李琳琳，王超群，李春霞，駱 凱，王紅剛，陳銀華，張肖飛，耿夢婷*

1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2.國際熱帶農(nóng)業(yè)中心，哥倫比亞卡利 AA 6713

植物在生長發(fā)育過程中面臨生物脅迫和非生物脅迫，為了應(yīng)對脅迫以維持正常生長，植物進化出了許多抵御逆境的機制[1]。其中熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat stress transcription factors, Hsfs）是該防御體系中響應(yīng)逆境信號的重要元件[2]。研究表明Hsfs參與了高溫、干旱、鹽脅迫和氧化損傷等逆境的調(diào)控，在植物抵御非生物脅迫過程中有重要作用[3-4]。在擬南芥中過量表達大白菜BrHsf16基因，可明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在熱脅迫下的存活率[5]。沉默辣椒CaHsfa1d基因，導(dǎo)致植株耐熱性降低[6]。過量表達熱激轉(zhuǎn)錄因子GmHsFA1的大豆植株在受到干旱逆境脅迫下，脯氨酸、可溶性糖含量明顯增高，植株的抗干旱性增強[7]。擬南芥AtHsfA7b可調(diào)控下游抗逆相關(guān)靶基因表達響應(yīng)鹽脅迫，通過降低細胞失水率、調(diào)節(jié)滲透勢來提高植株耐鹽性[8]。用H2O2處理水稻種子，發(fā)現(xiàn)水稻中多個OsHsfs表達量增加，在抵抗氧化脅迫等方面發(fā)揮重要作用[9]。同時，Hsfs在作物響應(yīng)病害脅迫過程中也起著重要作用。水稻白葉枯病是由黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）引起的病害，分別對水稻抗病品種‘SH5’和感病品種‘8411’接種黃單胞桿菌，6 h后OsHsfA2a、OsHsfA2b、OsHsfB2a、OsHsfB2b、OsHsfB2c、OsHsfC1b和OsHsfC2c表達量顯著上調(diào)，OsHsfA2c和OsHsfB4c表達量顯著下調(diào)，這說明Hsfs在抵御病害侵染時發(fā)揮了作用[10]。過表達AtHsfA1b的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株在接種病原菌Pto DC3000進行抗性實驗證明，過表達植株的細菌數(shù)目顯著低于野生型，AtHsfA1b正調(diào)控擬南芥對Pto DC3000的抗病性[11]。

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科木薯屬多年生灌木，是世界三大薯類作物之一[12]。木薯塊根肉質(zhì)，富含淀粉，以之為基礎(chǔ)的食品和生物能源等產(chǎn)業(yè)是熱區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要組成部分[13]。木薯細菌性枯萎?。╟assava bacterial blight, CBB）是由菜豆黃單胞菌屬木薯細菌性枯萎病致病種（Xanthomonas phoseolipv.manihotis,Xpm）引起的病害，是影響我國木薯生產(chǎn)的重要病害之一。前人研究報道Xpm病原菌侵染木薯后，MeWRKY79和MeHsf20基因被誘導(dǎo)表達，MeWRKY79和MeHsf20轉(zhuǎn)錄因子可分別結(jié)合褪黑素合成基因MeASMT2啟動子上的W-box和HSE元件來激活MeASMT2表達，調(diào)控褪黑素的合成積累，增強木薯對Xpm病原菌的抗性[14]。木薯 MeHsf3可提高水楊酸信號途徑基因MeEDS1和MePR4的轉(zhuǎn)錄水平，參與木薯抵御Xpm病原菌的侵染[15]。

本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，我國木薯主栽品種‘SC8’在受到XpmHN11病原菌侵染時，熱擊蛋白轉(zhuǎn)錄因子MeHsfB3a的表達量顯著上調(diào)。為了進一步驗證MeHsfB3a在抵御木薯細菌性枯萎病中發(fā)揮的作用，本研究從‘SC8’木薯cDNA中克隆了MeHsfB3a全長序列，進行了生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR技術(shù)分析了該基因在木薯不同器官中的表達模式，并驗證了MeHsfB3a的表達受XpmHN11病原菌誘導(dǎo)；采用病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技術(shù)沉默MeHsfB3a，驗證了MeHsfB3a參與木薯對木薯細菌性枯萎病抗性抗病功能，為木薯抗病育種提供新的抗性基因。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：本研究采用的木薯品種為‘華南8號’（‘SC8’），采自于海南大學(xué)木薯種質(zhì)資源圃。煙草本生煙由本實驗室提供。

