鄭婉茹，丁凱旋，陸小花，李琳琳，王超群，陳銀華，姚 遠(yuǎn)，陳 新*，耿夢婷*

1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2.海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用國家重點(diǎn)實驗室培育基地，海南海口570228；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南海口 571101；4.海南省種子總站，海南?？?571100

木薯（Manihot esculentaCrantz）根部膨大形成富含淀粉的儲藏根，淀粉含量約占干質(zhì)量的70%~80%，占鮮質(zhì)量的20%~30%[1]，是全球第六大糧食作物，與馬鈴薯、紅薯并列為世界三大薯類作物，也是我國重要的工業(yè)和生物能源原料[2]。參與淀粉生物合成的酶包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase），淀粉合酶（starch synthase, SS），淀粉分支酶（starch branching enzyme, SBE）及去分支酶（starch debranching enzyme, DBE）等四大類[3]。AGPase是淀粉合成的關(guān)鍵酶和限速酶，其催化G-1-P和ATP生成淀粉生物合成的底物ADPG和PPi[4]。AGPase酶活性是影響淀粉類作物產(chǎn)量的重要因素。

AGPase酶由大亞基和小亞基構(gòu)成。木薯MeAGPS1a基因編碼的小亞基是 AGPase的催化中心。實驗室前期研究表明生長素響應(yīng)因子MeSAUR1作為轉(zhuǎn)錄因子，可結(jié)合MeAGPS1a基因翻譯起始位點(diǎn)上游-201~400 bp的啟動子區(qū)，正調(diào)控MeAGPS1a基因的表達(dá)[5]。SAUR（small auxin-up RNA）是生長素響應(yīng)因子之一，也是最大的一類生長素反應(yīng)因子，在大多數(shù)植物中約有60~140個基因[6]。本實驗室通過酵母雙雜交篩選木薯 cDNA文庫，結(jié)果顯示鈣調(diào)素類似蛋白MeCML24為 MeSAUR1的候選互作蛋白（未發(fā)表）。鈣調(diào)素類似蛋白（CaM-like, CML）是一類重要的鈣信號傳感蛋白，具有植物發(fā)育、逆境脅迫反應(yīng)、離子吸收、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)功能。為了確定木薯的MeCML24是否與MeSAUR1存在互作關(guān)系，本研究克隆了MeCML24基因，通過酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)實驗、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實驗進(jìn)行互作驗證；利用雙熒光素酶實驗分析MeCML24參與MeSAUR1對MeAGPS1a基因表達(dá)的調(diào)控功能。揭示木薯 MeCML24和MeSAUR1協(xié)同調(diào)控MeAGPS1a基因表達(dá)的功能，有利于進(jìn)一步了解木薯塊根淀粉積累過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為木薯分子育種提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

‘SC8’木薯（Manihot esculentaCrantz）、煙草本生煙（Nicotiana benthamiana）由本實驗室提供；大腸桿菌菌株 Trans5α、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101（pSoup-p19）購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，酵母菌株AH109由本實驗室提供；酵母雙雜交載體質(zhì)粒 pGBKT7-laminc、pGADT7-LargeT、pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-MeSAUR1、pGBKT7-p53；雙分子熒光互補(bǔ)載體 pNC-BiFCEnc及 pNC-BiFC-Ecc、雙熒光素酶實驗載體CaMV35S::MeSAUR1-MeAGPS1a pro::LUC 和MeAGPS1a pro::LUC均由海南大學(xué)生物資源可持續(xù)利用生物重點(diǎn)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1MeCML24基因的克隆及生物信息學(xué)分析根據(jù)phytozome數(shù)據(jù)庫中獲得MeCML24蛋白的編碼基因信息，采用 Premier 5.0軟件設(shè)計MeCML24基因的克隆及酵母雙雜交驗證引物（表1），在上海生工生物技術(shù)公司合成。以‘SC8’木薯 cDNA為模板，采用 RT-PCR方法擴(kuò)增MeCML24基因的編碼區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系如下：PrimerSTART Mix 25 μL，10 mmol/L 上下游引物各2 μL，木薯cDNA 2 μL，去離子水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)包括98℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、凝膠回收試劑盒切膠回收，送深圳華大基因科技有限公司測序，分析MeCML24基因序列。利用ExPASy軟件分析木薯MeCML24的生理生化性質(zhì)，利用SOPMA軟件分析MeCML24蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers for this study

