn)物純度高，使其成為最有前途的乳酸生產(chǎn)菌種之一。潘麗軍等[58]經(jīng)N+注入誘變篩選得到菌株R.oryzaeN50?7。隨后采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件，確定最佳了混合糖比例為2∶1（木糖∶葡萄糖），搖瓶發(fā)酵72h，L?乳酸產(chǎn)量為119.22g/L，轉(zhuǎn)化率為79.48%。該實驗表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)混合糖能夠協(xié)調(diào)木糖?葡萄糖代謝平衡，解除胞內(nèi)代謝擾動，從而促進產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。

木質(zhì)纖維素水解液直接用于發(fā)酵生產(chǎn)L?乳酸，能使成本更低，利于產(chǎn)業(yè)化。姜珊[59]以玉米芯殘渣為 底 物， 利 用 凝 結(jié) 芽 孢 桿 菌H?1 （Bacillus coagulansH?1）補料分批發(fā)酵，L?乳酸產(chǎn)量達68g/L，轉(zhuǎn)化率為0.85g/g（L?乳酸/玉米芯），實現(xiàn)了木質(zhì)纖維素向可用化學(xué)品乳酸的轉(zhuǎn)化。成分復(fù)雜的水解液直接用于生產(chǎn)發(fā)酵時，其中的弱酸、酚類等多種物質(zhì)會抑制菌株生長和產(chǎn)物得率。針對該問題，Zhang 等[60]分離得到一株嗜熱菌株B.coagulansIPE22，能夠發(fā)酵戊糖、己糖和纖維二糖，且對水解液中多種抑制物具有耐受性，結(jié)合這一特點，建立了以100g小麥秸稈為底物的高溫發(fā)酵集成工藝：小麥秸稈經(jīng)稀酸預(yù)處理后，無需固液分離和脫毒步驟，直接同步糖化共發(fā)酵生產(chǎn)46.12g乳酸，減少了設(shè)備投入，降低了能耗和生產(chǎn)成本。此外，該課題組[61]首次報道了利用B.coagulans發(fā)酵非食用淀粉一步法生產(chǎn)乳酸，利用B.coagulansIPE22 以木薯和高粱粉等非食用淀粉為原料直接分批發(fā)酵生產(chǎn)乳酸時淀粉酶活性過低，補加中溫α?淀粉酶和糖化酶后，不滅菌，同步液化與糖化，發(fā)酵乳酸產(chǎn)量為68.72g/L，轉(zhuǎn)化率0.99g/g。

3.4.3 其他

除上述應(yīng)用外，Chen等[46]在C.glutamicum中將葡萄糖代謝途徑與甘油合成途徑相結(jié)合，利用肌醇滲透酶（iolT1）和葡萄糖激酶（glk）取代PEP 依賴的PTS減少副產(chǎn)物生成，實現(xiàn)木糖和葡萄糖共利用高效生產(chǎn)3?HP，產(chǎn)量達38.60g/L，轉(zhuǎn)化率為0.46g/g（3?HP/葡萄糖）。在此基礎(chǔ)上，進一步整合戊糖轉(zhuǎn)運蛋白基因araE及木糖分解代謝基因XylA、XylB，實現(xiàn)了更高效的木糖?葡萄糖共利用。補料分批發(fā)酵，3?HP 產(chǎn)量提升至62.60g/L，轉(zhuǎn)化率為0.51g/g，表明模塊化構(gòu)建功能性代謝路徑有利于平衡工程菌株生長和產(chǎn)物合成過程。

