柏成成 姚小堯 王雨璐 王賽玉 李金瑩 蔣有為 靳舒榮 陳春杰 劉 漁 魏星玥 徐新福 李加納 倪 郁

甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴合成相關(guān)基因的克隆及其與BnCER1-2的互作

柏成成**姚小堯**王雨璐 王賽玉 李金瑩 蔣有為 靳舒榮 陳春杰 劉 漁 魏星玥 徐新福 李加納 倪 郁*

西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院 / 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400716

長鏈烷烴是甘藍(lán)型油菜角質(zhì)層蠟質(zhì)的優(yōu)勢組分, 在阻止植株的非氣孔性水分散失中起主要作用。BnCER1-2催化甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴的生物合成, 但BnCER1-2是否通過與其他蛋白互作調(diào)控長鏈烷烴合成還不清楚。前期通過甘藍(lán)型油菜蠟質(zhì)差異材料轉(zhuǎn)錄組篩選獲得4個(gè)長鏈烷烴合成相關(guān)基因、、、。本研究克隆了這4個(gè)基因的編碼序列, 序列分析表明BnCER3.a10/c02和BnCER1-L2.a05前體蛋白具有典型的脂肪酸羥化酶與WAX2 C末端結(jié)構(gòu)域, 而BnCYTB5B.c09具有Cyt_B5蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明, BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09和BnCER1-L2.a05均定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 與BnCER1-2共定位。雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescent complementation, BiFC)與螢火素酶互補(bǔ)試驗(yàn)(luciferase complementation assay, LCA)檢測結(jié)果表明, BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05與BnCER1-2蛋白存在相互作用, 而BnCER3.c02與BnCER1-2蛋白不互作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示, 與的表達(dá)模式一致,和主要在甘藍(lán)型油菜莖/葉中表達(dá), 并受干旱脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)。在NaCl與低溫脅迫下表達(dá)量顯著減少, 其中受MeJA、ACC誘導(dǎo)顯著下調(diào),表達(dá)受ABA誘導(dǎo)上調(diào)。在花中的表達(dá)量最高, 在莖和葉片中的表達(dá)量最低, 在干旱、低溫及NaCl脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降, 其中SA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào), 而MeJA誘導(dǎo)其表達(dá)下調(diào)。蠟質(zhì)差異材料熒光定量PCR結(jié)果證實(shí),與在高蠟(烷)油菜中的表達(dá)量顯著高于低蠟(烷)油菜, 而則呈相反變化。綜合分析認(rèn)為, BnCER3.a10和BnCYTB5B.c09可能通過與BnCER1-2互作而促進(jìn)甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴的生物合成, BnCER1-L2.a05可能通過與BnCER1-2互作負(fù)調(diào)控長鏈烷烴的合成。

甘藍(lán)型油菜; 角質(zhì)層蠟質(zhì); 蛋白互作; 長鏈烷烴

甘藍(lán)型油菜(L.)是全球最重要的油料作物之一, 目前已發(fā)展成為集油用、能源、菜用、飼用、綠肥、蜜源和觀花于一身的多功能作物。然而在許多國家和地區(qū), 干旱嚴(yán)重降低了甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)量和種植分布[1-2]。植物角質(zhì)層蠟質(zhì)是植物抵御外界環(huán)境脅迫的第一層屏障, 具有多種生理和生態(tài)功能, 例如限制植物非氣孔性水分散失[3-4]、防止外源病蟲害侵入[5-6]、阻擋紫外線輻射[7-8]、以及降低灰塵和空氣中的污染物在植物表面的沉積等[9-10]。長鏈烷烴是甘藍(lán)型油菜葉角質(zhì)層蠟質(zhì)的主要組分, 占蠟質(zhì)總量的50%以上[11]。已被證明在甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴生物合成中起作用, 并主要負(fù)責(zé)C29烷的生物合成[12]。擬南芥中, CER1需要伙伴蛋白來發(fā)揮其活性, 其中CER3、CER1-LIKE1 (CER1-L1)和定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞色素B5亞型(CYTB5B)被證明與CER1互作調(diào)控?cái)M南芥長鏈烷烴的生物合成[13-14]。前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),、的油菜同源基因、與共表達(dá), 且在甘藍(lán)型油菜低蠟(烷)材料中顯著下調(diào)[15], 暗示了這幾個(gè)基因編碼的蛋白可能與BnCER1-2互作調(diào)控甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴的合成。擬南芥()與、同屬一個(gè)基因家族, 但在擬南芥各組織器官中未檢測到其表達(dá)[16], 而我們轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,的油菜同源基因在低蠟(烷)油菜中顯著上調(diào)[15], 暗示其可能參與了油菜的蠟質(zhì)合成。

