李婷 程亞楠 周小平

(寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004)

人體皮膚從30歲左右開始進入衰退階段。隨著人們對皮膚衰老的深入認識與不斷探索發(fā)現(xiàn)，自然衰老皮膚角質形成細胞增殖減少，脂質和膠原合成減少〔1〕，表皮穩(wěn)態(tài)失衡。穩(wěn)態(tài)是組織器官更新時維持恒定數(shù)量細胞的生理過程〔2〕。皮膚穩(wěn)態(tài)由位于皮膚組織中干細胞的自我更新和分化維持〔3，4〕。表皮干細胞負責維持和生成成熟的表皮及其附屬器官。表皮干細胞位于皮膚不同的“龕室”，有著驚人的增殖能力。通常情況下，表皮干細胞不斷增殖、分化，以替換因正常分化和組織更新或損傷引起細胞死亡而損失的角質形成細胞，維持表皮穩(wěn)態(tài)。眾多以人或動物為模型的研究表明，衰老表皮增殖能力下降，包括在基礎刺激方面和響應增殖刺激方面，這些結果最終指向對維護表皮穩(wěn)態(tài)負責任的表皮干細胞，說明其涉及衰老過程〔5〕。本研究探討，γ分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷跨膜受體蛋白(Notch)信號通路后補益營衛(wèi)方對衰老皮膚表皮干細胞Notch信號通路Notch1、Notch配體蛋白(Jagged)1、重組信號結合蛋白(RBP)-Jκ和毛發(fā)分裂增強因子(Hes)1基因及蛋白表達水平的影響，探討補益營衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機制。

1 材料與儀器

1.1實驗材料 實驗藥物：補益營衛(wèi)方由生黃芪15 g、炙甘草7 g、人參5 g組成，購買于寧夏醫(yī)科大學附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院門診部，用水煮法制備藥物，終濃度為0.5 g生藥/ml，放置于4℃冰箱冷藏備用。實驗動物：SPF級SAMP8雄性小鼠，8月齡10只(老年組)；SPF級SAMR1雄性小鼠，3月齡10只(年輕組)，均購于北京至善健康醫(yī)學研究院有限公司，生產單位：北京華阜康生物科技股份有限公司，質量合格證號：SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心。主要試劑：0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，批號25200-072)，DAPT(MCE公司，批號HY-13027)，角質細胞無血清培養(yǎng)基(iCell公司，批號iCell-0019)，DispaseⅡ的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司，批號D4693)，聚合酶鏈反應(PCR)引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)，SYBR Permix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒(TaKaRa公司，批號DRR081S)，ReverTra Ace-α-反轉錄試劑盒(TOYOBO公司，批號FSK-100)，山羊抗兔IgG H&L(批號ab205718)、Anti-GAPDH抗體(批號ab37168)、Anti-activated Notch1抗體(批號ab8925)、Anti-Jagged1抗體(批號ab7771)、Anti-RBPJκ抗體-ChIP Grade(批號ab25949)、Anti-Hes1抗體(批號ab221788)(Abcam公司)。實驗儀器：37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，型號BC-J160S)，恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司，型號DK-600S)、電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司，型號DK-2B)，高級分析倒置顯微鏡(Nikon公司，型號DS-Ri2)，Rt-PCR儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號Applied BiosystemsTMViiA 7 Real-Time PCR System)，高速離心機(Thermo Fisher公司，型號75004250)，超高速離心機(SCILOGEX公司，型號D3024R)，Mini.P-4型電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司，型號MP-3030)。

1.2含藥血清制備 SPF級雄性SAMP8小鼠，8月齡10只，予以補益營衛(wèi)方10 g/kg連續(xù)灌胃1 w，1次/d，第8天末次給藥1 h后，腹腔注射4%水合氯醛予以麻醉，無菌操作進行心臟采血，將血液于室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取出血清，超凈工作臺無菌過濾，56℃滅活30 min，放置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同時以DMEM培養(yǎng)基稀釋為含2.5%補益營衛(wèi)方的含藥血清培養(yǎng)液。