Fu 等[62]在Clostridium tyrobutyricum（C.tyrobu?tyricum）中過表達來自丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）的XylT、XylA和XylB基因，獲得的工程菌株Ct?pTBA 可以實現(xiàn)木糖?葡萄糖共利用，丁酸產(chǎn)量由19.40g/L 提升至37.80g/L，木糖利用率由13.80%提高至94.30%，丁酸轉(zhuǎn)化率達到0.32g/g（丁酸/木糖?葡萄糖混合物）。為了便于實際生產(chǎn)，該課題組研究了工程菌株Ct?pTBA 共利用大豆殼、玉米纖維、小麥秸稈、水稻秸稈和甘蔗渣水解物中的木糖和葡萄糖的過程，發(fā)現(xiàn)Ct?pTBA較野生型菌株表現(xiàn)出更高的木糖利用率，且沒有顯著的CCR，在pH為6.0的生物反應(yīng)器中，水解物中的木糖和葡萄糖利用率接近100%，丁酸產(chǎn)量為42.60g/L，轉(zhuǎn)化率0.36g/g（丁酸/水解物），證明了Ct?pTBA 具有利用木質(zhì)纖維素水解物生產(chǎn)丁酸的潛力。

上述木糖?葡萄糖共利用產(chǎn)品的應(yīng)用實例展現(xiàn)了以木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為底物生產(chǎn)高值化學(xué)品的巨大潛力，而木糖?葡萄糖共利用工程菌能否構(gòu)建成功、混糖利用效率及產(chǎn)物產(chǎn)量除了代謝途徑的糖轉(zhuǎn)運蛋白效率、合成基因表達水平等關(guān)鍵因素外，還受底物預(yù)處理方法及分支代謝途徑制約[20?22,99?103]。

4 木糖及葡萄糖共利用發(fā)酵優(yōu)化策略

4.1 木糖及葡萄糖共利用基因水平調(diào)控

4.1.1 木糖及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因優(yōu)化

木糖、葡萄糖被轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)是被微生物代謝利用的前提，糖轉(zhuǎn)運蛋白在微生物攝取糖的過程中扮演著重要角色，決定了代謝通量和糖利用效率。微生物單糖轉(zhuǎn)運蛋白可分為三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP?binding cassette, ABC）、易化超家族轉(zhuǎn)運蛋白（major facilitator superfamily, MFS）和磷酸烯醇式丙酮酸?糖磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運蛋白（carbohydrate phosphotransferase system, PTS）三大類[104]，見圖3。其中MFS 型轉(zhuǎn)運蛋白分為借助糖濃度梯度、不消耗能量的單向異化擴散型（facilitator/uniporter）被動運輸和偶聯(lián)質(zhì)子或鈉離子濃度消耗ATP 能量、不依賴糖濃度梯度的質(zhì)子或鈉離子同向協(xié)同型（H+?linked symporter，Na+?linked symporter） 主 動運輸[104?105]。相關(guān)研究證明，S.cerevisiae內(nèi)源非特異性戊糖轉(zhuǎn)運蛋白屬于不消耗能量的單向異化擴散型[9,105]。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白因其較高的底物親和力和清晰的結(jié)構(gòu)研究而成為細菌戊糖轉(zhuǎn)運基因改造的優(yōu)先選擇。

圖3 轉(zhuǎn)運蛋白分類示意圖

木糖?葡萄糖共利用菌株構(gòu)建面臨的首要問題是葡萄糖的存在對木糖的分解代謝物阻遏作用（CCR），CCR突出表現(xiàn)在一些非特異性的木糖轉(zhuǎn)運蛋白層面[106]。如S.cerevisiae的內(nèi)源性己糖轉(zhuǎn)運蛋白Hxt7p 和Gal2p[105,107?108]，雖可以非特異性地轉(zhuǎn)運木糖，但對木糖的親和力遠低于葡萄糖，且易受到葡萄糖的強烈抑制。在木糖?葡萄糖共利用過程中，利用專一性強的木糖轉(zhuǎn)運蛋白增強轉(zhuǎn)運蛋白對木糖的親和力，使木糖及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白“各司其職”是緩解CCR 的有效策略[7,9,108?110]。例如，Shin 等[111]在缺乏Hxt1?7和GAL2基因的菌株中表達S.cerevisiae的隱性糖轉(zhuǎn)運蛋白Hxt11，實現(xiàn)了有氧和無氧條件下木糖及葡萄糖共利用；Hxt11的誘變產(chǎn)生的轉(zhuǎn)運蛋白與D?葡萄糖相比對D?木糖有更好的親和力，并保持高轉(zhuǎn)運率。而此前沒有發(fā)現(xiàn)Hxt11 與D?木糖轉(zhuǎn)運相關(guān)，表明內(nèi)源性轉(zhuǎn)運蛋白篩選優(yōu)化是解決CCR的可行方法。