本研究從甘藍(lán)型油菜中克隆了、、基因, 亞細(xì)胞定位結(jié)果表明它們與BnCER1-2共定位; 利用雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescent complimentary, BiFC)與螢火素酶互補(bǔ)試驗(yàn)(luciferase complementation assay, LCA)驗(yàn)證了BnCER1-2與BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05蛋白相互作用, 并利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)互作基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析, 研究結(jié)果為進(jìn)一步解析甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴的生物合成以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

甘藍(lán)型油菜中雙11號(hào)(Zhongshuang 11, ZS11)、低蠟(烷)油菜NoWax、本氏煙草由西南大學(xué)油菜工程中心提供。采集甘藍(lán)型油菜ZS11的根、莖、葉、花、角果以及NoWax材料的葉片, 儲(chǔ)存于–80℃, 用于RNA提取。大腸桿菌()菌株DH5α感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101購買自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 激素及脅迫處理

將ZS11幼苗放在組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行溶液培養(yǎng)(1/10的MS溶液配制: 1 L培養(yǎng)液中含MS培養(yǎng)基基鹽0.474 g L–1, 蔗糖3 g L–1, MES 0.05 g L–1, 調(diào)節(jié)pH為5.7, 121℃高溫滅菌15 min, 稀釋10倍后使用), 放置在人工氣候室中(晝夜溫度22℃/20℃、光照周期8 h/16 h), 待幼苗長至5片真葉時(shí), 分別進(jìn)行激素、鹽脅迫與干旱脅迫處理。激素處理: 分別將水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonic acid, MeJA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)及乙烯合成促進(jìn)劑1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropanecarboxylic acid, ACC)加入到培養(yǎng)液中, 使其終濃度分別為200 μmol L–1、100 μmol L–1、20 μmol L–1、200 μmol L–1, 處理6 h后取樣; 鹽脅迫處理: 用100 mmol L–1NaCl溶液分別處理6 h、12 h; 干旱脅迫處理: 將幼苗分別暴露在空氣中6 h、12 h; 低溫脅迫處理: 將幼苗放在冷室(4℃)中12 h、24 h。處理結(jié)束后, 取上述材料保存于–80℃, 用于RNA提取。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

采用TRIzol (TaKaRa)試劑按照說明書提取樣品總RNA, DNase I (TaKaRa)消化去除基因組DNA。使用Nanodrop (Thermo Scientific, 美國)測定RNA濃度后, 依照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)操做指南將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 基因克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)甘藍(lán)型油菜、、序列設(shè)計(jì)引物, 在上下游引物中分別引入BiFC (表1)和LCA載體的同源序列(表2), 用于后期利用同源重組方法進(jìn)行克隆; 同時(shí)引入酶切位點(diǎn)用于后期驗(yàn)證。以甘藍(lán)型油菜cDNA為模板, 按照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序參數(shù)設(shè)置為: 預(yù)變性95℃ 2 min; 變性95℃ 20 s, 退火55℃ 20 s, 延伸72℃ 1 min, 30個(gè)循環(huán); 終延伸72℃ 5 min。擴(kuò)增得到序列膠回收后與載體(pMD-19T Vector)連接, 轉(zhuǎn)化α感受態(tài), 篩選陽性克隆并測序。

表1 BiFC重組載體構(gòu)建引物

雙下畫線為酶切位點(diǎn), 單下畫線為載體重組序列。

The restriction enzyme site is double underlined, and the DNA recombination sequences of the vector is single underlined.

