王 亮

鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，河南洛陽 471000

癲癇俗稱“羊角風”或“羊癲瘋”，是由于大腦神經(jīng)元高度同步化異常放電而導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，臨床表現(xiàn)具有發(fā)作性、短暫性、重復性和刻板性的特點。由于異常放電的起始部位、波及范圍和傳遞方式的不同，癲癇發(fā)作的臨床表現(xiàn)復雜多樣，可表現(xiàn)為發(fā)作性運動，以及感覺、自主神經(jīng)、意識、精神障礙，或兼有之。引起癲癇的發(fā)病原因多種多樣，據(jù)統(tǒng)計，中國約有900萬癲癇患者，其中500萬至600萬是活動性癲癇患者，該病已成為神經(jīng)科僅次于頭痛的第2大常見病[1]。拉莫三嗪是新型廣譜抗癲癇藥物，臨床常用于頑固性癲癇的治療?？R西平主要通過降低細胞膜對Na+、Ca2+的通透性，從而使細胞興奮性下降，并增加γ氨基丁酸的抑制功能，阻止腦部異常電位活動向周圍腦組織擴散，能阻止癲癇的發(fā)作，是臨床常用的抗癲癇藥物。奧卡西平是卡馬西平的衍生物，在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為具有生物活性的代謝產(chǎn)物單羥奧卡西平而發(fā)揮作用[2-4]。由于上述3種藥物口服吸收慢，藥物代謝易受年齡、合并用藥等因素的影響，導致治療效果不佳或產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，臨床上需要監(jiān)測藥物濃度，并根據(jù)藥物濃度進行藥物療效的評價，確定個體化給藥方案。本研究建立了簡便的高效液相色譜外標法可同時監(jiān)測上述3種藥物的血藥濃度，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與藥品、試劑 LC-2010AHT高效液相色譜儀購自日本島津公司。高速冷凍離心機5424R購自美國Eppendorf公司；大容量ST16-40離心機購自美國Thermo Fisher公司；旋渦混合器購自上海醫(yī)科大學儀器有限公司；微量加樣器購自美國Eppendorf公司；KQ-300DE數(shù)控超聲波發(fā)生器購自昆山超聲儀器有限公司；ME104E型分析天平購自梅特勒托利多集團。色譜級甲醇購自天津科密歐化學試劑有限公司。拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平標準品由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2測定條件及標本處理

1.2.1色譜條件 色譜柱：島津C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇∶水=60∶40；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；進樣量：20 μL。

1.2.2溶液配制 稱取卡馬西平、拉莫三嗪對照品各4 mg，加甲醇1 000 mL溶解，得到4 μg/mL的卡馬西平及拉莫三嗪標準液；稱取單羥奧卡西平對照品12 mg，加甲醇1 000 mL得到12 μg/mL的單羥奧卡西平標準液。標準液于4 ℃下保存。

1.2.3標本處理 取血清標本200 μL放置于1.5 mL離心管中，加入600 μL甲醇(漩渦充分混勻后加入)，15 000 r/min離心10 min，取上清液400 μL加入液相小瓶進行分析。

1.3方法學考察

1.3.1專屬性 分別取卡馬西平、拉莫三嗪、單羥奧卡西平標準溶液、服藥患者的血清，按“樣品處理”項操作，測定并記錄色譜圖。

1.3.2標準曲線 取空白血清，加入不同濃度的3種藥品標準溶液，分別配制成含有拉莫三嗪濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL，卡馬西平濃度為0.25、0.50，1.00、2.00、4.00 μg/mL，單羥奧卡西平濃度為0.75、1.50、3.00、6.00、12.00 μg/mL的標準血樣，按“樣品處理”操作，用外標法峰面積定量，測定拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平線性回歸方程。