1.2.2 MeSAUR1與MeCML24蛋白的酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗證 采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI，雙酶切pGBKT7（BD）空載質(zhì)粒，純化回收載體框架，用T4 DNA連接酶將MeCML24克隆到BD載體上，構(gòu)建BD-MeCML24載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行單克隆菌落PCR，篩選陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司測序進(jìn)一步驗證。提取測序正確的BD-MeCML24質(zhì)粒與 AD空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn) AH109酵母菌株，并在 SD/TL，SD/TLHA，SD/TLHA+x-α-gal培養(yǎng)基平板上，檢測MeCML24蛋白是否具有自激活活性。將 BD-MeCML24質(zhì)粒和AD-MeSAUR1質(zhì)粒共轉(zhuǎn) AH109酵母菌株，在SD/TL、SD/TLHA 和 SD/TLHA+x-α-gal培養(yǎng)基平板上生長，驗證MeSAUR1與MeCML24蛋白的互作關(guān)系。酵母雙雜陽性對照為共轉(zhuǎn) AD-largeT和BD-p53的AH109酵母菌株、陰性對照為共轉(zhuǎn)AD-largeT和BD-laminc的AH109酵母菌株。

1.2.3 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實驗進(jìn)行植物體內(nèi)驗證 使用 PrimerSTART 高保真酶，以 1.2.1獲得的MeCML24基因編碼區(qū)為模板，PCR擴(kuò)增MeCML24基因，通過同源重組的方式將MeSAUR1克隆到pNC-BiFC-Enc載體，MeCML24克隆到pNC-BiFC-Ecc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)，進(jìn)行菌落PCR檢測，挑選陽性克隆并送深圳華大基因科技有限公司測序驗證。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒 pNC-BiFC-Enc-MeSAUR1和 pNCBiFC-Ecc-MeCML24分別轉(zhuǎn)化 GV3101（pSoupp19）農(nóng)桿菌菌株，注射侵染生長30 d本氏煙草葉片。避光培養(yǎng)3 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察侵染葉片是否產(chǎn)生YFP 熒光。

1.2.4 MeSAUR1和 MeCML24互作對MeAGPS1a基因的調(diào)控效應(yīng) 本實驗室前期已構(gòu)建了雙熒光素酶實驗載體 CaMV35S::MeSAUR1-MeAGPS1a pro::LUC（簡化命名為MeSAUR1-pMeAGPS1a）和MeAGPS1a pro::LUC（簡化命名為pMeAGPS1a），驗證了MeSAUR1對MeAGPS1a基因啟動子的正調(diào)控功能。本研究使用PrimerSTART高保真酶擴(kuò)增MeCML24基因?；厥諗U(kuò)增片段，通過同源重組的方式將MeCML24克隆到 CaMV35S::MeSAUR1-MeAGPS1a pro::LUC質(zhì)粒中MeSAUR1基因的下游，形成CaMV35S::MeSAUR1-T2A-MeCML24-MeAGPS1 apro::LUC（簡化命名為MeSAUR1-MeCML24-pMeAGPS1a）載體（圖1）。2個基因之間通過T2A短肽連接。在蛋白翻譯過程中T2A連接的2個蛋白可以被分割成2個獨(dú)立的蛋白，因此可以共表達(dá) MeSAUR1及 MeCML24。將分別攜帶MeSAUR1-MeCML24-pMeAGPS1a、MeSAUR1-pMeAGPS1a和pMeAGPS1a載體的農(nóng)桿菌GV3101（pSoup-p19）侵染本氏煙草葉片，利用Pierce? Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。

