雷建峰 李 月 代培紅 趙 燚 尤揚子 賈建國 趙 帥 曲延英,* 劉曉東,*

棉花中不同植物病毒介導(dǎo)的VIGE體系的研究

雷建峰1李 月2代培紅2趙 燚2尤揚子2賈建國1趙 帥1曲延英1,*劉曉東2,*

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 教育部棉花工程研究中心, 新疆烏魯木齊 830052;2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新疆烏魯木齊 830052

植物病毒介導(dǎo)sgRNA的傳遞與表達相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化完整的編輯載體進行基因編輯具有巨大優(yōu)勢, 因為sgRNA的表達可以伴隨著病毒的復(fù)制和移動而快速擴增、累積, 從而產(chǎn)生高效的基因編輯效率。為在棉花中開發(fā)應(yīng)用更多植物病毒介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)(virus-induced genome editing, VIGE)。本研究以超表達Cas9 (Cas9-OE)棉花作為VIGE受體, 在棉花中分別建立了棉花葉皺縮病毒(cotton leaf crumple virus, CLCrV)和煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)。首先CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE均可以靶向敲除棉花和基因A亞組和D亞組基因組序列, 驗證了這2個系統(tǒng)的可行性和有效性。進一步量化這2個系統(tǒng)對和基因的編輯效率結(jié)果發(fā)現(xiàn), CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE均能夠產(chǎn)生高效的基因編輯效率, 并且2種系統(tǒng)基因編輯效率不存在顯著差異。本研究還探究了使用棉花內(nèi)源U6啟動子和擬南芥U6啟動子驅(qū)動sgRNA對VIGE基因編輯效率的影響。結(jié)果顯示, 這2個啟動子介導(dǎo)的VIGE均能夠產(chǎn)生高效的基因編輯效率, 并且基于這2種啟動子介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)基因編輯效率不存在顯著差異。以上結(jié)果預(yù)示著可以開發(fā)更多的植物病毒載體應(yīng)用于棉花基因編輯的研究, 進而獲得高效的sgRNA篩選體系。

棉花; CLCrV; TRV; VIGE; 基因編輯

棉花基因功能的鑒定和新品種的選育離不開遺傳變異突變體的獲得, 傳統(tǒng)的誘變技術(shù)和T-DNA插入等隨機突變遠遠不能滿足科學(xué)研究和棉花育種的需求?；蚪M編輯技術(shù)是一種強大的技術(shù)工具, 它可以利用可編程序列和特異性核酸內(nèi)切酶(Cas9或Cpf1)在生物體基因組特定位點上產(chǎn)生靶向突變[1-3]。近年來, II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的基因編輯[4-7]。該系統(tǒng)由single guide RNA (sgRNA)引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9在非常精確的目標(biāo)位點上切斷雙鏈DNA (dsDNA), 然后生物體通過非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(homologous recombination, HR)進行修復(fù)。在缺乏同源DNA模板的情況下, NHEJ途徑在修復(fù)DSBs過程中可引起目標(biāo)位點堿基的缺失、插入或替換, 從而在特定位點產(chǎn)生遺傳變異[8]。

目前, 棉花基因編輯技術(shù)體系已經(jīng)建立并陸續(xù)得到升級和改良(CRISPR/Cpf1和單堿基編輯系統(tǒng))[9-13]。然而對于遺傳轉(zhuǎn)化困難且周期長的棉花而言, 要獲得基因編輯的突變體是困難的。即使可以實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化, 也只是局限于該物種的少數(shù)幾個基因型。另外, 研究發(fā)現(xiàn)作為CRISPR系統(tǒng)關(guān)鍵元件之一的sgRNA, 在很多基因組位點上是低效或者是無效的。而sgRNAs的效率會直接影響到CRISPR/Cas9在棉花中的有效應(yīng)用。通過生物信息學(xué)的方法很難預(yù)測sgRNAs的活性[14-15]。因此, 在采用CRISPR系統(tǒng)獲得突變體之前, 必須盡量減少使用無效sgRNA的風(fēng)險, 就需要快速篩選出高效的sgRNA。在棉花中將完整的基因編輯載體進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[16]和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化棉花葉片[17]是2種最常見驗證sgRNA活性的方法。然而, 這些方法檢測到的突變效率低, 甚至很多時候無法有效驗證sgRNA的活性。