1.3.3精密度與回收率 取人空白血清分別加入拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平標準溶液，分別配制成含拉莫三嗪濃度為0.25、1.00、4.00 μg/mL，卡馬西平濃度為0.25、1.00、4.00 μg/mL，單羥奧卡西平濃度為0.75、3.00、12.00 μg/mL的低、中、高 3個濃度質(zhì)控樣品。每種濃度平行配制5份，按“樣品處理”操作并測定，由標準曲線求出各樣品的濃度，并計算回收率。以 1 d 內(nèi)重復5次測定的每種藥物濃度計算日內(nèi)精密度，另以1周內(nèi)重復5次測定的每種藥物濃度計算日間精密度。

1.3.4穩(wěn)定性 取低、中、高濃度拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平血清質(zhì)控樣品3份，分別考察提取前室溫放置3 h，提取后4 ℃放置 24 h，—20 ℃反復3次凍融和—20 ℃冰凍放置1個月的穩(wěn)定性。

1.3.5重復性試驗 本實驗室其他工作人員按擬訂方法繪制標準曲線，得到回歸方程，分別測定5份拉莫三嗪、5份卡馬西平及5份單羥奧卡西平血樣，根據(jù)所得結(jié)果判定其重復性。

1.3.6最低檢測限確定 以信噪比S/N=3來確定拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的最低檢測限。

1.4方法學應(yīng)用 收集本院神經(jīng)內(nèi)科及兒科規(guī)律服藥癲癇患者182例，均在血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)后于早上服藥前(服藥后12 h)空腹采集血液標本進行檢測。其中單用拉莫三嗪101例，單用卡馬西平56例，單用奧卡西平14例；拉莫三嗪與卡馬西平合用6例，拉莫三嗪與奧卡西平合用5例，卡馬西平與奧卡西平合用0例；拉莫三嗪、卡馬西平及奧卡西平3種藥物合用0例。采用本文建立的方法測定患者血清中拉莫三嗪、卡馬西平及單羥奧卡西平的血藥濃度。列舉兩例長期服用拉莫三嗪的患者加以說明。患者男起始維持劑量為每次100 mg，檢測后維持劑量調(diào)整為每次75 mg；患者女起始維持劑量為每次75 mg，檢測后維持劑量調(diào)整為每次50 mg。二者均為每日服藥兩次，服藥間隔12 h。兩例患者調(diào)藥后維持治療兩周再進行檢測。監(jiān)測結(jié)果與金域公司檢驗結(jié)果進行比較。

2 結(jié) 果

2.1方法學評價結(jié)果

2.1.1專屬性驗證結(jié)果 拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平3種藥物分離效果良好，各色譜峰無重疊，峰形好，且保留時間分別為4.16、7.57、4.59 min。

2.1.2標準曲線結(jié)果 拉莫三嗪的直線回歸方程為Y=15 032.4X+22 918.4(r=0.996)，結(jié)果表明，拉莫三嗪濃度為0.25～4.00 μg/mL，與峰面積積分值線性關(guān)系良好；卡馬西平的直線回歸方程為Y=17 249.7X+52 954.8(r=0.992)，結(jié)果表明，卡馬西平濃度為0.25～4.00 μg/mL，與峰面積積分值線性關(guān)系良好；單羥奧卡西平的直線回歸方程為Y=6 268.65X+28 631.3(r=0.995)，結(jié)果表明，單羥奧卡西平濃度為0.75～12.00 μg/mL，與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度與回收率試驗結(jié)果 拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平的日內(nèi)和日間精密度均<5%，回收率均為95%～106%，見表1。

表1 拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的精密度和回收率試驗結(jié)果(n=5)

2.1.4穩(wěn)定性驗證結(jié)果 含有拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平的血樣在測試過程中和本次儲存條件下較穩(wěn)定，相對誤差(RE)均在±15%。

2.1.5重復性試驗結(jié)果 本實驗室其他工作人員按擬訂方法繪制標準曲線，得到線性回歸方程，并分別檢測5份拉莫三嗪、5份卡馬西平及5份單羥奧卡西平血樣，所得結(jié)果與本研究結(jié)果相差不大，重復性良好。