表2 LCA重組載體構(gòu)建引物

雙下畫線為酶切位點(diǎn), 單下畫線為載體重組序列。

The restriction enzyme site is double underlined, and the DNA recombination sequences of the vector is single underlined.

利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線工具、Vector NTI Advance 11.5、以及MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析, 在InterPro (http:// www.ebi.ac.uk/interpro/)上進(jìn)行蛋白質(zhì)保守域、功能域分析。

1.5 亞細(xì)胞定位

以甘藍(lán)型油菜ZS11的cDNA為模板, 利用帶有限制性內(nèi)切酶R I、H I位點(diǎn)的引物(表3)擴(kuò)增目的基因編碼區(qū), 采用同源重組的方法將其與線性化的亞細(xì)胞定位載體pEGAD連接, 構(gòu)建重組質(zhì)粒, 測序驗(yàn)證后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并注射煙草, 注射后的煙草覆膜黑暗培養(yǎng)2 d, 利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP信號(hào)并照相。

表3 亞細(xì)胞定位引物

雙下畫線為酶切位點(diǎn), 單下畫線為載體重組序列。

The restriction enzyme site is double underlined, and the DNA recombination sequences of the vector pEGAD is single underlined.

1.6 BiFC檢測BnCER1-2與候選蛋白的互作

利用限制性內(nèi)切酶I、I對(duì)nYFP載體pC1300-YN-OsHAL3進(jìn)行雙酶切, 按照ClonEXPress II One Step Cloning Kit試劑盒操作說明, 將膠回收線性化載體與經(jīng)測序驗(yàn)證后的連接; 利用限制性內(nèi)切酶I、I對(duì)cYFP載體pC2300-OsHAL3-YC進(jìn)行雙酶切, 按同樣方法分別與/、和相連接; 構(gòu)建好的5個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證后分別命名為: pC1300-YN- BnCER1-2、pC2300-BnCER3.a10-YC、pC2300- BnCER3.c02-YC、pC2300-BnCYTB5B.c09-YC、pC2300-BnCER1-L2.a05-YC。

以檢測BnCER3.a10和BnCER1-2的互作為例, 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌, 然后將pC1300- YN-BnCER1-2 + pC2300-BnCER3.a10-YC菌液等體積混勻后注射煙草, 同時(shí)分別以pC1300-YN- OsHAL3 + pC2300-OsHAL3-YC菌液共侵染煙草作為陽性對(duì)照, pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCER3. a10-YC、pC1300-YN-BnCER1-2 + pC2300-OsHAL3- YC為陰性對(duì)照, 保濕黑暗處理2 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。其余候選蛋白與BnCER1-2的BiFC互作檢測方法同上。

1.7 LCA檢測BnCER1-2與候選蛋白的互作

利用I與I分別對(duì)LCA載體pC1300-Nluc、pC1300-Cluc進(jìn)行雙酶切, 按照ClonEXPress II One Step Cloning Kit試劑盒操作說明, 將膠回收線性化載體與經(jīng)測序驗(yàn)證后的目的基因進(jìn)行連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證后, 構(gòu)建好的5個(gè)重組質(zhì)粒分別命名為: pC1300-Nluc-BnCER1-2、pC1300-BnCER3.a10-Cluc、pC1300-BnCER3.c02-Cluc、pC1300-BnCYTB5B.c09- Cluc、pC1300-BnCER1-L2.a05-Cluc。