近期, 植物病毒誘導(dǎo)的基因編輯(virus-induced genome editing, VIGE)被廣泛應(yīng)用于一些模式植物和農(nóng)作物基因功能的研究[18-22]。該系統(tǒng)需要一個穩(wěn)定超表達Cas9 (Cas9-OE)的轉(zhuǎn)基因植株作為VIGE受體, 同時將sgRNA表達元件組裝在病毒載體上, 借助病毒可以在植物體內(nèi)系統(tǒng)侵染、復(fù)制、擴散的能力投送sgRNA, 從而高效地實現(xiàn)靶基因的定向編輯。棉花葉皺縮病毒(CLCrV, DNA病毒)和煙草脆裂病毒(TRV, RNA病毒)是2種常用于棉花基因沉默的病毒載體, 可用于沉默棉花內(nèi)源基因的表達[23-24]。本課題組在前期工作中, 對DNA病毒CLCrV載體進行改造分別在擬南芥和棉花中建立了CLCrV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)[22,25]。在棉花中, RNA病毒TRV是否也可以作為一個理想的病毒載體用于構(gòu)建VIGE系統(tǒng), 能否高效地實現(xiàn)對棉花內(nèi)源基因的靶向編輯尚缺乏相關(guān)研究。與此同時, 在前期的工作中, 本課題組使用截短的擬南芥AtU6-26啟動子(330 bp)驅(qū)動sgRNA表達, 在棉花中獲得了比較理想的基因編輯效率。使用棉花內(nèi)源U6啟動子驅(qū)動sgRNA表達能否進一步提升VIGE的基因編輯效率, 相關(guān)研究也鮮有報道。因此, 在棉花中建立不同植物病毒介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)和探究不同啟動子驅(qū)動sgRNA表達對基因編輯效率的影響, 對篩選出高效的VIGE體系具有重要意義。

本研究基于DNA病毒CLCrV和RNA病毒TRV載體, 構(gòu)建了相應(yīng)的VIGE體系。采用農(nóng)桿菌注射法將不同sgRNA衍生物接種棉花Cas9-OE植株, 驗證這2種VIGE系統(tǒng)的有效性和高效性; 與此同時, 探究不同啟動子對VIGE基因編輯效率的影響, 以篩選出適用于棉花基因編輯高效的VIGE系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用AtU6-26P::sgRNA、GhU6-5P::sgRNA[26]、棉花葉皺縮病毒CLCrV載體、煙草脆裂病毒TRV載體、棉花Cas9超表達(Cas9-OE)植株YZ-1均為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存。各種限制性內(nèi)切酶購于Thermo公司; T4DNA連接酶、Blunt Zero平端載體、Trans1-T1感受態(tài)細胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA聚合酶、植物基因組DNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、2K Plus II DNA Marker均購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司; Phusion超保真DNA聚合酶購自于紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司; 其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純; 引物合成及測序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 qRT-PCR分析Cas9表達量

利用Biospin Plant Total RNA提取試劑盒從野生型和Cas9-OE棉花子葉中分離總RNA。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA。通過qRT-PCR擴增188 bp基因片段, 以棉花基因為內(nèi)參對照(引物設(shè)計見表1), 每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后, 根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值, 利用2–DDCt方法[27]計算基因表達量。

1.3 不同植物病毒介導(dǎo)的VIGE體系的建立

1.3.1 sgRNA中間載體的構(gòu)建 使用截短的AtU6-26 (330 bp)和GhU6-5P (363 bp)啟動子驅(qū)動sgRNA表達。文中所提及的和基因的guide RNA (表1)通過退火: 95℃每5 s降低0.5～20.0℃, 插入到經(jīng)I酶切的AtU6-26::sgRNA和GhU6-5P::sgRNA載體上, 測序驗證- sgRNA和-sgRNA表達載體是否正確。

1.3.2 CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA載體構(gòu)建 用I和I酶切回收AtU6-26::- sgRNA、AtU6-26::-sgRNA、GhU6-5P::-sgRNA和GhU6-5P::-sgRNA片段, 將其分別組裝在CLCrV-A上; 同時用I和I酶切回收AtU6-26::-sgRNA、AtU6-26::-sgRNA、GhU6-5P::- sgRNA和GhU6-5P::-sgRNA片段, 將其分別組裝在TRV-V2上。CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA載體示意圖見圖1。采用酶切鑒定的方法驗證這些重組質(zhì)粒是否正確, 將鑒定正確的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101, 用于下一步侵染。