質(zhì)粒和菌株：VIGS沉默載體 pCsCMV-NC質(zhì)粒由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所周鵬老師課題組贈與。大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101、木薯細菌性枯萎病菌（Xanthomonas phoseolipv.manihotisHN11,XpmHN11）由本實驗室分離獲得。

試劑：LA Taq?高保真酶購于TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶購于NEB公司，TRIzol Reagent購自 Invitrogen公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自 TaKaRa公司，Nimble cloning試劑盒購自海南壹田生物科技公司，質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒等均購自北京艾德萊生物科技公司。

引物：本實驗的引物均由生工生物科技（上海）有限責(zé)任公司合成，引物序列如見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1MeHsfB3a基因的克隆 采用TRIzol法提取‘SC8’木薯總RNA，用微量分光光度計檢測提取的總RNA濃度和純度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量。采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于基因擴增。根據(jù)木薯基因組數(shù)據(jù)庫phytozome中獲得的MeHsfB3a（Manes.09G02-0300.1）序列信息，采用Premier 5.0軟件設(shè)計擴增引物MeHsfB3a-F、MeHsfB3a-R。以cDNA為模板進行PCR擴增，克隆木薯MeHsfB3a基因編碼區(qū)序列。反應(yīng)體系為：TaKaRa LATaq0.2 μL，10×LA PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各 0.5 μL，模板 2 μL，加 ddH2O 補至20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min循環(huán) 35次；72℃延伸10 min。用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒回收目的片段，連接pEASY-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取陽性單克隆進行菌落PCR檢測，送生工生物科技（上海）有限責(zé)任公司進行測序后用質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取pEASY-Blunt-MeHsfB3a質(zhì)粒。

1.2.2 MeHsfB3a生物信息學(xué)分析 將測序得到的片段序列與預(yù)測的MeHsfB3a基因編碼區(qū)序列進行比對，確定擴增的序列的正確性。MeHsfB3a蛋白的理化性質(zhì)如氨基酸數(shù)、分子式、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和平均親水系數(shù)由在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）進行預(yù)測。運用 GSDS（Gene Structure Display Server）在線網(wǎng)站分析MeHsfB3a外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。采用 Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線軟件對MeHsfB3a蛋白進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.3MeHsfB3a基因的表達分析 設(shè)計MeHsfB3a進行qRT-PCR實驗的引物：qRT-MeHsf-B3a-F、qRT-MeHsfB3a-R，以木薯新葉、成熟葉、頂芽、葉柄、塊根、韌皮部、須根為模板進行該基因表達的組織特異性分析，分別以接種了10 mmol/L MgCl2和XpmHN11病原菌不同時間點（0、3、6 h和1、3、6 d）的cDNA為模板進行qRT-PCR，分析MeHsfB3a是否響應(yīng)病原菌侵染。qRT-PCR反應(yīng)體系為：TB Green Premix ExTaqⅡ（2×） 10 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，加ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；40個循環(huán)包括95℃變性 5 s，58℃退火 30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，以EF1α為參照基因。采用2-ΔΔCT法計算基因表達值。

1.2.4MeHsfB3a的VIGS載體構(gòu)建與侵染‘SC8’木薯 采用在線軟件 SGN VIGS Tool（https://vigs.solgenomics.net/）設(shè)計誘導(dǎo)MeHsfB3a的沉默靶基因片段。以 1.2.1獲得的pEASY-Blunt-MeHsfB3a質(zhì)粒為模板，特異性引物VIGS-MeHsfB3a-F、VIGS-MeHsfB3a-R擴增靶標(biāo)片段，采用 Nimble cloning試劑盒構(gòu)建pCsCMV-MeHsfB3a重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101，挑取陽性單克隆于含卡那霉素和利福平（濃度均為50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，菌液渾濁后4000 r/min，5 min收集菌體，用10 mmol/L MgCl2清洗菌體2次，加重懸液：1 mol/L MES（嗎啉乙磺酸）+1 mol/L MgCl2+200 mmol/L AS（乙酰丁香酮）重懸菌體并調(diào)整OD600=0.75，每個處理組設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3株，每株選擇4片發(fā)育健康的葉片，用1 mL注射器將懸浮菌液注射進木薯每片裂葉背部主葉脈兩側(cè)，每片葉注射8個孔，每個孔注射約10 μL。以含有CsCMV病毒全序列和指示基因ChlI沉默靶點的重組質(zhì)粒pCsCMV-B+為正對照。ChlI是組成鎂螯合酶的亞基之一，是催化葉綠素生物合成的第一步，沉默ChlI可導(dǎo)致植株出現(xiàn)白化退綠表型。僅含有CsCMV病毒全序列的質(zhì)粒pCsCMV-A-為負(fù)對照。侵染后45 d，正對照葉片出現(xiàn)白化退綠表型，分別提取負(fù)對照組和實驗組木薯新葉總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測目的基因表達量。