1.3細胞分離、培養(yǎng)、傳代 頸椎脫臼處死兩組小鼠后，分別浸入75%乙醇消毒15 min，取小鼠背部整塊皮膚，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3次后，將皮膚剪成大小為0.5 cm×0.5 cm，然后浸入含0.1%中性蛋白酶Dispase Ⅱ的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中，4℃消化過夜。用鑷子分離真皮與表皮，收集表皮，制備表皮細胞懸液，用80 μm濾網過篩后用離心機以1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)上清液，然后加入2 ml表皮干細胞完全培養(yǎng)基(含0.2%角質細胞無血清培養(yǎng)基)，通過移液均勻制備成細胞，血球計數(shù)板計數(shù)，按4×104～5×104/cm2的密度將懸浮液接種在已包被基質膠的細胞培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞，每2～3 d換液，在更換液前后均在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。當細胞融合接近75%～85%時進行傳代。其中將年輕組細胞分為A組(常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))和B組(含5 μmol/L DAPT的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))；老年組細胞分為3組，C組(常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))、D組(含5 μmol/L DAPT的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))、E組(含5 μmol/L DAPT+2.5%藥物血清濃度的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))。48 h后收集細胞用熒光定量PCR法定量相應指標基因表達，用Western印跡檢測相應指標蛋白表達。

1.4實時熒光定量PCR檢測衰老小鼠表皮干細胞Notch通路被阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA表達 從GenBank下載Notch1(NM_008714.3)、Jagged1(NM_013822.5)、RBP-Jκ(NM_001080927.2)和Hes1(NM_006521797.2)mRNA序列，引物序列為：Notch1上游：5′-CAGCAAG-AAGAAGCGGAGAG-3′；下游:5′-GAGCACCATCTGAGGCATTC-3′。Jagged1上游:5′-TGGACGGAGACAA-CTGGTATC-3′；下游:5′-GGAAGACTGGCACTCATTGATG-3′。RBP-Jκ上游:5′-TTCTATGGCAACAGC-GATGAC-3′；下游:5′-GACCGAAGGCGATTGAACAG-3′。Hes1上游:5′-TCATGGAGAAGAGGCGAAGG-3′；下游:5′-CGGAGGTGCTTCACAGTCA-3′。以GAPDH為內參基因，上游:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′；下游:5′-TGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3′。采用Trizol一步法分別提取上述各組總RNA。定量后取12 μl RNA溶液，ReverTra Ace逆轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA(具體操作參照說明書)。采用Rt-PCR儀行實時熒光定量PCR。具體操作如下：反應體系：上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，模板cDNA 2 μl，ddH2O 6.4 μl，SYBR Permix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μl。反應條件：95℃、5 min，1個循環(huán)；95℃、15 s，60℃、30 s，40個循環(huán)。結果檢測：采用Bio-Rad CFX Manager(Ver3.0)軟件分析PCR過程，PCR擴增過程中擴增產物熒光信號超過基線值時的循環(huán)數(shù)即為樣本的Ct值。以GAPDH為內參基因，軟件自動得出△Ct、△△Ct及2-ΔΔCt值，由熔解曲線判斷擴增產物的特異性。

1.5Western印跡檢測衰老小鼠表皮干細胞Notch通路被阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白表達 各組提取總蛋白后進行電泳，轉膜，封閉后分別加入上述蛋白的一抗和內參GAPDH，洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗。然后加入電化學發(fā)光(ECL)試劑，化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，條帶掃描獲得灰度值，以目的基因灰度值/GAPDH灰度值作為目的基因蛋白的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1補益營衛(wèi)方對衰老小鼠表皮干細胞Notch通路阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白表達的影響 與A組相比，B組和C組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與C組比較，D組和E組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.05)；與D組比較，E組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見表1。提示DAPT阻斷Notch通路后，補益營衛(wèi)方對衰老小鼠表皮干細胞Notch通路的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白相對表達量具有明顯的抑制作用。

表1 各組表皮干細胞Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA相對表達及蛋白表達比較

2.2補益營衛(wèi)方對衰老小鼠表皮干細胞Notch通路阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白表達的影響 B組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1條帶完全不顯示，說明年輕組的4種蛋白被DAPT完全抑制表達；C組色帶均比A組深，說明隨著年齡增大，4種蛋白表達量均增加；C組、D組、E組的4種蛋白色帶依次逐漸變淺，且Notch1、Jagged1、RBP-Jκ在E組色帶接近甚至比A組淺，Hes1在E組色帶甚至和A組一樣幾乎不顯示，說明DAPT阻斷Notch通路后，補益營衛(wèi)方可以抑制衰老小鼠表皮干細胞中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白的表達，見圖1。