表1 本研究中使用的引物序列

圖1 CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA載體構(gòu)建

1.4 不同植物病毒投送sgRNA瞬時轉(zhuǎn)化Cas9- OE棉花

Cas9-OE棉花品種YZ-1種子在ddH2O水中浸泡3 d, 然后在黑暗中28℃發(fā)芽48 h。發(fā)芽后, 將幼苗移栽到土壤中, 在28℃、12 h光照/12 h黑暗條件下生長。待棉花幼苗2片子葉完全展開時進行接種轉(zhuǎn)化試驗。將構(gòu)建好的不同CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA載體的農(nóng)桿菌菌液接種于2 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg mL–1Kan和50 μg mL–1Rif)中活化, 28℃、200轉(zhuǎn) min-1過夜培養(yǎng)。按1∶100比例分別吸取不同活化菌液接種到15 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg mL–1Kan和50 μg mL–1Rif)中, 再次28℃、200轉(zhuǎn) min-1搖菌, 統(tǒng)一搖至菌液的OD600= 1.6～1.8時, 1000×離心15 min收集農(nóng)桿菌培養(yǎng)物, 重懸于轉(zhuǎn)化液(10 mmol L–1MgCl2, 10 mmol L–1MES和200 μmol L–1乙酰丁香酮)中, 調(diào)整OD600至1.0左右, 在室溫下避光孵育3～4 h。接種病毒時, 將CLCrV-B和CLCrV-A的衍生物, TRV-V1和TRV-V2的衍生物1∶1等比例混合, 利用1 mL注射器將轉(zhuǎn)化液注射到Cas9-OE棉花子葉中進行瞬時表達。

1.5 突變檢測

sgRNA可伴隨著病毒的復(fù)制和擴散在棉花體內(nèi)系統(tǒng)的表達, 接種相應(yīng)病毒載體的棉花子葉是sgRNA表達的起點。采用Plant Genomic DNA提取試劑盒分別從接種7～10 d后的CLCrV-B和CLCrV-A衍生物, TRV-V1和TRV-V2衍生物的棉花子葉中提取基因組DNA。利用PCR/RE[17]的方法檢測和基因目標(biāo)位點是否發(fā)生突變, PCR擴增包含目標(biāo)位點的基因組片段, 擴增引物見表1。用靶位點的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物。同時, 未被消化的PCR擴增子被克隆到Blunt Zero平端克隆載體上進行測序。

1.6 不同植物病毒介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率分析

分別提取每一株接種CLCrV-AtU6-26::- sgRNA、TRV-AtU6-26::-sgRNA、CLCrV- AtU6-26::-sgRNA和CLCrV-AtU6-26::-sgRNA棉花葉片基因組DNA。以每一株轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA為模板, 參照和基因組序列進行PCR擴增, 并用靶位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物, 檢測每個單株CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)對和基因的編輯效率。

1.7 不同U6啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率分析

以棉花基因為靶標(biāo), 分別提取每一株接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA和CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA棉花基因組DNA。以每一株轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA為模板進行PCR擴增并用靶位點上的限制性內(nèi)切酶I消化PCR產(chǎn)物, 檢測每個單株在CLCrV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)下, 使用棉花內(nèi)源U6啟動子和擬南芥U6啟動子驅(qū)動-sgRNA表達對棉花基因的編輯效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花Cas9-OE植株Cas9基因表達量檢測

以野生型棉花YZ-1和Cas9-OE棉花cDNA為模板, 進行qRT-PCR擴增。成功檢測到不同Cas9-OE植株中基因穩(wěn)定表達(圖2)。qRT-PCR驗證了在轉(zhuǎn)基因棉花植株中高效表達, 本研究選擇了表達量較高的Cas9-OE: 1～6轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)研究。

圖2 qRT-PCR分析Cas9表達量

在同一指標(biāo)中不同小寫字母表示不同處理在0.05概率水平差異顯著。

Different letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 probability level.

2.2 CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA載體構(gòu)建

將4個AtU6-26::-sgRNA、AtU6-26::-sgRNA、GhU6-5P::-sgRNA和GhU6-5P::-sgRNA分別與CLCrV-A和TRV-V2片段連接, 對8個重組的質(zhì)粒進行酶切鑒定:用I和I對CLCrV-AtU6-26::- sgRNA、CLCrV-AtU6-26::-sgRNA重組質(zhì)粒進行雙酶切, 產(chǎn)生了516 bp和11,300 bp 2條帶, 對CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA、CLCrV-GhU6- 5P::-sgRNA雙酶切, 產(chǎn)生了514 bp和11,300 bp 2條帶; 用I和I對TRV-AtU6- 26::-sgRNA、TRV-AtU6-26::- sgRNA重組質(zhì)粒進行雙酶切, 產(chǎn)生了516 bp和11,003 bp 2條帶, 對TRV-GhU6-5P::- sgRNA、TRV-GhU6-5P::-sgRNA雙酶切, 產(chǎn)生了514 bp和11,003 bp 2條帶, 所有酶切結(jié)果與預(yù)期酶切片段大小相符(圖3), 表明不同CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA載體均已構(gòu)建成功。