圖1 雙熒光素酶載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of double luciferase vector construction

2 結(jié)果與分析

2.1 MeCML24基因的克隆

根據(jù) phytozome數(shù)據(jù)庫中獲得的MeCML24信息（基因組編號：Manes.01G116700），以‘SC8’木薯品種的cDNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增MeCML24基因的編碼區(qū)（圖2）。經(jīng)測序分析，MeCML24（基因組編號：Manes.01G116700）的編碼區(qū)長度為492 bp，可編碼163個氨基酸。

圖2 PCR擴(kuò)增MeCML24基因Fig.2 PCR amplification of MeCML24

2.2 MeCML24的生物信息學(xué)分析

2.2.1 MeCML24的理化性質(zhì)分析 利用 ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件對木薯MeCML24蛋白的生理生化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白的理化分子式為 C768H1227N211O265S13，氨基酸數(shù)量為163，分子量為18 073.23 Da，原子總數(shù)為2484，理論等電點(diǎn)pI值約為4.38。MeCML24蛋白富含天冬氨酸Asp（13.5%），甘氨酸Gly（11.7%），賴氨酸Lys（8.0%），異亮氨酸Ile（7.4%），亮氨酸Leu（7.4%），谷氨酸Glu（6.7%）。MeCML24蛋白帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為33，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為19，脂溶指數(shù)為70.55，不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為30.80，表明該蛋白質(zhì)歸類為穩(wěn)定蛋白。MeCML24蛋白親水性總平均值為-0.569（負(fù)值表示親水性，正值表示疏水性）（圖3），表明該蛋白親水性較高。采用TMHMM Server軟件進(jìn)行跨膜分析發(fā)現(xiàn)，MeCML24沒有跨膜結(jié)構(gòu)，因此該蛋白不屬于跨膜蛋白。

圖3 木薯MeCML24蛋白親水性分析Fig.3 Hydropilia analysis of MeCML24 from cassava

2.2.2 MeCML24的蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線工具分析預(yù)測 MeCML24蛋白的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明MeCML24蛋白的結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（alpha helix）占52.76%，含有86個氨基酸，無規(guī)則卷曲（random coil）占30.06%，含有49個氨基酸，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（beta turn）占11.04%，含有18個氨基酸，延伸鏈（Extended strand）占6.13%，含有10個氨基酸（圖4）。

圖4 木薯 MeCML24 的蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Protein secondary structure analysis of MeCML24 from cassava

2.3 MeSAUR1與MeCML24的酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗證

將pGBKT7（BD）載體與MeCML24連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，構(gòu)建酵母雙雜交載體BD-MeCML24。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，目的條帶單一，且大小與預(yù)期一致（圖5）。陽性克隆菌液送深圳華大基因科技有限公司測序，證明MeCML24已成功構(gòu)建至 pGBKT7載體。提取BD-MeCML24載體質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)酵母進(jìn)行自激活分析及酵母雙雜交驗證實驗。

在酵母雙雜交實驗前，利用構(gòu)建成功的BD-MeCML24載體進(jìn)行自激活檢測。在SD/TL平板上實驗組酵母菌（共轉(zhuǎn)AD+BD-MeCML24）和對照組酵母菌（陽性對照AD-largeT+BD-p53、陰性對照AD-largeT+BD-laminc）均能正常生長，在SD/TLHA平板上只有陽性酵母生長，且在SD/TLHA+x-a-gal平板上陽性酵母菌落變藍(lán)，實驗組和陰性對照不生長。此結(jié)果表明候選互作蛋白MeCML24不具有自激活活性（圖6）。