4.1.2 敲除抑制基因及分支代謝基因

敲除抑制基因或阻斷分支代謝途徑是提高產(chǎn)物產(chǎn)量和目標(biāo)代謝途徑碳通量的重要策略。敲除關(guān)鍵抑制基因可以有效調(diào)控木糖?葡萄糖共利用。蔡艷青等[112]敲除了S.cerevisiae中CCR 系統(tǒng)的兩個關(guān)鍵調(diào)控因子Mig1 和Snf1，激活了氮分解代謝阻遏基因表達，增強了S.cerevisiae的混糖利用能力，使木糖消耗速率提高到初始菌株的1.23倍。Gao等[113]敲除了葡萄糖代謝途徑中間產(chǎn)物的分支代謝基因fadR、lysC、aspB、pckA以及下游的谷氨酸分解代謝基因proAB、rocG和gudB，獲得的菌株NK?A6的γ?PGA產(chǎn)量為4.84g/L，比初始菌株提高了31.50%。此外，啟動子的類型會影響基因表達水平，且限速步驟的酶催化反應(yīng)大多需要能量及輔因子參與[83]。因此，啟動子的選擇、胞內(nèi)還原力水平調(diào)控對于增強代謝流、提高產(chǎn)量至關(guān)重要。該課題組進一步在異檸檬酸脫氫酶基因icd上游插入強啟動子PC2up，調(diào)控NADPH 相關(guān)基因pgi和gndA表達，增加胞內(nèi)還原力水平，最終γ?PGA產(chǎn)量提高至7.53g/L。

4.1.3 過表達產(chǎn)物合成基因

合成基因編碼的關(guān)鍵酶的活性決定了反應(yīng)速率，是整個代謝網(wǎng)絡(luò)的限速步驟。過表達代謝途徑合成基因是提高代謝通量、克服CCR、提高混糖共利用效率的有效方法。如姜珊[59]通過表達異源葡聚糖內(nèi)切酶基因Bscel5，使B.licheniformisBN11 可以利用無定形纖維素生產(chǎn)D?乳酸。Fu 等[7]表達異源木糖分解代謝基因XylT、XylA和XylB，消除了C.tyrobutylicum中的CCR。構(gòu)建的工程菌株可以共利用木質(zhì)纖維素水解物中的木糖和葡萄糖，利用率接近100%。此外，張佳[50]過表達粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）的Xyl1 基因、S.stipitis的Xyl2基因和白色假絲酵母（Candida albicans）的Xyl2基因，改善了輔酶不平衡問題，提高了利用木糖生產(chǎn)乙醇的能力。同時，敲除3?磷酸甘油脫氫酶基因GPD1降低甘油和乙酸等副產(chǎn)物積累，42℃條件下，實現(xiàn)103.97g/L 木糖和40.96g/L 葡萄糖共利用乙醇產(chǎn)量達到51.43g/L。