2.3 CLCrV和TRV介導(dǎo)靶向敲除棉花GhBsrk1和GhMAPKKK2基因

隨機選取3～4株接種CLCrV-AtU6-26::- sgRNA、CLCrV-AtU6-26::-sgRNA、TRV-AtU6-26::-sgRNA、TRV-AtU6-26::-sgRNA棉花葉片混樣, 提取總DNA。以野生型棉花基因組DNA和混樣DNA為模板, 通過PCR/RE的方法驗證和基因是否在目標(biāo)位點發(fā)生突變。PCR擴增基因(777 bp), 對I酶切未消化的PCR產(chǎn)物進行克隆測序, 發(fā)現(xiàn)所有突變類型都為靶序列區(qū)域堿基的缺失或插入(圖4-A～C)。PCR擴增基因(607 bp), 對I酶切未消化的PCR產(chǎn)物克隆測序, 發(fā)現(xiàn)所有突變類型均為PAM位點上游堿基的缺失(圖4-D～F)。而在對照野生型棉花中,和基因的PCR產(chǎn)物被相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化完全, 幾乎沒有擴增產(chǎn)物殘留。表明利用CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)均能夠?qū)崿F(xiàn)對棉花內(nèi)源基因(A亞組和D亞組)的靶向編輯。

圖3 不同CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA表達載體的酶切鑒定

M: 2K Plus II DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1: CLCrV-AtU6-26::- sgRNA; 2: CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; 3: CLCrV- GhU6-5P::-sgRNA; 4: CLCrV-GhU6-5P::- sgRNA; 5: TRV-AtU6-26::-sgRNA; 6: TRV-AtU6-26::-sgRNA; 7: TRV-GhU6-5P::G-sgRNA; 8: TRV- GhU6-5P::-sgRNA。

M: 2K Plus II DNA marker; 1: CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; 2: CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; 3: CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA; 4: CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA; 5: TRV-AtU6-26::-sgRNA; 6: TRV-AtU6-26::- sgRNA; 7:TRV-GhU6-5P::G-sgRNA; 8:TRV-GhU6-5P::-sgRNA.

(圖4)

M: 2K Plus II DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。A和B:-sgRNA靶向突變檢測。A: WT為對照, 1和2分別為接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA和TRV-AtU6-26::-sgRNA植株編號, 凝膠電泳圖顯示基因經(jīng)I酶切消化的產(chǎn)物和未消化的PCR產(chǎn)物。B: 未消化的PCR產(chǎn)物缺乏I位點(由于存在突變), 隨后進行純化、克隆和測序分析。C:突變測序峰圖; D和E:-sgRNA靶向突變檢測。D: WT為對照, 1和2分別為接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA和TRV-AtU6-26::-sgRNA植株編號, 凝膠電泳圖顯示基因經(jīng)I酶切消化的產(chǎn)物和未消化的PCR產(chǎn)物。E: 未消化的PCR產(chǎn)物缺乏I位點(由于存在突變), 隨后進行純化、克隆和測序分析。F:突變測序峰圖。PAM位點為綠色, 藍色下畫線表示靶序列上的酶切位點?！甅’表示突變序列, ‘+’堿基插入用紅色大寫字母表示, ‘-’堿基缺失用紅色線段表示。

M: 2K Plus II DNA marker. A and B: the detection of-sgRNA targeted mutations. A: wild type served as a control, 1 and 2 are plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA and TRV-AtU6-26::G-sgRNA respectively. The gel image shows digested PCR products ofgene withI and undigested PCR products. B: the undigested PCR products lacking theI site (due to the presence of a mutation) that were subsequently purified, cloned, and analyzed by sequencing. C:mutation sequencing peak map; D and E: the detection of-sgRNA targeted mutations. D: wild type served as a control, 1 and 2 are plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA and TRV-AtU6-26::-sgRNA, respectively. The gel image shows digested PCR products ofgene withI and undigested PCR products. E: the undigested PCR products lacking theI site (due to the presence of a mutation) that were subsequently purified, cloned, and analyzed by sequencing. F:mutation sequencing peak map. Green color indicates the PAM sequence, underline in blue indicates the restriction site on the target sequence. M indicates the mutation sequence, insertions are denoted with red uppercase letters, deletions are shown as red dashes.

2.4 CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率分析

為進一步量化CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率, 提取每一株接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA (8株)、CLCrV-AtU6-26::- sgRNA (12株)、TRV-AtU6-26::-sgRNA (7株)、TRV-AtU6-26::-sgRNA (13株)載體的棉花基因組DNA。對每個單株進行突變檢測, 以野生型為對照。在使用相同啟動子(AtU6-26)驅(qū)動-sgRNA和-sgRNA表達情況下, PCR/RE檢測結(jié)果顯示: 對于基因, CLCrV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率為100% (12/12), TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率為92.31% (12/13); 對于基因, CLCrV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率為75% (6/8), TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率為85.71% (6/7) (圖5)。表明在棉花中針對同一個基因(或者)進行定向編輯, 利用CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)均能夠產(chǎn)生高效的基因編輯效率, 并且2種系統(tǒng)基因編輯效率不存在顯著差異。