以檢測BnCER3.a10和BnCER1-2的互作為例, 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌, 然后將處理組pC1300-Nluc-BnCER1-2 + pC1300-BnCER3.a10- Cluc菌液等體積混勻后注射煙草, 同時(shí)分別以pC1300-Cluc + pC1300-NLuc-BnCER1-2、pC1300- BnCER3.a10-CLuc + pC1300-NLuc、pC1300-Cluc + pC1300-NLuc為陰性對(duì)照, 保濕黑暗處理2 d后, 用含1 mmol L–1熒火素底物D-luciferin的反應(yīng)液噴濕葉片背面, 于黑暗中靜置7 min, 利用植物活體分子影像系統(tǒng)(CCD imaging system)測定熒光強(qiáng)度。其余候選蛋白與BnCER1-2的LCA互作檢測方法同上。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)測序驗(yàn)證后的序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表4), 在CFX Connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上擴(kuò)增。反應(yīng)體系按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)說明配制, 熒光定量PCR的反應(yīng)體系(20 μL), 包含2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol L–1上下游引物各0.4 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s; 95℃ 5 s, 58℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。作為內(nèi)參基因, 設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 2個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜BnCER3.a10、BnCER3.c02、BnCYTB5B.c09和BnCER1-L2.a05基因的克隆與生物信息學(xué)分析

為尋找BnCER1-2可能的互作蛋白, 根據(jù)蠟質(zhì)差異材料轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果, 本研究從甘藍(lán)型油菜中克隆了、、、這4個(gè)基因, 測序結(jié)果表明, 擴(kuò)增的、編碼序列均為1893 bp, 各自編碼630個(gè)氨基酸;為423 bp, 編碼140個(gè)氨基酸;為1887 bp, 編碼628個(gè)氨基酸。

BlastN結(jié)果顯示,與白菜(XM_033281803.1)的相似性最高, 為99.9%, 而與甘藍(lán)(XM_013757293.1)的相似性達(dá)100%; 它們與擬南芥()的相似性分別為88.3%和88.8%。與甘藍(lán)(XM_013754065.1)、擬南芥()的相似性分別為100%和86.8%;與白菜(XM_009145209.3)、擬南芥()的相似性分別為99.5%和85.3%?將推導(dǎo)的BnCER3.a10、BnCER3.c02、BnCER1-L2.a05蛋白與BnCER1-2以及擬南芥CER1、CER1-L1、CER1-L2、CER3蛋白進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn), BnCER3.a10與BnCER3.c02的序列之間的同源性為93.8%, 它們與擬南芥CER3序列分別具有91.8%與93.4%的同源性; BnCER1-L2.a05與擬南芥CER1、CER1-L1、CER1-L2的同源性分別為50.6%、74.9%、85.9%。推導(dǎo)的BnCYTB5B.c09氨基酸序列與擬南芥CYTB5具有88.7%的同源性。氨基酸序列比對(duì)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明, 與擬南芥對(duì)應(yīng)的同源基因一樣, BnCER3.a10/c02、BnCER1-L2.a05以及BnCER1-2蛋白中均含有脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域(圖1-A)和WAX2 C末端結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。BnCYTB5B. c09具有典型的Cyt_B5蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域(圖1-C)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, BnCER3.a10/c02、BnCER1-L2.a05與BnCER1-2以及甘藍(lán)、白菜、擬南芥CER1、CER3聚在一個(gè)亞組, 而BnCYTB5B.c09與甘藍(lán)、白菜、擬南芥CYTB5聚在另外一個(gè)亞組(圖2)。

表4 熒光定量PCR引物

(圖1)

A: 脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域; B: WAX2 C末端結(jié)構(gòu)域; C: Cyt_B5蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域。參與氨基酸序列比對(duì)的有擬南芥() CER1 (AT1G02205)、CER1-L1 (AT1G02190)、CER1-L2 (AT2G37700)、CER3 (AT5G57800), 參與比對(duì)的CYTB5分別來自擬南芥() (AT5G48810)、甘藍(lán)() (XP_013609519.1)、埃塞俄比亞芥() (KAG2316461.1)、薺菜() (XP_006279708.1)、蘿卜() (XP_018457867.1)。

A: fatty_acid_hydroxylase domain Wax2 C-terminal domain; B: wax2 C-terminal domain; C: cyt_B5 protein conserved domain. The proteins involved in amino acid sequence alignment includeCER1 (AT1G02205), CER1-L1 (AT1G02190), CER1-L2 (AT2G37700), and CER3 (AT5G57800). The CYTB5 proteins aligned are from(AT5G48810),(XP_013609519.1),(KAG2316461.1),(XP_006279708.1), and(XP_018457867.1), respectively.