圖6 MeCML24的自激活檢測Fig.6 Self-activation test of MeCML24

在 MeCML24沒有自激活的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步通過酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)實驗，驗證MeSAUR1與 MeCML24是否存在互作關(guān)系。將AD-MeSAUR1+BD-MeCML24共轉(zhuǎn) AH109酵母菌，接著將轉(zhuǎn)基因酵母菌分別于SD/TL、SD/TLHA和SD/TLHA+x-α-gal培養(yǎng)基平板上生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有陰性對照酵母菌（AD-largeT+BD-laminc）在SD/TLHA平板上不生長，AD-MeSAUR1+BD-MeCML24酵母菌株和陽性對照菌（AD-largeT+BD-p53）均能生長，并且在 SD/TLHA+x-α-gal平板上的酵母菌落會變藍(lán)。此結(jié)果表明，MeCML24候選蛋白與MeSAUR1蛋白存在互相作用（圖7）。

圖7 酵母雙雜交驗證Fig.7 Validation of yeast two-hybrid system

2.4 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）體內(nèi)驗證MeSAUR1與MeCML24互作關(guān)系

由于酵母雙雜交實驗存在一定的假陽性可能性，本研究采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC）進(jìn)一步鑒定MeSAUR1與MeCML24的互作關(guān)系。將MeSAUR1克隆到pNC-BiFC-Enc載體上，構(gòu)建pNC-BiFC-Enc-MeSAUR1載體，融合表達(dá)MeSAUR1-nEYFP蛋白；將MeCML24克隆到pNC-BiFC-Ecc載體上，構(gòu)建 pNC-BiFC-Ecc-MeCML24，融合表達(dá)MeCML24-cEYFP蛋白。如果MeSAUR1與MeCML24互作，黃色熒光蛋白EYFP的N端區(qū)域（nEYFP）和C端區(qū)域（cEYFP）將在空間上相互靠近互補(bǔ)，恢復(fù)EYFP的功能。將攜帶 pNC-BiFC-Enc-MeSAUR1載體和 pNCBiFC-Ecc-MeCML24載體的農(nóng)桿菌混合注射煙草，72 h后在激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光蛋白 EYFP的發(fā)光情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeSAUR1與MeCML24互作，在煙草細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上有黃色熒光信號；對照組在相同條件下沒有熒光信號（圖8）。

圖8 煙草BiFC驗證MeSAUR1與MeCML24蛋白互作Fig.8 Bimolecular fluorescence complementation assays for MeSAUR1-MeCML24 interaction in tobacco leaves

2.5 雙熒光素酶實驗分析 MeSAUR1與MeCML24互作對 MeAGPS1a 基因表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)

構(gòu)建雙熒光素酶載體MeSAUR1-MeCML24-pMeAGPS1a，該載體可以共表達(dá) MeSAUR1和MeCML24蛋白，以分析這 2個蛋白互作對pMeAGPS1a啟動子活性的影響。采用2個對照載體：pMeAGPS1a載體是僅有pMeAGPS1a啟動子的雙熒光素酶載體，用于分析該啟動子的本底表達(dá)；MeSAUR1-pMeAGPS1a載體可表達(dá)MeSAUR1蛋白，正調(diào)控pMeAGPS1a啟動子。將分別攜帶MeSAUR1-MeCML24-pMeAGPS1a、MeSAUR1-pMeAGPS1a和pMeAGPS1a載體的農(nóng)桿菌GV3101（pSoup-p19）侵染本氏煙草葉片，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示雙熒光素酶載體表達(dá)MeSAUR1后，pMeAGPS1a啟動子活性上升了44.43%，而共表達(dá)MeSAUR1和MeCML24后，pMeAGPS1a啟動子活性僅為單獨(dú)表達(dá)MeSAUR1的31.26%，是pMeAGPS1a啟動子本底表達(dá)活性的45.15%。因此MeCML24與MeSAUR1 互作后可抑制MeAGPS1a基因表達(dá)（圖9）。

圖9 雙熒光素酶實驗分析MeSAUR1-MeCML24互作對 MeAGPS1a 基因表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)Fig.9 Dual-luciferase assay to analyze the regulatory effect of MeSAUR1-MeCML24 on the expression of MeAGPS1a gene