2.5 不同U6啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率分析

為探究使用棉花內(nèi)源GhU6-5P啟動子和擬南芥AtU6-26啟動子介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)的基因編輯效率是否存在差異。以基因為靶標(biāo), 提取每一株接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA (12株)、CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA (11株)載體的棉花基因組DNA。對每個單株進行突變檢測, 以野生型為對照。由于CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率無明顯差異, 本研究在CLCrV介導(dǎo)的VIGE下, 探究不同U6啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率。PCR/RE突變檢測結(jié)果顯示: 擬南芥AtU6-26啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率為100% (12/12), 而棉花GhU6-5P啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率同樣為100% (11/11) (圖6)。表明在棉花中使用棉花內(nèi)源U6啟動子和擬南芥U6啟動子驅(qū)動sgRNA表達均能夠產(chǎn)生高效的基因編輯效率, 并且基于這2種啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率不存在顯著差異。這暗示著在同源關(guān)系較遠的不同物種中, U6啟動子是可以替換使用的。

圖5 CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率比較

M: 2K Plus II DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。A: WT為對照, 1～12為接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA單株編號, 13～25為接種TRV-AtU6-26::-sgRNA單株編號。B: WT為對照, 1～8為接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA單株編號, 9～15為接種TRV-AtU6-26::-sgRNA單株編號。

M: 2K Plus II DNA marker. A: wild type, 1–12 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA, 13–25 are individual plant numbers inoculated with TRV-AtU6-26::-sgRNA. B: wild type, 1–8 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA, 9–15 are individual plant numbers inoculated with TRV-AtU6-26::-sgRNA.

圖6 不同U6啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率比較

M: 2K Plus II DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。A: WT為對照, 1～12為接種CLCrV-AtU6-26::-sgRNA單株編號。B: WT為對照, 1～11為接種CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA單株編號。

M: 2K Plus II DNA marker. A: wild type, 1–12 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; B: wild type , 1–11 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA.

3 討論

棉花全基因組測序已經(jīng)完成, 然而棉花功能基因的挖掘以及全基因組序列的生物學(xué)意義還知之甚少。從根源上解析棉花基因功能, 必需要以棉花基因組變異的突變體材料作為研究基礎(chǔ)。對于遺傳轉(zhuǎn)化困難且周期長的棉花而言, 獲得少數(shù)幾個基因編輯的棉花是經(jīng)濟可行的, 但要大規(guī)模構(gòu)建棉花基因突變體庫和實現(xiàn)全基因組水平上的精準(zhǔn)遺傳改良是費錢、費時, 不可想象的。鑒于獲得穩(wěn)定遺傳棉花突變體的時間和難度, 開發(fā)一種快速驗證sgRNAs活性, 進而獲得高效基因編輯效率的方法至關(guān)重要。

利用病毒載體進行基因編輯早已被人們認(rèn)知, 但是由于病毒龐大基因組的限制, 嚴(yán)重阻礙了利用病毒載體進行基因編輯的研究。對于DNA病毒CLCrV和RNA病毒TRV而言, 研究者對病毒基因組進行改造將其組裝在植物表達載體上, 使之成為以農(nóng)桿菌接種的方式侵染棉花葉片, 相繼在陸地棉和海島棉中建立了病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)體系[23-24,28]。雖然這2種病毒載體受限于病毒承載力的限制, 不適于表達Cas9蛋白, 但足以表達sgRNA。以Cas9-OE植株作為VIGE受體, 利用病毒載體單獨投送sgRNA可避免轉(zhuǎn)化完整編輯載體編輯效率低的弊端。本研究為了擴大這2種病毒載體在棉花中的應(yīng)用范圍, 分別在棉花中建立CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)進行測試。在VIGE體系內(nèi), 要想獲得高效的基因編輯效率,基因的高表達是首要關(guān)鍵因素。本研究首先檢測了棉花Cas9-OE植株中的表達量發(fā)現(xiàn),基因在所有Cas9-OE植株中高效表達(圖2), 這為驗證VIGE的有效性和高效性提供了良好的開端。利用CLCrV和TRV病毒載體投送-sgRNA和-sgRNA, 突變分析結(jié)果顯示, 在使用相同啟動子(AtU6-26)驅(qū)動sgRNA表達的情況下, CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE均可以實現(xiàn)棉花內(nèi)源基因(A亞組和D亞組)的靶向編輯, 突變類型主要以堿基的缺失和插入為主(圖4),相比以往本實驗室通過構(gòu)建完整的編輯載體轉(zhuǎn)化棉花原生質(zhì)體獲得較低的編輯效率(大多數(shù)突變類型為點突變)[16], 這2種VIGE系統(tǒng)大大提高了基因編輯的檢出率。為進一步量化CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率, 對每一個轉(zhuǎn)化單株進行突變檢測, 發(fā)現(xiàn)CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE均能夠產(chǎn)生高效的基因編輯效率, 并且2種系統(tǒng)基因編輯效率不存在顯著差異(圖5)。另外, 作為VIGE系統(tǒng)關(guān)鍵元件之一的sgRNA, 使用棉花內(nèi)源U6啟動子驅(qū)動sgRNA表達能否進一步提升VIGE的基因編輯效率？本研究繼續(xù)探究截短的棉花GhU6-5P (363 bp)和擬南芥AtU6-26 (330 bp)啟動子介導(dǎo)的VIGE (CLCrV)對每一個轉(zhuǎn)化單株的基因編輯情況發(fā)現(xiàn), 棉花內(nèi)源U6啟動子和擬南芥U6啟動子介導(dǎo)的VIGE均能夠產(chǎn)生高效的基因編輯效率, 并且基于這2種啟動子介導(dǎo)的VIGE基因編輯效率不存在顯著差異(圖6)。與此同時, 本研究結(jié)果也證明了U6啟動子在同源關(guān)系較遠的不同物種之間是可以替換使用的。在今后的研究中CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)或許還可以借助核糖核酸酶或者tRNA的幫助使用一個U6啟動子同時表達多個sgRNAs, 實現(xiàn)多基因編輯。