2.2 BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09和BnCER1- L2.a05的亞細(xì)胞定位

將、和基因融合GFP信號(hào), 分別轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位, 結(jié)果如圖3所示, 含目標(biāo)基因的融合GFP蛋白普遍表達(dá)于煙草葉片內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中, 且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)mCherry信號(hào)重合, 表明這4個(gè)基因皆定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這與BnCER1-2的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[17]。

2.3 BnCER1-2與BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B. c09、BnCER1-L2.a05相互作用的BiFC檢測

將含與、、基因的BiFC重組載體共侵染煙草, 在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn), 處理組pC1300-YN-BnCER1-2 + pC2300-BnCER3.a10- YC、pC1300-YN-BnCER1-2 + pC2300-BnCYTB5B. c09-YC、pC1300-YN-BnCER1-2 + pC2300-BnCER1- L2.a05-YC與陽性對(duì)照組在顯微鏡下均觀察到明顯的黃色熒光, 而陰性對(duì)照組則沒有檢測到熒光(圖4),表明BnCER1-2與BnCER3.a10、BnCYTB5.c09、BnCER1-L2.a05蛋白可能存在互作。

將含和基因的BiFC重組載體共侵染煙草后沒有檢測到熒光信號(hào)(圖略), 說明BnCER1-2與BnCER3.c02蛋白可能不互作。

2.4 BnCER1-2與BnCER3.a10、BnCYTB5B. c09、BnCER1-L2.a05相互作用的LCA檢測

將含與、、基因的LCA重組載體共侵染煙草, 在CCD成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn), pC1300-Nluc- BnCER1-2與pC1300-BnCER3.a10-Cluc共轉(zhuǎn)化的煙草葉片在成像系統(tǒng)中觀察到熒光信號(hào), 而陰性對(duì)照組則沒有檢測到熒光(圖5-A), 說明BnCER1-2與BnCER3.a10蛋白存在互作。使用同樣的方法檢測到pC1300-Nluc-BnCER1-2與pC1300-BnCYTB5B.c09- Cluc、pC1300-Nluc-BnCER1-2與pC1300-BnCER1- L2.a05-Cluc共轉(zhuǎn)化煙草葉片存在熒光信號(hào)(圖5-B, C), 說明BnCER1-2與BnCYTB5.c09、BnCER1- L2.a05蛋白均存在互作。

圖2 BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05與其他十字花科物種相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

參與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的氨基酸序列包括擬南芥AtCER1 (AT1G02205)、AtCER1-L1 (AT1G02190)、AtCER1-L2 (AT2G37700)、AtCER3(AT5G57800)、AtCYTB5 (AT5G48810), 白菜BrCER1 (XP_009118866.2)、BrCER1-L2 (XP_009143457.1)、BrCER3 (XP_033137694.1)、BrCYTB5B (XP_009151679.1), 甘藍(lán)BoCER1 (QCO76034.1)、BoCER1-L2 (XP_013632332.1)、BoCER3 (XP_013621098.1)、BoCYTB5B(XP_013597870.1)。

The amino acid sequences involved in phylogenetic analysis include AtCER1 (AT1G02205), AtCER1-L1 (AT1G02190), AtCER1-L2 (AT2G37700), AtCER3 (AT5G57800), and AtCYTB5 (AT5G48810) from, BrCER1 (XP_009118866.2), BrCER1-L2 (XP_009143457.1), BrCER3 (XP_033137694.1), and BrCYTB5B (XP_009151679.1) from, BoCER1 (QCO76034.1), BoCER1-L2 (XP_013632332.1), BoCER3 (XP_013621098.1), and BoCYTB5B (XP_013597870.1) from.