2.1.6最低檢測限確定結(jié)果 以信噪比S/N=3拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的最低檢測限分別為0.25、0.25、0.75 μg/mL。

2.2方法學應(yīng)用結(jié)果 在本院神經(jīng)內(nèi)科及兒科收集的規(guī)律服藥癲癇患者中，檢測結(jié)果大多處于正常血藥濃度或較低血藥濃度，很少出現(xiàn)不良反應(yīng)(高于正常值)。當測得患者血藥濃度低于或者超出治療藥物濃度時，告知臨床醫(yī)生改變用藥策略，使得血藥濃度回歸到藥物濃度治療窗范圍。

下面舉例說明利用本文建立的方法監(jiān)測血藥濃度的例子。

某癲癇患者，男，16歲，長期服用抗癲癇類藥物拉莫三嗪，2020年10月8日檢測血藥濃度為5.19 μg/mL，降低服藥劑量后2021年1月9日血藥濃度達到4.21 μg/mL，仍然控制在有效治療濃度范圍內(nèi)，通過本文建立的方法對患者血藥濃度的監(jiān)測使醫(yī)生和患者掌握血藥濃度，使患者在服用較少劑量藥物下仍達到有效治療濃度范圍，控制癲癇發(fā)作的同時，減少了不良反應(yīng)。

某癲癇患者，女，28歲，長期服用癲癇類藥物拉莫三嗪(有效血藥濃度范圍為3～15 μg/mL)，2021年10月8日檢測血藥濃度為9.81 μg/mL(正常高值)，降低服藥劑量后2021年11月11日血藥濃度達到8.43 μg/mL，再次降低服藥劑量后2021年12月16日血藥濃度達到了6.40 μg/mL，仍然控制在有效治療濃度范圍內(nèi)。見表2。

表2 182例服用拉莫三嗪、卡馬西平及奧卡西平患者血藥濃度監(jiān)測結(jié)果(μg/mL)

3 討 論

目前監(jiān)測拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平血藥濃度的方法有高效液相色譜(HPLC)法、熒光偏振免疫(FPIA)法[5]。FPIA法需使用試劑盒，且我國常用的試劑盒為國外進口，有效期短，對于患者不多的醫(yī)院，成本相對較高。筆者參考文獻[6-7]建立了簡便、準確的高效液相色譜外標法，可同時測定拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的血藥濃度，具有成本低、選擇性好、靈敏度高、精密度高等優(yōu)點，適合于臨床常規(guī)監(jiān)測這3種藥物的血藥濃度。

臨床應(yīng)用拉莫三嗪、卡馬西平及奧卡西平治療癲癇患者時常聯(lián)合用藥，其血藥濃度與臨床療效相關(guān)，對其進行血藥濃度監(jiān)測對于提高療效和減少不良反應(yīng)有重要意義，也應(yīng)在臨床中推薦使用。此方法在本院經(jīng)歷了兩年多的臨床應(yīng)用，當測得患者血藥濃度低于或者超出治療藥物濃度時，告知臨床醫(yī)生改變用藥策略，使得血藥濃度回歸到藥物濃度治療窗范圍，實踐證明本文提供的方法可行。

本研究方法能夠在短時間內(nèi)同時測定拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的血藥濃度，色譜峰分離度好，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，分析快速、準確、簡便，且樣品處理簡單，適用于臨床血藥濃度的檢測和藥物代謝動力學的研究。本院所收集的癲癇患者雖沒有3種藥物同時服用者，但所建立的方法可大大縮短不同藥物血藥濃度監(jiān)測中前期沖洗柱子所用時間；此外，本方法為高效液相色譜外標法，檢測準確、方便，且樣本處理過程相對簡便，為日常工作帶來方便。