另外, 本研究還通過Hi-TOM高通量測序檢測了部分突變單株的真實編輯效率, 突變效率在15.74%～42.68%之間。推測造成不同植株編輯效率存在差異的因素可能與植株自身基因表達量以及sgRNA伴隨著病毒復(fù)制、擴散能力有關(guān), sgRNA并不是在所有病毒侵染的組織細胞中都表達產(chǎn)生靶向突變。盡管病毒可以高效投送sgRNAs, 實現(xiàn)靶基因的定向編輯。但該事件只能發(fā)生在當(dāng)代植株體內(nèi), 由于植物自身存在某種特殊機制使得病毒難以進入到植物的頂端分生組織(SAM)中[29], 實現(xiàn)植物生殖細胞的編輯, 因此基因編輯無法遺傳給后代。近期有研究表明將可移動RNA元件(和tRNA)與sgRNA融合后克隆到TRV病毒載體中, 能夠?qū)gRNA長距離運輸至煙草的SAM中, 并以較高的效率產(chǎn)生可遺傳的基因編輯[30]。除此之外, 研究還發(fā)現(xiàn)不修飾的BSMV病毒傳遞sgRNA能夠直接在超表達Cas9的小麥中獲得可遺傳的基因編輯[31]。這些研究成果為利用VIGE系統(tǒng)在棉花中實現(xiàn)可遺傳的基因編輯后代提供了借鑒, 后期的工作仍需開展突破棉花遺傳轉(zhuǎn)化途徑限制的研究, 從而獲得棉花突變體進行功能驗證。

以上結(jié)果顯示基于CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng)在棉花上的成功應(yīng)用, 預(yù)示著通過將更多種病毒作為VIGE載體, 在棉花上進行驗證是有可能篩選到適合的VIGE系統(tǒng)的, 這為定向創(chuàng)制棉花突變體材料奠定了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在棉花中分別建立了CLCrV和TRV介導(dǎo)的VIGE系統(tǒng), 這2個系統(tǒng)均可以實現(xiàn)棉花內(nèi)源基因的定向編輯, 且基因編輯效率不存在顯著差異; 使用棉花內(nèi)源U6啟動子或者異源U6啟動子驅(qū)動sgRNA表達都可以獲得高效的基因編輯效率。研究結(jié)果預(yù)示著將來可以開發(fā)更多的植物病毒應(yīng)用于農(nóng)作物基因編輯的研究。

[1] Chen K L, Gao C X. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements., 2014, 33: 575–583.

[2] Zhou H B, Liu B, Weeks D P,Spalding M H, Yang B. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice., 2015, 42: 10903–10914.

[3] Alok A, Sandhya D, Jogam P, Rodrigues V, Bhati K K, Sharma H, Kumar J. The rise of the CRISPR/Cpf1 system for efficient genome editing in plants., 2020, 11: 264.

[4] Wang C, Liu Q, Shen Y, Hua Y F, Wang J J, Lin J R, Wu M G, Sun T T, Cheng Z K, Mercier R, Wang K J. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes., 2019, 37: 283–286.

[5] Zhang S J, Zhang R Z, Song G Q, Gao J, Li W, Han X D, Chen M L, Li Y L, Li G Y. Targeted mutagenesis using the-mediated CRISPR-Cas9 system in common wheat., 2018, 18: 302.

[6] Wang D D, Samsulrizal N, Yan C, Allcock N S, Craigon J, Blanco-Ulate B, Ortega-Salazar I, Marcus S E, Bagheri H M, Fons L P, Fraser P D, Foster T, Fray R, Knox J P, Seymour G B. Characterization of CRISPR mutants targeting genes modulating pectin degradation in ripeningtomato., 2019, 179: 544–557.