圖3 BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09和BnCER1-L2.a05在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位

標(biāo)尺為20 μm。Bar: 20 μm.

圖4 BiFC檢測BnCER1-2與BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05蛋白互作

pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-OsHAL3-YC為陽性對(duì)照, pC1300-YN-BnCER1-2 + pC2300-OsHAL3-YC、pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCER3.a10-YC、pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCYTB5B.c09-YC、pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCER1-L2.a05-YC為陰性對(duì)照。標(biāo)尺為20 μm。

The combination “pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-OsHAL3-YC” is used as the positive control, while the combination “pC1300-YN-BnCER1-2 + pC2300-OsHAL3-YC”, “pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCER3.a10-YC”, “pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCYTB5B.c09-YC”, and “pC1300-YN-OsHAL3 + pC2300-BnCER1-L2.a05-YC” are used as the negative controls, respectively. Bar: 20 μm.

2.5 甘藍(lán)型油菜BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)與存在互作的、、基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),主要在甘藍(lán)型油菜莖、葉中表達(dá);在甘藍(lán)型油菜莖中的表達(dá)量最高, 其次是在花、葉片和根中, 在角果中的表達(dá)量最低;在花中的表達(dá)量最高, 在莖和葉片中的表達(dá)量最低(圖6-A)。甘藍(lán)型油菜蠟質(zhì)差異材料表達(dá)分析結(jié)果顯示,與在低蠟(烷)材料中顯著下調(diào), 其中在低蠟(烷)材料中幾乎不表達(dá); 而在低蠟(烷)材料中顯著上調(diào)(圖6-B)。

受MeJA、ACC誘導(dǎo)顯著下調(diào),受ABA誘導(dǎo)顯著上調(diào), 而則受SA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)、受MeJA誘導(dǎo)下調(diào)(圖6-C)。在干旱脅迫下,和的表達(dá)量顯著增加,則顯著下降(圖6-C)。在NaCl與低溫脅迫下,與的表達(dá)量均顯著下降(在NaCl脅迫6 h下降顯著, 12 h無顯著變化), 而對(duì)NaCl脅迫無響應(yīng), 在低溫處理12 h顯著增加(圖6-C)。

圖5 LCA檢測BnCER1-2與BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05蛋白互作

A: BnCER3.a10與BnCER1-2互作檢測; B: BnCYTB5B.c09與BnCER1-2互作檢測; C: BnCER1-L2.a05與BnCER1-2互作檢測; NLuc空載體與含目的基因的CLuc載體組合、CLuc空載體與含目的基因的NLuc載體組合以及均為空載體的CLuc/NLuc載體組合分別作為陰性對(duì)照。

A: the interaction detection between BnCER3.a10 and BnCER1-2; B: the interaction detection between BnCYTB5B.c09 and BnCER1-2; C: the interaction detection between BnCER1-L2.a05 and BnCER1-2. The combination of NLuc empty vector with CLuc vector containing target gene, the combination of CLuc empty vector with NLuc vector containing target gene, and the combination of CLuc empty vector with NLuc empty vector were used as the negative controls, respectively.

(圖6)

A: 組織器官特異性表達(dá); B: 蠟質(zhì)差異材料表達(dá); C: 非生物脅迫和激素誘導(dǎo)表達(dá)。SA: 水楊酸; MeJA: 茉莉酸甲酯; ACC: 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸; ABA: 脫落酸。*代表< 0.05。

A: the specific relative expression of organs and tissues; B: the differential expression inwith high load wax and low load wax; C: induced expression by abiotic stress and hormone. SA: salicylic acid; MeJA: methyl jasmonic acid; ACC: 1-aminocyclopropanecarboxylic acid; ABA: abscisic acid. *:< 0.05.