4.2 木糖及葡萄糖共利用發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化

4.2.1 細胞固定化

根據(jù)培養(yǎng)基的形態(tài)不同，發(fā)酵方式可分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。細胞固定化發(fā)酵是指用物理或化學(xué)的方法將細胞固定于一定的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，將整個固定化體系放置于液態(tài)培養(yǎng)基中發(fā)酵，可以結(jié)合兩種方式產(chǎn)物密度高、可控性強的優(yōu)勢，具有抗逆性強、穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用等優(yōu)點[114?116]。根據(jù)固定化原理和細胞表面特性不同，常用的固定化方法有包埋法、吸附法、共價法和交聯(lián)法等。常見的天然有機高分子載體材料有海藻酸鈉、果膠和殼聚糖等，因無毒性、傳質(zhì)性能優(yōu)和生物相容性好，已被廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵系統(tǒng)[116]。

此外，根據(jù)包埋物的不同，固定化又分為單種細胞固定化、細胞?酶固定化、細胞?細胞固定化、酶固定化等形式。Xu 等[117]將海藻酸鈉用于固定熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum）和熱解糖梭菌（Clostridium thermolacticum）的共培養(yǎng)系統(tǒng)，與游離細胞相比，固定化細胞發(fā)酵木質(zhì)纖維素底物的乙醇產(chǎn)量提高了60%以上。纖維素原料預(yù)處理過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)及極端pH 條件會抑制細胞生長和代謝，降低乙醇產(chǎn)量。海藻酸鈉可包埋細胞形成微球，將菌體包埋于微球核心中，以空間隔離的方式使細胞免受發(fā)酵體系中有毒物質(zhì)的傷害，同時可提高細胞對pH 變化的適應(yīng)能力。此外，Evrim günes 等[118]將葡萄糖苷酶和Z.Mobilis共固定化，利用淀粉生產(chǎn)乙醇，發(fā)現(xiàn)98%的底物轉(zhuǎn)化為乙醇。多種細胞共固定化利用微生物種間協(xié)調(diào)共生的特點，細胞與酶共固定化利用了微生物與酶的協(xié)同作用。

4.2.2 混菌發(fā)酵技術(shù)

混菌發(fā)酵是指利用兩種或兩種以上的微生物混合共培養(yǎng)的發(fā)酵技術(shù)，屬于微生物生態(tài)工程范疇?；炀囵B(yǎng)包括直接共培養(yǎng)、間接共培養(yǎng)和共固定化混菌培養(yǎng)等[119]。混菌發(fā)酵能夠利用共培養(yǎng)微生物種間的協(xié)同代謝、誘導(dǎo)作用、基因轉(zhuǎn)移及種間群體感應(yīng)等[119?125]，使發(fā)酵系統(tǒng)持續(xù)穩(wěn)定地運行。

混菌發(fā)酵能夠結(jié)合不同菌株的優(yōu)勢，利用種間相互作用克服一些微生物不能利用木糖或葡萄糖的限制。江楓等[121]采用包埋法固定化C.shehatae和S.cerevisiae混菌發(fā)酵（菌體比例4∶1）生產(chǎn)乙醇，可以快速利用葡萄糖，解除葡萄糖對木糖代謝的抑制，縮短發(fā)酵時間，產(chǎn)量達14.89g/L，較單菌發(fā)酵提高了12.12%。Ferreira 等[122]利用Z.mobilis和P.tannophilus混菌發(fā)酵，將Z.mobilis先于P.tannophilus接種到經(jīng)稀硫酸處理后的香蕉皮水解產(chǎn)物中，有利于加速葡萄糖利用，解除CCR。針對S.oneidensis不能利用木糖及葡萄糖作為碳源的局限，Li 等[123?124]構(gòu) 建 了K.pneumoniae和S.oneidensisMR?1的混菌產(chǎn)電系統(tǒng)，借助K.pneumoniae以葡萄糖、木糖或甘油作為底物高產(chǎn)乳酸，生成的乳酸作為產(chǎn)電菌S.oneidensisMR?1生長的碳源，形成了種間協(xié)同作用；Lin 等[125]將S.cerevisiae和S.oneidensisMR?1 混合共培養(yǎng)，提高了S.cerevisiae以葡萄糖為底物生產(chǎn)乳酸的能力，產(chǎn)生的乳酸作為碳源供給S.oneidensisMR?1產(chǎn)電。此外，混合培養(yǎng)還增強了S.oneidensisMR?1細胞膜通透性和導(dǎo)電性，使得產(chǎn)電功率得到較大提高。Valdez?Vazquez 等[119]在直接共培養(yǎng)中，將木質(zhì)纖維素發(fā)酵轉(zhuǎn)化為氫氣，水解菌（Clostridium cellulovorans） 和發(fā)酵菌（Clostridium acetobutylicum）的接種比例為5∶3 時，建立了協(xié)同關(guān)系，利用小麥秸稈產(chǎn)氫氣量達128mL/L，比單培養(yǎng)提高了2～3倍。然而，這種協(xié)同關(guān)系并非廣泛適用于多種發(fā)酵底物，如：在天然麥草微生物群落的生物強化過程中，兩種菌之間的協(xié)同關(guān)系消失，對甘蔗渣的發(fā)酵產(chǎn)氫率也沒有提高。