[7] Osakabe Y, Liang Z C, Ren C,Nishitani C, Osakabe K, Wada M, Komori S, Malnoy M, Velasco R, Poli M, Jung M H, Koo O J, Viola R, Kanchiswamy C N. CRISPR-Cas9-mediated genome editing inapple and grapevine., 2018, 13: 2844–2863.

[8] Jiang W Z, Zhou H B, Bi H H, Fromm M, Yang B, Weeks D P. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in, tobacco, sorghum and rice., 2013, 41: e188.

[9] Chen X G, Lu X K, Shu N, Wang S, Wang J J, Wang D L, Guo L X, Ye W W. Targeted mutagenesis in cotton (L.) using the CRISPR/Cas9 system., 2017, 7: 44304.

[10] Long L, Guo D D, Gao W, Yang W W, Hou L P, Ma X N, Miao Y C, Botella J R, Song C P. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing in cotton by improved sgRNA expression., 2018, 14: 85.

[11] Manghwar H, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. CRISPR/Cas system: recent advances and future prospects for genome editing., 2019, 24: 1102–1125.

[12] Li B, Rui H P, Li Y J, Wang Q Q, Alariqi M, Qin L, Sun L, Ding X, Wang F Q, Zou J W, Wang Y Q, Yuan D J, Zhang X L, Jin S X. Robust CRISPR/Cpf1 (Cas12a)-mediated genome editing in allotetraploid cotton ()., 2019, 17: 1862–1864.

[13] Qin L, Li J Y, Wang Q Q, Xu Z P, Sun L, Alariqi M, Manghwar H, Wang G Y, Li B, Ding X, Rui H P, Huang H M, Lu T L, Lindsey K, Daniell H, Zhang X L, Jin S X. High-efficient and precise base editing of C?G to T?A in the allotetraploid cotton () genome using a modified CRISPR/Cas9 system., 2019, 18: 45–56.

[14] Zhao C Z, Wang Y L, Nie X W, Han X S, Liu H L, Li G L, Yang G J, Ruan J X, Ma Y L, Li X Y, Cheng H J, Zhao S H, Fang Y P, Xie S S. Evaluation of the effects of sequence length and microsatellite instability on single-guide RNA activity and specificity., 2019, 15: 2641–2653.

[15] Xie S S, Shen B, Zhang C B, Huang X X, Zhang Y L. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites., 2014, 9: e100448.

[16] 李繼洋, 雷建峰, 代培紅, 姚瑞, 曲延英, 陳全家, 李月, 劉曉東. 基于棉花U6啟動子的海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯體系的建立. 作物學(xué)報, 2018, 44: 227–235.

Li J Y, Lei J F, Dai P H, Yao R, Qu Y Y, Chen Q J, Li Y, Liu X D. Establishment of CRISPR/Cas9 genome editing system based on GbU6 promoters in cotton (L.)., 2018, 44: 227–235 (in Chinese with English abstract).

[17] Gao W, Long L, Tian X Q, Xu F C, Liu J, Singh P K, Botella J R, Song C P. Genome editing in cotton with the CRISPR/Cas9 system., 2017, 8: 1364.

[18] Yin K Q, Han T, Liu G, Chen T Y, Wang Y, Alice Y Y, Liu Y L. A geminivirus-based guide RNA delivery system for CRISPR/Cas9 mediated plant genome editing., 2015, 5: 14926.

[19] Hu J C, Li S, Li Z L, Li H Y, Song W B, Zhao H M, Lai J S, Xia L Q, Li D W, Zhang Y L. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize., 2019, 20: 1463–1474.

[20] Li T D, Hu J C, Sun Y,Li B S, Zhang D L, Li W L, Liu J X, Li D W, Gao C X, Zhang Y L, Wang Y P. Highly efficient heritable genome editing inwheat using an RNA virus and bypassing tissue culture., 2021, 14: 1787–1798.

[21] Luo Y J, Na R, Nowak J S, Qiu Y, Lu Q S, Yang C Y, Marsolais F, Tian L N. Development of a-processed guide RNA delivery system with soybean-infecting virus ALSV for genome editing., 2021, 21: 419.

[22] Lei J F, Dai P H, Li Y, Zhang W Q, Zhou G T, Liu C, Liu X D. Heritable gene editing usingmobile guide RNAs and DNA viruses., 2021, 17: 20.

[23] Gu Z H, Huang C J, Li F F, Zhou X P. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton., 2014, 12: 638–649.

[24] Zhang J X, Wang F R, Zhang C Y, Zhang J H, Chen Y, Liu G D, Zhao Y X, Hao F S, Zhang J. A novel VIGS method by agroinoculation of cotton seeds and application for elucidating functions ofin salt-stress response., 2018, 37: 1091–1100.