3 討論

木薯的光合速率比較高，蔗糖合成能力也比較強(qiáng)，但木薯塊根的淀粉含量低于理論值[7]。AGPase是淀粉合成的關(guān)鍵酶和限速酶，淀粉的含量和產(chǎn)量都與 AGPase酶的活性有很大的關(guān)聯(lián)，因此以AGPase酶為切入點(diǎn)，開展作物遺傳改良，對提高作物產(chǎn)量及淀粉含量具有重要的意義。木薯MeAGPS1a基因編碼的小亞基是AGPase的催化中心，無論在葉片還是塊根中的表達(dá)量均高于其他MeAGPase[8]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，MeSAUR1轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合在MeAGPS1a基因翻譯起始位點(diǎn)上游-201~400 bp的啟動子區(qū)，正調(diào)控MeAGPS1a基因的轉(zhuǎn)錄。通過酵母雙雜交文庫篩選，發(fā)現(xiàn)MeCML24可能是MeSAUR1的候選互作蛋白（未發(fā)表）。

鈣調(diào)素類似蛋白（CaM-like, CML)是一類重要的鈣信號傳感蛋白，具有植物發(fā)育、逆境脅迫反應(yīng)、離子吸收、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)功能。在植物響應(yīng)各種生理刺激時，Ca2+參與調(diào)節(jié)植物的多種生長發(fā)育和脅迫適應(yīng)過程，在這些過程中，Ca2+信號帶有特異性標(biāo)簽，通過 Ca2+結(jié)合蛋白及其下游靶蛋白感知不同刺激并翻譯成響應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)，鈣調(diào)素（CaM）和鈣調(diào)素類蛋白（CML）是Ca2+主要的感受器，通過調(diào)節(jié)不同靶蛋白的活性調(diào)控多種細(xì)胞功能[9]。植物鈣調(diào)素類蛋白（CML）在鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，擬南芥CML37可調(diào)節(jié)植物多種脅迫反應(yīng)，促進(jìn)干旱誘導(dǎo)的ABA合成[10]，且Ca2+敏感蛋白CML37在擬南芥中起著正向防御調(diào)節(jié)作用，通過促進(jìn) JAR1的活性來增強(qiáng)茉莉酸途徑，從而激活下游防御[11]。CML20是響應(yīng)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的下游負(fù)調(diào)控因子，參與介導(dǎo)ABA調(diào)控氣孔運(yùn)動過程，影響植物抗干旱能力[12]；擬南芥 CML24參與調(diào)控花粉萌發(fā)和花粉管長度并影響果莢的結(jié)實率[13]。研究木薯鈣信號相關(guān)受體（CaM、CML、CBL）的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)鈣信號在木薯響應(yīng)干旱脅迫和抗采后生理性變質(zhì)過程中具有關(guān)鍵作用[14]。然而，CML參與調(diào)控木薯塊根積累過程的研究尚未報道。

本研究通過酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)實驗、BiFC實驗證實了MeCML24與MeSAUR1的互作關(guān)系。POPESCU等[15]通過高密度擬南芥蛋白微陣列挖掘CML蛋白的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)擬南芥CML9與SAUR_B蛋白（At5g20810）存在潛在互作關(guān)系，并通過免疫共沉淀（Co-Ip）驗證了這2個蛋白的互作關(guān)系。然而CML9與SAUR_B互作生物學(xué)功能尚未明確。本研究利用雙熒光素酶實驗，證明了MeCML24負(fù)調(diào)控MeSAUR1對MeAGPS1a基因的激活作用。此研究結(jié)果說明，鈣信號途徑參與調(diào)控木薯淀粉的合成過程。后續(xù)工作中，將進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)，研究MeSAUR1與互作蛋白MeCML24對MeAGPS1a基因的調(diào)控效應(yīng)及對木薯淀粉合成的影響。