1.2.5XpmHN11病原菌侵染VIGS沉默植株的抗病功能鑒定 從-80℃冰箱中取出保存的XpmHN11，劃線培養(yǎng)于 LPGA固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng) 2 d；蘸取長出的單克隆菌落于500 μL的LPGA液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)20 h左右；吸取渾濁的菌液200 μL，并用涂布棒均勻涂到LPGA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h左右，10 μmol/L MgCl2洗下菌體，放置在50 mL離心管中；4000 r/min離心5 min收集菌體，用 10 μmol/L MgCl2洗菌 2 次，再用 10 μmol/L MgCl2重懸，調(diào)OD600=0.1。使用1 mL注射器將XpmHN11菌液注射到MeHsfB3a沉默植株新葉的葉脈兩側(cè)，選擇4片葉片，每片裂葉注射4個孔，每個孔注射約 10 μL，注射后做上標(biāo)記。木薯葉片侵染XpmHN11后，分別取0、3、6 d的葉片樣品，觀察水漬狀病斑的擴散情況并拍照記錄，使用ImageJ軟件計算病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeHsfB3a基因的克隆

以‘SC8’木薯 cDNA為模板，PCR克隆MeHsfB3a基因全長，獲得了大小約為750 bp的目的片段（圖1）。將該片段純化、回收并連接中間載體 pEASY-Blunt，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得陽性克隆進行測序分析。結(jié)果表明擴增得到的MeHsfB3a片段大小為729 bp，編碼242個氨基酸。

圖1 MeHsfB3a基因克隆Fig.1 Cloning of MeHsfB3a

2.2 MeHsfB3a的生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站 ExPASy分析木薯 MeHsfB3a蛋白的生理生化性質(zhì)。結(jié)果顯示 MeHsfB3a蛋白理論分子式：C1224H1934N350O383S9，理論相對分子質(zhì)量（Mw）為27.9 kDa，理論等電點pI為7.59。該蛋白富含：谷氨酸 Glu（10.0%）、亮氨酸 Leu（9.1%）、賴氨酸 Lys（8.7%）、絲氨酸 Ser（8.3%）、精氨酸（7.5%）、蘇氨酸（6.6%）、天冬酰胺 Asn（5.8%）。親水指數(shù)從-2.744到2.222（負(fù)值表示親水性，正值表示疏水性），親水性平均指數(shù)-0.880，表明該蛋白水溶性較好（圖2）。理論不穩(wěn)定系數(shù)為56.86，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂溶指數(shù)為65.98。利用GSDS在線網(wǎng)站分析MeHsfB3a基因的結(jié)構(gòu)特點，結(jié)果顯示，該基因含有2個外顯子和 1個內(nèi)含子。利用在線網(wǎng)站 Plant-mPLoc SEfvEf預(yù)測MeHsfB3a蛋白可能定位于細胞核。

圖2 木薯MeHsfB3a蛋白親水性分析Fig.2 Hydrophilicity analysis of cassava MeHsfB3a

2.3 MeHsfB3a基因的表達模式分析

采用qRT-PCR技術(shù)對MeHsfB3a基因在木薯新葉、成熟葉、頂芽、葉柄、塊根、韌皮部、須根的表達量進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeHsfB3a基因在成熟葉的表達量最高，約為新葉的45倍，其次為須根、葉柄，在其他部位中的表達極低（圖3A）。木薯‘SC8’葉片接種了XpmHN11病菌0、3、6 h和1、3、6 d后，以接種了10 mmol/L MgCl2的木薯葉片為對照，提取葉片RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行MeHsfB3a基因表達量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種1 d后該基因的表達量急劇升高，其中在6 d時，表達量提高了60倍。這說明MeHsfB3a基因的表達受XpmHN11病菌的誘導(dǎo)（圖3B）。