[25] 周冠彤, 雷建峰, 代培紅, 劉超, 李月, 劉曉東. 棉花CRISPR/Cas9基因編輯有效sgRNA高效篩選體系的研究. 作物學(xué)報, 2021, 47: 427–437.

Zhou G T, Lei J F, Dai P H, Liu C, Li Y, Liu X D. Efficient screening system of effective sgRNA for cotton CRISPR/Cas9 gene editing., 2021, 47: 427–437 (in Chinese with English abstract)

[26] 雷建峰, 李月, 徐新霞, 阿爾祖古麗·塔什, 蒲艷, 張巨松, 劉曉東. 棉花不同GbU6啟動子截短克隆及功能鑒定. 作物學(xué)報, 2016, 42: 675–683.

Lei J F, Li Y, Xu X X, A’erzuguli T, Pu Y, Zhang J S, Liu X D. Cloning and functional analysis of different truncated GbU6 promoters in cotton., 2016, 42: 675–683 (in Chinese with English abstract).

[27] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCTmethod., 2001, 25: 402–408.

[28] Wang W N, Yuan Y L, Yang C, Geng S P, Sun Q, Long L, Cai C W, Chu Z Y, Liu X, Wang G H, Du X M, Miao C, Zhang X, Cai Y F.Characterization, expression, and functional analysis of a novelgene associated with resistance to Verticillium wilt and abiotic stress in cotton., 2016, 6: 3951–3961.

[29] Wu H J, Qu X Y, Dong Z C, Luo L J, Shao C, Forner J, Lohmann J U, Su M, Xu M C, Liu X B, Zhu L, Zeng J, Liu S M, Tian Z X, Zhao Z.triggers innate antiviral immunity in plant stem cells., 2020, 370: 227–231.

[30] Ellison E E, Nagalakshmi U, Gamo M E, Huang P J, Dinesh-Kumar S, Voytas D F. Multiplexed heritable gene editing using RNA viruses and mobile single guide RNAs., 2020, 6: 620–624.

[31] Li T D, Hu J C, Sun Y, Li B S, Zhang D L, Li W L, Liu J X, Li D W, Gao C X, Zhang Y L, Wang Y P. Highly efficient heritable genome editing in wheat using an RNA virus and bypassing tissue culture., 2021, 14: 1787–1798.

Study on VIGE system mediated by different plant viruses in cotton

LEI Jian-Feng1, LI Yue2, DAI Pei-Hong2, ZHAO Yi2, YOU Yang-Zi2, JIA Jian-Guo1, ZHAO Shuai1, QU Yan-Ying1,*, and LIU Xiao-Dong2,*

1College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University / Research Center of Cotton Engineering, Ministry of Education, Urumqi 830052, Xinjiang, China;2College of Life Sciences, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China

Plant virus-mediated sgRNA delivery and expression has tremendous advantage over traditional transformation of intact editing vectors for gene editing, because sgRNA expression can be rapidly amplified and be accumulated along with virus replication and movement, resulting in efficient gene editing efficiency. In this study, to develop and apply more plant virus-mediated gene editing (VIGE) systems in cotton, the overexpressing Cas9 (Cas9-OE) cotton was used as VIGE receptor and the cotton leaf crumple virus (CLCrV) and tobacco rattle virus (TRV) mediated VIGE systems were established in cotton. First of all, both CLCrV and TRV-mediated VIGE could target and knock out theandin subgroup A and subgroup D genomic sequences, which verified the feasibility and effectiveness of these two systems. Further quantificaiton of the editing efficiency ofandgenes by these two systems showed that both CLCrV and TRV-mediated VIGE could produce high-efficiency gene editing efficiency, and there was no significant difference in gene editing efficiency between the two systems. This study also explored the effect of sgRNAs driven by cotton endogenous U6 promoter andU6 promoter on VIGEgene editing efficiency. The results showed that both promoter-mediated VIGE were able to produce high-efficiency gene editing efficiency, and there was no significant difference in gene editing efficiency based on these two promoter-mediated VIGE systems. The above results indicate that more plant virus vectors can be developed for the application of cotton gene editing research, thus obtaining an efficient sgRNA screening system.

cotton; CLCrV; TRV; VIGE; gene editing

10.3724/SP.J.1006.2023.24071

本研究由新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2022D01B23)和自治區(qū)高校基本科研業(yè)務(wù)費科研項目(XJEDU2022J007)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2022D01B23) and the Basic Research Funds for Universities in the Autonomous Region (XJEDU2022J007).

劉曉東, E-mail: xiaodongliu75@aliyun.com; 曲延英, E-mail: xjyyq5322@126.com

E-mail: kyleijianfeng@163.com

2022-03-30;

2022-07-21;

2022-08-17.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220816.1830.008.html

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