針對混菌發(fā)酵導(dǎo)致副產(chǎn)物較多的問題，Zhang等[126]利用CCR 較弱的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）同時利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸，但乳酸轉(zhuǎn)化率僅為0.52g/g，還伴隨著副產(chǎn)物乙酸和乙醇的產(chǎn)生。但將Lactobacillus brevis（L.brevis）與Lactobacillus plantarum（L.plantarum） 共 培 養(yǎng) 后減少了副產(chǎn)物乙醇，顯著提高了乳酸產(chǎn)量，L.plantarum在葡萄糖消耗上優(yōu)于L.brevis，L.brevis主要將木糖轉(zhuǎn)化為乳酸，由于發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生的NADH 較少，導(dǎo)致副產(chǎn)物乙醇減少。該體系L.brevis和L.plantarum連續(xù)共發(fā)酵楊樹水解液生產(chǎn)乳酸的轉(zhuǎn)化率高達0.80g/g，堿處理玉米秸稈的乳酸轉(zhuǎn)化率提高到0.78g/g，可見合理組合利用微生物之間的代謝關(guān)系，不僅可以避免多種微生物共同代謝產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，還能進一步提高產(chǎn)量。

將功能性代謝途徑整合到不同的宿主菌中，利用混菌技術(shù)共利用木糖和葡萄糖可以避開復(fù)雜的微生物代謝調(diào)控過程。Saini等[127]在梭狀芽孢菌輔酶A依賴的正丁醇合成途徑中，敲除adhE、frdA、ldhA、poxB和pta基因以保存NADH和減少碳浪費，將CCR 不敏感的菌株轉(zhuǎn)化為葡萄糖和木糖利用菌株，其中不含XylA基因的菌株BuT?8?Glu 選擇性代謝葡萄糖，而缺乏glk基因的菌株BuT?8?Xyl 選擇性利用木糖，將正丁醇合成途徑分配到兩個菌株中，建立了由兩種菌組成的共培養(yǎng)體系，兩種糖（木糖/葡萄糖質(zhì)量比2∶1）共利用發(fā)酵獲得5.20g/L正丁醇。Wen等[128]敲除Clostridium celllovorans（C.celllovorans）的醋酸激酶基因Clocel-1892 和乳酸脫氫酶基因Clocel-1533，過表達丁酸激酶基因Clocel-3674，將碳流量拉向丁酸生成。與此同時，為了提高乙醇產(chǎn)量，使用CRISPR 干擾下調(diào)了氫化酶基因Clocel-2243 的表達， 并在Clostridium beijerinckii（C.beijerinckii）中導(dǎo)入了有機酸再同化基因（ctfAB，cbei）和戊糖利用基因XylR和XylT。最終，改造后的C.celllovorans和C.beijerinckii組成的雙梭狀芽孢菌系統(tǒng)可分解83.20g/L經(jīng)堿處理的玉米芯生產(chǎn)11.50g/L 丁醇，同時產(chǎn)生4.25g/L 丙酮和6.37g/L 乙醇，為發(fā)酵木質(zhì)纖維素提供了有效的平臺。

