孫全喜 苑翠玲 牟藝菲 閆彩霞 趙小波 王 娟 王 奇 孫 慧 李春娟 單世華,*

花生SWEET基因全基因組鑒定及表達(dá)分析

孫全喜1苑翠玲1牟藝菲1閆彩霞1趙小波1王 娟1王 奇1孫 慧2李春娟1單世華1,*

1山東省花生研究所, 山東青島 266100;2東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 黑龍江哈爾濱 150038

SWEET (sugars will eventually be exported transporter)蛋白是一類結(jié)構(gòu)保守、不依賴能量的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 在植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)生物/非生物逆境脅迫等生理過程發(fā)揮重要作用。目前, 尚未見花生SWEET基因相關(guān)報(bào)道。本研究首次全基因組挖掘了花生SWEET基因, 對(duì)其分子特征及表達(dá)模式進(jìn)行了細(xì)致分析。結(jié)果表明, 栽培種花生和2個(gè)祖先野生種基因組分別存在55、25、28個(gè)SWEET基因, 隨機(jī)不均勻分布在各染色體上。來源于野生種和栽培種的同源基因在染色體位置相近, 但也存在個(gè)別缺失, 這驗(yàn)證了花生野生種和栽培種的進(jìn)化關(guān)系, 也暗示了基因組復(fù)制加倍過程中存在同源基因的丟失或擴(kuò)張。基因內(nèi)含子-外顯子數(shù)目和位置以及啟動(dòng)子中順式作用元件種類和數(shù)量均存在差異, 暗示了花生SWEET基因生物學(xué)功能的多樣性。系統(tǒng)進(jìn)化分析將花生SWEET基因分為4個(gè)亞家族Clade I～Clade IV, 同一亞家族同一分支的基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。分析Clevenger等組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)部分基因表現(xiàn)為組織優(yōu)勢(shì)表達(dá), 這為深入了解SWEET基因行使功能部位提供了參考。此外, 基于課題組前期發(fā)表的干旱和高鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組分析和RT-qPCR驗(yàn)證, 我們挖掘出和等響應(yīng)花生干旱或高鹽脅迫的基因, 功能有待進(jìn)一步鑒定。研究結(jié)果為下一步深入分析花生SWEET基因功能提供了理論參考。

SWEET基因家族; 分子特征; 表達(dá)分析; 非生物脅迫; 花生

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物, 是重要的植物油脂和蛋白質(zhì)來源。其在生長(zhǎng)過程中經(jīng)常遭受各種逆境脅迫(如干旱、鹽堿等), 從而影響花生產(chǎn)量[1-2]。選育抗逆花生品種是解決這一問題的有效途徑。抗逆基因的挖掘是花生抗性育種的基礎(chǔ), 對(duì)借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)或分子輔助育種選育抗逆花生品種,推動(dòng)我國花生產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展, 從而保障我國食用油脂安全具有重要意義。

隨著花生基因組測(cè)序的完成, 在科研工作者的共同努力下, 一些參與調(diào)控花生抗逆的基因被陸續(xù)克隆[1,3]。然而由于栽培種花生(L.)是異源四倍體(AABB), 基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 分子水平的研究仍然相對(duì)滯后。近些年, SWEET (sugars will eventually be exported transporter)基因家族因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫等, 逐漸受到研究者關(guān)注。該類蛋白是結(jié)構(gòu)保守、不依賴能量的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 一般有7個(gè)跨膜螺旋組成, 包含2個(gè)MtN3/saliva結(jié)構(gòu)域[4]。該類基因廣泛存在于植物基因組中。2010年, Chen等[5]在擬南芥中第一次鑒定出SWEET基因()。目前已經(jīng)在模式植物擬南芥中鑒定出17個(gè)SWEET基因成員[5], 水稻中鑒定出21個(gè)成員[6]。聚類分析發(fā)現(xiàn), 擬南芥SWEET家族蛋白可被分為4個(gè)分支(Clade I～Clade IV), 其中Clade I包括AtSWEET1～AtSWEET3, Clade II包括AtSWEET4～ AtSWEET8, Clade III包括AtSWEET9～AtSWEET15, Clade IV包括AtSWEET16～AtSWEET17[7]。不同SWEET家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)糖的種類不同, 且具有不同的組織表達(dá)模式, 暗示了SWEET基因在植物中具有多種重要的生理功能[8-9]。

研究發(fā)現(xiàn), 在擬南芥、水稻等模式植物中, 許多SWEET基因在干旱、高鹽、低溫等非生物逆境脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)[10]。這可能是因?yàn)槟婢硹l件下, 植物細(xì)胞內(nèi)部需要大量積累一些物質(zhì)(如糖類等), 來維持細(xì)胞內(nèi)蛋白不被脫水或變性, 而這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是借助SWEET蛋白來實(shí)現(xiàn)的[11]。擬南芥和調(diào)控植株對(duì)低溫脅迫的耐受性, 且其表達(dá)量在水分缺失條件下上升[12-13]。磷酸化修飾AtSWEET11和AtSWEET12可增強(qiáng)蛋白寡聚化, 從而增強(qiáng)它們的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性, 促進(jìn)蔗糖從地上部分向根系的長(zhǎng)距離運(yùn)輸, 進(jìn)而促進(jìn)干旱下根系的生長(zhǎng), 提高植物根冠比和抗旱性[14]。基因表達(dá)受高鹽、干旱和低溫脅迫誘導(dǎo), 過表達(dá)該基因的擬南芥對(duì)鹽脅迫變得敏感, 其突變體植株對(duì)高鹽脅迫的耐受性明顯高于野生型[15]。低溫、滲透或低氮條件下,基因表達(dá)量降低, 但過量表達(dá)該基因的擬南芥植株耐寒性及對(duì)氮的利用效率提高[16]。過量表達(dá)基因擬南芥耐寒性亦能顯著提高[17]。水稻和是干旱和高鹽脅迫下轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的主要載體, 其受ABA信號(hào)響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[18]。此外, 茶樹和基因在低溫脅迫條件下表達(dá)量上升[19]。石竹能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高鹽、滲透等脅迫的耐受性[20]。越來越多的證據(jù)表明,基因在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