圖1 Western印跡檢測各組Notch1、Hes1、Jagged1、 RBP-Jκ蛋白表達

3 討 論

皮膚組織具有較強的再生能力，其外層的表皮終身不斷自我更新，而表皮干細胞的無限增殖和分化，是表皮組織結構更新的基礎。表皮干細胞在皮膚組織的自我更替及維護機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用〔6〕。當皮膚衰老時，干細胞會發(fā)生功能的異常變化及異常的增殖、分化。表皮干細胞的增殖與分化不但為自身基因所預先設置，而且會受到干細胞“壁龕”的調控〔7〕。Notch家族參與調節(jié)細胞分化、增殖、黏附、遷移及血管生成，在胚胎發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用〔8〕。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體及細胞內效應器分子CSL DNA結合蛋白(CBF-1/Suppresor of Hairless/LAG1的合稱)3部分組成〔9〕。在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)4類Notch基因，分別為Notch1～4〔10〕。其中Notch1是高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作為Notch信號通路最主要的受體之一，Notch1的表達水平與細胞增殖關系密切，且與轉錄調控因子相互作用，對細胞的最終結局有影響〔11，12〕。Hes1是Notch信號轉導靶基因之一，是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子，通過抑制p27和p21等細胞周期抑制劑，發(fā)揮促進增殖的作用〔13〕。目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)5種Notch配體：Delta-like(DLL)1、DLL3、DLL4及Jagged1、Jagged2。其中Jagged1是哺乳動物中第1個被證實的Notch受體的配體，Jagged1受體在皮膚全層均有表達〔7，14〕。細胞內效應器分子，即CSL DNA結合蛋白，在哺乳動物中稱為RBP-Jκ〔15〕，是Notch信號通路中發(fā)揮關鍵作用的轉錄調節(jié)因子。CBF-1/RBP-Jκ自身就是1個轉錄抑制因子，可以特異性地與DNA序列“CGTGGGAA”結合，并招募SMRT、SKIP、Ⅰ/Ⅱ型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种茝秃衔?，對下游基因的轉錄起到抑制作用。DAPT是一種新型的γ-分泌酶抑制劑，能夠有效抑制細胞膜表面γ-分泌酶的活性，繼而阻斷Notch信號活化過程中的S3剪切，阻止受體胞內段的產生，使Notch受體分子無法進一步轉變成有效的活性片段，是Notch信號轉導途徑的特異性阻斷劑〔16，17〕。許多研究表明，Notch信號通路在增殖分化過程中起到關鍵性作用。它參與了間質干細胞、胚胎干細胞、表皮干細胞、腫瘤干細胞等多種干細胞的分化。有文獻表明，持續(xù)表達的Hes1通過抑制DLL1及Jagged1配體抑制Notch通路，從而抑制胚胎干細胞向神經細胞分化〔18〕。Lowell等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)高水平表達Deltal的表皮干細胞，對鄰近細胞的Deltal配體不敏感，從而阻斷Notch信號的轉導，加強了干細胞簇的黏附，干細胞得以保護，同時干細胞通過自身高水平Deltal激活周邊細胞的Notch信號，使之分化成短暫擴充細胞。說明阻斷Notch通路可以維持表皮干細胞的特性，阻止其向表皮細胞分化。反之，增強Notch通路則可促進分化〔20〕。研究發(fā)現(xiàn)，Notch抑制還會減少角膜緣上皮干細胞的分化和增殖，而Notch激活可促進其分化和增殖〔21〕。

本研究結果說明，Notch信號通路中的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1表達量與表皮干細胞的分化有關，老鼠年齡越大，表皮干細胞向表皮細胞的分化越多，表明表皮干細胞的特性發(fā)生異常可能是導致皮膚衰老的原因之一；經DAPT阻斷Notch通路后，結果說明補益營衛(wèi)方可以通過降低Notch信號通路中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白表達水平，抑制表皮干細胞分化，維持表皮干細胞活性，阻止其向表皮細胞分化。《內經》認為，營衛(wèi)和諧是人體生命活動運行的基礎，與皮膚的生理病理及衰老密切相關。營衛(wèi)的盛衰是影響皮膚狀態(tài)的重要因素。補益營衛(wèi)方中人參補營衛(wèi)之氣；生黃芪益氣固衛(wèi)，炙甘草益氣調和諸藥，三藥合用，共奏補益營衛(wèi)之功。研究發(fā)現(xiàn)，補益營衛(wèi)方可以抑制衰老皮膚表皮細胞的凋亡〔22〕，提高表皮干細胞活性，對衰老皮膚表皮穩(wěn)態(tài)有促進作用〔23〕。

綜上，補益營衛(wèi)方聯(lián)合DAPT可以有效抑制Notch通路的活性，而抑制Notch信號通路有利于延緩皮膚衰老。補益營衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機制很可能與有效抑制衰老皮膚表皮干細胞Notch信號通路中的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白表達水平密切相關。