圖3 MeHsfB3a基因表達模式Fig.3 Expression pattern of MeHsfB3a

2.4 VIGS沉默驗證MeHsfB3a參與木薯對細菌性枯萎病抗病過程

2.4.1 VIGS沉默效果分析 接種VIGS實驗的正對照pCsCMV-B+載體，在侵染45 d后，木薯新葉出現(xiàn)了白化退綠現(xiàn)象，而負(fù)對照 pCsCMV-A-與pCsCMV-MeHsfB3a重組質(zhì)粒的葉片無變化，這表明pCsCMV-NC系統(tǒng)已經(jīng)對木薯內(nèi)源的ChlI基因產(chǎn)生了沉默（圖4）。提取實驗組 pCsCMVMeHsfB3a和負(fù)對照 pCsCMV-A-的木薯新葉的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測目的基因沉默效率。每組數(shù)據(jù)來自3個生物學(xué)重復(fù)（3株），結(jié)果如圖（圖5），與負(fù)對照植株相比，沉默植株新葉中的MeHsfB3a表達量下降了68.26%~82.44%，說明MeHsfB3a基因在新葉受到了有效沉默，可以對新葉進行后續(xù)抗性實驗。

圖4 VIGS試驗后木薯葉片表型變化Fig.4 Phenotypic changes of cassava leaves after VIGS test

圖5 VIGS沉默MeHsfB3a的效果檢測Fig.5 Detection of target gene expression after VIGS

2.4.2 VIGS沉默植株抗病性檢測 為了驗證MeHsfB3a在木薯抗細菌性枯萎病過程中的功能，本研究將病原菌XpmHN11接種至MeHsfB3a沉默植株（pCsCMV-MeHsfB3a）和負(fù)對照植株（pCsCMV-A-）新葉葉片。在接種 3 d時，MeHsfB3a沉默植株和負(fù)對照植株葉片均出現(xiàn)水漬狀病斑，但是MeHsfB3a沉默植株的病斑擴散面積較大。接種6 d時，MeHsfB3a沉默植株的病斑進一步擴大，而負(fù)對照植株病斑緩慢擴大（圖6A）。

為了使病斑面積具體量化，采用ImageJ軟件計算接種病原菌3 d和6 d后的病斑面積，并制作柱狀圖進行顯著性分析。在接種3 d時，MeHsfB3a沉默植株的病斑面積是負(fù)對照植株的 2.22~2.38倍；在接種6 d時，MeHsfB3a沉默植株的病斑面積是負(fù)對照植株的1.86~2.28倍（圖6B）。此結(jié)果表明，沉默了MeHsfB3a基因后，木薯對XpmHN11病原菌的敏感性增加。

圖6 XpmHN11侵染后不同時間點植株的抗性分析Fig.6 Phenotypes ofXpmHN11 infected leaves at different time points

3 討論

植物 Hsfs不僅通過特異地結(jié)合熱激蛋白（heat shock protein, Hsp）基因啟動子上的熱擊響應(yīng)元件（heat shock element, HSE），調(diào)控Hsp基因的表達，增強植物的耐熱性，還可以調(diào)控許多抗逆基因的表達，提高植物抵御生物及非生物脅迫的能力[16]。Hsfs由多個基因家族編碼，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度保守，根據(jù)不同的保守結(jié)構(gòu)域可分為HsfA、HsfB、HsfC三類[17]。HsfA亞家族在熱、干旱、鹽和氧化損傷反應(yīng)中的功能已經(jīng)有很多研究報道，然而對HsfB、HsfC家族的了解還較少。最近的研究表明，HsfB和HsfC家族在植物對生物和非生物脅迫的反應(yīng)中也具有重要的作用。過量表達OsHsfB2b的轉(zhuǎn)基因粳稻脯氨酸含量下降，導(dǎo)電率上升，植株抗旱性下降[18]。5℃低溫處理水稻，水稻 HsfA族和 C族成員表達量上調(diào)，B族成員表達量下降[19]。低溫條件下甘藍BraHsfC039的表達量上升，小麥過量表達TaHsfC3后，在低溫處理時可承受更長時間[20]。