此外，混菌技術(shù)有助于減弱水解物的毒性。Theiri 等[129]以預(yù)處理后的半纖維為底物將Ureibacillus thermosphaericus和Cupriavidus taiwanensis共培養(yǎng)解毒，再與Paenibacillus campinasensis共培養(yǎng)水解，發(fā)現(xiàn)絮凝后酚類化合物被還原。但這種解毒作用相對有限，還需采取針對性的措施才能提高脫毒效果。

4.2.3 發(fā)酵液副產(chǎn)物脫毒處理技術(shù)

底物預(yù)處理過程中一般會產(chǎn)生一些副產(chǎn)物，導(dǎo)致發(fā)酵液成分、pH 等關(guān)鍵條件改變，降低產(chǎn)量或增加產(chǎn)物分離純化難度，如酚類、糠醛、呋喃類衍生物、弱酸、堿或固形物等。研究表明，在甘蔗水解過程中會釋放乙酸和糠醛，木聚糖主鏈上的乙酰側(cè)鏈水解時，容易釋放乙酸[130]。這些副產(chǎn)物對微生物發(fā)酵具有較強的抑制作用，乙酸會使發(fā)酵液酸性增強而影響微生物細胞的生理狀態(tài)，糠醛及高濃度的呋喃類衍生物會抑制菌株生長、干擾大分子合成和糖酵解酶等[16]，從而導(dǎo)致微生物細胞活力下降，使產(chǎn)量降低。

產(chǎn)物合成過程產(chǎn)生的高濃度副產(chǎn)物也是生物發(fā)酵規(guī)?；瘧?yīng)用的一個重要制約。如發(fā)酵過程產(chǎn)生的弱酸會使發(fā)酵液的pH 降低，而混糖發(fā)酵時，木糖代謝比葡萄糖代謝對培養(yǎng)液酸度更敏感，低pH 更容易抑制木糖發(fā)酵[103]。Wu 等[103]在研究C.acetobutylicum的木糖?葡萄糖共利用過程時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)初始總糖濃度為120g/L 時，兩種糖的利用率均隨其濃度或比例的增加而增加，在pH 為6.0 時，總糖利用率基本不變，降低pH至5.0顯著降低了糖的利用率和丁酸產(chǎn)量，對木糖代謝比葡萄糖的影響更明顯。添加紫精促進乙酸的再吸收，丁酸產(chǎn)量則提高至46.40g/L、轉(zhuǎn)化率為0.43g/g。張影等[131]發(fā)現(xiàn)混糖發(fā)酵時，葡萄糖的代謝產(chǎn)物乙酸、乙醇與甲酸，三者共存時對木糖發(fā)酵表現(xiàn)出強烈的協(xié)同抑制，而單獨存在時抑制作用大大降低。因此，采取適當(dāng)?shù)牡孜镱A(yù)處理及水解液脫毒方法[22]、基因工程改造或發(fā)酵工藝改進措施等對解除產(chǎn)物和代謝中間體的抑制作用是必要的。

4.2.4 補料方式

根據(jù)料液添加時間和方式的不同，發(fā)酵方式通常分為分批發(fā)酵（BF）、連續(xù)發(fā)酵（CF）、補料分批發(fā)酵（FBF）等。FBF 因底物利用率及轉(zhuǎn)化率高、便于自動化控制、能解除產(chǎn)物反饋抑制和分解代謝物阻遏作用等優(yōu)勢而得到廣泛應(yīng)用[63,132?133]。