3 討論

長鏈烷烴在植物的耐旱性、植物與病原菌互作以及花粉水合作用中承擔(dān)著重要功能[16,18-19]。甘藍(lán)型油菜參與長鏈烷烴的生物合成, 并主要負(fù)責(zé)C29烷的合成, 其在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)增強(qiáng)了植株的抗旱性[12]。為進(jìn)一步揭示BnCER1-2的作用機(jī)制, 根據(jù)蠟質(zhì)差異材料轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果, 本研究克隆了BnCER1-2潛在的互作蛋白基因/、、, 序列分析表明, 它們分別是對(duì)應(yīng)于擬南芥、的垂直同源基因。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明, BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09、BnCER1- L2.a05均定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 與BnCER1-2的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[17]。

前人研究報(bào)道, 擬南芥CER1和CER3組成的復(fù)合物可催化?；o酶A轉(zhuǎn)化為烷烴, 且主要催化合成29個(gè)碳及以上的長鏈烷烴[13]。在生產(chǎn)超長鏈脂肪酸的酵母工程菌株中, 添加CYTB5s可提高CER1/CER3催化烷烴的產(chǎn)量, 進(jìn)一步研究表明, CYTB5B是CER1的特異輔因子[13]。為觀察BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09與BnCER1-2是否存在互作, 本研究利用BiFC與LCA技術(shù)對(duì)蛋白互作進(jìn)行了檢測。BiFC是一種可直觀、快速判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中定位和相互作用的技術(shù)[20], 而熒火素酶互補(bǔ)試驗(yàn)(luciferase complementation assay, LCA)則因其高靈敏度、可定量化、操作簡單高效被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)和動(dòng)物學(xué)蛋白質(zhì)互作研究[21]。最終檢測結(jié)果表明, BnCER1-2蛋白能與BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09蛋白互作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,和主要在甘藍(lán)型油菜莖/葉中表達(dá), 這與角質(zhì)層蠟質(zhì)主要在地上部器官沉積的功能一致(圖6-A)。蠟質(zhì)差異材料研究結(jié)果表明,和在低蠟(烷)油菜中的表達(dá)量顯著低于高蠟(烷)油菜, 其中在低蠟(烷)油菜中幾乎不表達(dá)(圖6-B), 這與在低蠟(烷)材料中的表達(dá)趨勢一致[12]。低蠟(烷)油菜NoWax與ZS11相比, 烷類含量低是其蠟質(zhì)含量低的主要原因[12]。這些結(jié)果表明, BnCER3.a10與BnCYTB5B.c09可能通過與BnCER1-2互作而促進(jìn)甘藍(lán)型油菜長鏈烷烴的生物合成。與對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)一致[12],和的轉(zhuǎn)錄水平受干旱脅迫誘導(dǎo), 其中表達(dá)受ABA誘導(dǎo), 而和對(duì)旱脅迫的響應(yīng)可能獨(dú)立于ABA途徑。

Bourdenx等[16]在擬南芥數(shù)據(jù)庫中共鑒定到4個(gè)同源基因:、、和, 其中與、高度同源, 而為假基因。進(jìn)一步研究表明, CER1-L1與CER3和CYTB5在酵母工程菌株中相互作用, 形成的功能復(fù)合物催化產(chǎn)生的烷烴與CER1復(fù)合物催化的烷烴鏈長不同[14]。利用擬南芥突變體與過表達(dá)研究表明, CER1-L1也是催化烷烴形成的復(fù)合物的一部分[14]。在擬南芥各組織器官中未檢測到其表達(dá), 可能不參與擬南芥蠟質(zhì)合成[16]。甘藍(lán)型油菜蠟質(zhì)差異材料轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中,表達(dá)無顯著差異, 而在低蠟(烷)材料中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[15], 這一結(jié)果被熒光定量PCR所證實(shí)(圖6-B), 暗示了可能參與了甘藍(lán)型油菜蠟(烷)的負(fù)調(diào)控。在干旱等逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(圖6-C), 也說明其存在與以及不同的調(diào)控方式。BiFC與LCA檢測結(jié)果最終證明BnCER1-L2.a05與BnCER1-2蛋白存在互作。綜合分析認(rèn)為, 甘藍(lán)型油菜中存在著與擬南芥不一樣的長鏈烷烴合成模式, BnCER1-L2.a05可能通過與BnCER1-2互作而負(fù)調(diào)控長鏈烷烴的生物合成。此外,在花器官中的高表達(dá)量也暗示了其可能在花器官的形成或功能中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