本研究通過RT-PCR從感病品種‘SC8’基因組中擴增獲得 HsfB家族基因：MeHsfB3a，該基因全長為729 bp，編碼289個氨基酸，含有2個外顯子和 1個內(nèi)含子。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，MeHsfB3a預(yù)測定位于細胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的定位特征。通常HsfB族編碼的蛋白缺少轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，可能對靶基因的轉(zhuǎn)錄起抑制作用。擬南芥AtHsfB1和 AtHsfB2b定位于細胞核直接抑制AtHsfA2、AtHsfA7a、AtHsfB1和AtHsfB2b的表達[21]。Hsfs在植物的不同器官中表達模式具有差異，如玉米ZmHsf06在根中表達量較高[22]，而ZmHsf12在新葉中表達量高[23]。表達分析顯示MeHsfB3a在成熟中表達量最高，在其他器官中的表達量較低。有研究發(fā)現(xiàn)木薯MCOL1522品種在細菌性枯萎病菌株XamORST4侵染時MeHsfB3a基因表達量上調(diào)[24]。因此，推測MeHsfB3a可能在木薯抵御細菌性枯萎病過程中發(fā)揮作用，但該研究并未克隆MeHsfB3a基因序列并驗證該基因的功能。本研究將在海南分離得到的菌株XpmHN11接種于‘SC8’木薯葉片發(fā)現(xiàn)MeHsfB3a的表達被病原菌侵染激活，最高達到 60倍，表明該基因參與‘SC8’木薯對細菌性枯萎病病原菌的響應(yīng)過程。前人的研究發(fā)現(xiàn)，木薯的其他Hsf家族基因成員也同樣受細菌性枯萎病病原菌侵染的誘導(dǎo)。MeHsf3在Xpm病原菌侵染木薯SC124葉片6 h后，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了8倍[15]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）是一種方便有效的反向遺傳學(xué)技術(shù)，可以通過構(gòu)建重組病毒載體來沉默植物體內(nèi)的目的基因。目前已經(jīng)開發(fā)了多種植物病毒載體，可以對植物各個組織的基因進行沉默[25]。其中由煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介導(dǎo)的VIGS體系對宿主影響較小，因此應(yīng)用最為廣泛。WEI等[14]在 2017年利用 TRV介導(dǎo)的沉默體系對木薯MeHsf20和MeWRKY79進行了沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默了MeWRKY79和MeHsf20的植株中褪黑素合成相關(guān)基因MeASMT2的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，導(dǎo)致褪黑素減少，植株抗病性降低。LI等[26]在2017年同樣以TRV介導(dǎo)的沉默體系誘導(dǎo)沉默木薯 bZIP轉(zhuǎn)錄因子中的MebZIP3和MebZIP5，沉默效率分別達到了50%和 40%，接種木薯細菌性枯萎病病原菌后，沉默植株表現(xiàn)出疾病敏感表型、防御相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平降低、胼胝質(zhì)沉積減少，說明了MebZIP3和MebZIP5正調(diào)控木薯細菌性枯萎病。最近TUO等[27]成功利用木薯普通花葉病毒（CsCMV）開發(fā)了適用于木薯的新型VIGS系統(tǒng)pCsCMV-NC。本研究利用pCsCMV-NC介導(dǎo)的VIGS技術(shù)沉默木薯MeHsfB3a基因，實時熒光定量結(jié)果顯示實驗組MeHsfB3a基因表達量均降低了68.26%~82.44%，這說明MeHsfB3a基因已經(jīng)受到了顯著沉默。用XpmHN11病原菌接種MeHsfB3a基因沉默木薯植株，發(fā)現(xiàn)木薯對細菌性枯萎病的抗病能力顯著降低?；谝陨辖Y(jié)果，本研究證明了熱擊蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因MeHsfB3a受XpmHN11病原菌誘導(dǎo)表達，參與木薯抗細菌性枯萎病的過程。在未來的研究工作中，本實驗室將利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，過量表達MeHsfB3a進一步驗證該基因的抗病功能，并解析 MeHsfB3a轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游抗病通路。