以木質(zhì)纖維素水解液為底物混糖發(fā)酵面臨的最大的挑戰(zhàn)是CCR，F(xiàn)BF 是解除CCR 的有效方式。Jin 等[132]在水稻秸稈補料分批半同步糖化發(fā)酵中，將酶補料（E 補料）、底物補料（SR 補料）、酶和底物組合補料（E?SR 補料）三種方式與BF 比較。結(jié)果表明：SR補料和E?SR補料乙醇產(chǎn)量較高，分別獲得116.80g/L 和118.90g/L 的乙醇，該方法有效提高了混糖利用率。Abdel?Rahman 等[63]利用木質(zhì)纖維素來源的糖借助FBF工藝得到129g/L乳酸，發(fā)現(xiàn)木糖濃度大于10g/L 時，可實現(xiàn)均質(zhì)乳酸發(fā)酵、減少副產(chǎn)物生成，更關(guān)鍵的是葡萄糖濃度低于25g/L可避免CCR。經(jīng)基因工程改造、系統(tǒng)重構(gòu)代謝路徑獲得的工程菌采用FBF的方式生產(chǎn)時，能發(fā)揮二者優(yōu)勢，最大程度地削弱CCR[88]。此外，結(jié)合兩段式發(fā)酵策略利用稀酸預(yù)處理后的玉米芯漿液生產(chǎn)木糖醇和乙醇的過程同樣消除了CCR，第一階段木糖在微曝氣條件下生產(chǎn)木糖醇，第二階段同步糖化發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇[134]。

5 結(jié)語

目前，以木質(zhì)纖維素水解液中的木糖及葡萄糖共利用發(fā)酵生產(chǎn)醇類和有機酸等化學(xué)品已經(jīng)取得許多突破性進展。但是，現(xiàn)階段的研究存在一些亟待改進的問題，例如：①菌株誘變或定向進化篩選效率較低；②能夠同時高效利用木糖和葡萄糖共發(fā)酵的菌株較少，分支代謝及副產(chǎn)物較多，基因改造及代謝調(diào)控缺乏系統(tǒng)性和全局性，未能完全解除CCR，代謝通量有待提高；③底物預(yù)處理方法復(fù)雜、易產(chǎn)生毒性物質(zhì)且脫毒困難；④產(chǎn)物分離純化成本較高、產(chǎn)量低；⑤發(fā)酵工藝適用范圍窄、反應(yīng)條件控制成本較高。

針對上述問題的優(yōu)化方向主要有：①開發(fā)高效的、選擇性好的高通量、定向菌株篩選方法；②借助合成生物學(xué)策略，利用基因工程、代謝工程、組學(xué)分析及系統(tǒng)工程等對菌株進行理性改造與設(shè)計，重構(gòu)代謝途徑，獲得發(fā)酵性能優(yōu)異的工程菌株；③使用物理、化學(xué)或生物等多種方法組合聯(lián)用的方式設(shè)計改進底物和代謝產(chǎn)物的預(yù)處理及脫毒方法；④利用材料科學(xué)與生物學(xué)交叉學(xué)科優(yōu)勢開發(fā)性能優(yōu)異的細胞固定化載體材料和固定化方法，借助菌群分析、代謝組學(xué)等科學(xué)的設(shè)計混菌生態(tài)系統(tǒng)；⑤針對不同宿主菌或產(chǎn)物分離需要個性化設(shè)計發(fā)酵工藝條件的同時兼顧工藝功能區(qū)模塊化、組合化，降低工藝設(shè)計成本。

相信通過系統(tǒng)化、全局化、科學(xué)化的設(shè)計與針對性的工程化探索，未來儲量豐富的木質(zhì)纖維生物質(zhì)會成為更加實用的可再生資源，而不是當(dāng)作廢物造成環(huán)境污染和資源浪費，以其為底物必然能夠給社會經(jīng)濟發(fā)展創(chuàng)造更多有價值的產(chǎn)品，催生更多的綠色環(huán)保產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生深遠的經(jīng)濟社會效益。