甘藍(lán)型油菜BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05可能通過與BnCER1-2互作而調(diào)控長鏈烷烴的生物合成, 參與干旱脅迫響應(yīng), 其中BnCER3.a10與BnCYTB5B.c09促進(jìn)長鏈烷烴的合成, 而BnCER1-L2.a05可能負(fù)調(diào)控長鏈烷烴的合成。

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Cloning of genes involved in cuticular very-long-chain alkane synthesis and its interaction with BnCER1-2 in

BAI Cheng-Cheng**, YAO Xiao-Yao**, WANG Yu-Lu, WANG Sai-Yu, LI Jin-Ying, JIANG You-Wei, JIN Shu-Rong, CHEN Chun-Jie, LIU Yu, WEI Xing-Yue, XU Xin-Fu, LI Jia-Na, and NI Yu*

College of Agronomy and Biotechnology / Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China

Very-long-chain (VLC) alkanes are the main components of cuticular wax in, which play a key role in preventing non-stomatal water loss. BnCER1-2 is the core enzyme that catalyzes the synthesis of VLC alkanes in. However, it is unclear whether BnCER1-2 protein regulates VLC alkane synthesis by interacting with other proteins. Four genes potentially involved in VLC alkane synthesis,,,, and, were screened previously by the transcriptome inwith differential wax load. In this study, their coding sequences were cloned from. A typical fatty acid hydroxylase domain and a wax2 C-terminal domain were detected in the predicted BnCER3.a10/c02 and BnCER1-L2.a05 proteins, while cyt_b5 protein family conserved domain was in the predicted BnCYTB5B.c09. Subcellular localization showed that BnCER3.a10/c02, BnCYTB5B.c09, and BnCER1-L2.a05 were all located in the endoplasmic reticulum, which were co-located with BnCER1-2. Bimolecular fluorescence complementary (BiFC) and luciferase complementation assay (LCA) revealed that BnCER3.a10, BnCYTB5B.c09, and BnCER1-L2.a05 interacted with BnCER1-2 protein, while BnCER3.c02 did not interact with BnCER1-2. The RT-qPCR indicated thatandwere mainly expressed in the stems or leaves of, and the relative expression was significantly up-regulated under drought stress, which were consistent with the expression pattern of. The relative expression levels ofdecreased significantly under NaCl and low temperature stresses. Further, the relative expression level ofwas significantly down-regulated by MeJA and ACC, while the relative expression level ofwas up-regulated by ABA. The highest relative expression ofwas in flowers and the lowest in stems and leaves, and its expression was significantly down-regulated under drought, cold, and NaCl stresses. Further, the relative expression level ofwas up-regulated by SA, while down-regulated by MeJA. The relative expression levels ofandinwith high wax/alkane load were significantly higher than that with low wax/alkane load, whilehad the opposite change. Comprehensive analysis suggested that BnCER3.a10 and BnCYTB5B.c09 may promote the biosynthesis of VLC alkanes inby interacting with BnCER1-2, while BnCER1-L2.a05 may negatively regulate the synthesis of VLC alkanes by interacting with BnCER1-2.

; cuticular wax; protein interaction; very-long-chain alkanes

10.3724/SP.J.1006.2023.24037

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32171938, 31771694), 重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(cstc2021jcyj-msxmX0332)和財(cái)政部和農(nóng)村農(nóng)業(yè)部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-12)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32171938, 31771694), the Natural Science Foundation of Chongqing, China (cstc2021jcyj-msxmX0332), and the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-12).

倪郁, E-mail: nmniyu@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

柏成成, E-mail: 1316502363@qq.com; 姚小堯, E-mail: 823706108@qq.com

2022-02-13;

2022-06-07;

2022-06-21.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220620.1635.002.html

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