目前尚未見花生基因的相關(guān)研究報(bào)道。本研究全面鑒定和分析了花生SWEET家族基因, 借助前期研究中RNA-Seq數(shù)據(jù)分析了它們?cè)诓煌M織、不同逆境脅迫下的表達(dá)模式, 從中篩選出和等響應(yīng)花生抗旱、耐鹽基因成員, 旨在為下一步深入鑒定基因功能以及挖掘花生抗旱、耐鹽基因提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試驗(yàn)材料為課題組培育的高產(chǎn)廣適栽培種花生品種“花育9307”。用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡種子20 min進(jìn)行表面消毒, 蒸餾水洗凈后浸泡3 h, 浸種后均勻鋪放在墊有雙層濾紙的150 mm (直徑)無菌培養(yǎng)皿中, 加少量無菌蒸餾水, 用濕潤(rùn)的紗布覆蓋保持種子濕潤(rùn), 置于光照培養(yǎng)箱。培養(yǎng)箱的光/暗周期為16 h/8 h, 溫度為25℃/20℃。待種子萌發(fā)后, 挑選發(fā)芽均勻一致的種子(芽長(zhǎng)約為種子長(zhǎng)度的1/2), 將根浸沒于Hoagland培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至30 d左右, 將一部分植株根部浸沒于20%的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫處理, 一部分浸沒于10% NaCl溶液模擬高鹽脅迫處理。分別于0 h (CK)、6 h、12 h、24 h、48 h后取花生幼根, 立即液氮冷凍后, 置于-80℃冰箱備用。

1.2 花生SWEET基因成員鑒定

所有花生SWEET基因組、CDS、蛋白質(zhì)及啟動(dòng)子序列等均下載自花生基因組PeanutBase網(wǎng)站(https://www.peanutbase.org/search/gene)。將每個(gè)SWEET蛋白質(zhì)序列在NCBI (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam (http://pfam. xfam.org/)分別進(jìn)行比對(duì), 確定MtN3/saliva/SWEET (PQ-loop repeat)位置及跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)數(shù)量, 去除缺失MtN3/saliva/SWEET結(jié)構(gòu)域的序列, 最終獲取花生SWEET基因。利用ExPASy (https://www. expasy.org/)在線分析各SWEET蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)和分子量(molecular weight, MW)。擬南芥同源基因通過BLASTp (https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線比對(duì)獲取。

1.3 染色體位置、基因結(jié)構(gòu)及順式作用元件分析

利用在線網(wǎng)站MG2C (http://mg2c.iask.in/mg2c_ v2.1/)對(duì)染色體位置進(jìn)行可視化分析, 由Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/)繪制基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)圖。取基因起始密碼子上游2500 bp序列進(jìn)行分析, 由在線網(wǎng)站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和New PLACE (https://www.dna.affrc. go.jp/PLACE/?action=newplace)預(yù)測(cè)序列中存在的順式作用元件種類、數(shù)量及位置。

1.4 序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析

擬南芥SWEET基因序列下載自TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/), 水稻SWEET基因序列下載自RGAP網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。利用ClustalW對(duì)SWEET全長(zhǎng)蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì), 由MEGA 6.0軟件采用鄰接法(Neighbor- Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 參數(shù)設(shè)置為1000 bootstrap重復(fù)。

1.5 表達(dá)譜分析及熱圖繪制

花生22個(gè)不同發(fā)育時(shí)期不同組織轉(zhuǎn)錄組信息來自Clevenger等[21], 使用HemI軟件對(duì)各基因FPKM值進(jìn)行l(wèi)og2標(biāo)準(zhǔn)化后繪制差異基因表達(dá)量熱圖。干旱和高鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組信息分別來自Zhao等[22]和Zhang等[23], 各基因表達(dá)量變化倍數(shù)使用HemI軟件以熱圖形式展示。

1.6 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

用MiniBEST植物RNA提取試劑盒提取總RNA (TaKaRa公司), 利用PrimeScript RT-PCR (TaKaRa公司)將其反轉(zhuǎn)錄為第1鏈互補(bǔ)鏈DNA (cDNA)。RT-qPCR用TB Green Premix ExII試劑盒, 反應(yīng)體系為: 模板cDNA 20 ng, 10 μL of TB Green Premix ExII (2×), 上下游引物(表1)各400 nmol L–1,加ddH2O至20 μL。在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR,反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán)。利用2–ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平, 每個(gè)樣品重復(fù)3次, 以花生基因[24]作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生SWEET基因的鑒定與分析

本研究在野生種花生(AA)和(BB)以及栽培種花生(AABB)基因組中分別挖掘出25、28和55個(gè)SWEET基因(表2), 栽培種花生SWEET基因數(shù)目幾乎是2個(gè)野生種花生的總和。根據(jù)與模式植物擬南芥SWEET基因同源關(guān)系分析, 將其分別命名為～、～和～。除擬南芥和外, 在野生種和栽培種花生均有對(duì)應(yīng)的同源蛋白存在(表2)?；ㄉ鶶WEET基因分別編碼60～488個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)等電點(diǎn)(pI)在5.09～10.17之間, 分子量(MW) 10.7～54.5 kD。每個(gè)蛋白包含1～2個(gè)MtN3/saliva/ SWEET (PQ-loop repeat)保守區(qū), 1～9個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane domain, TMD)。其中, 56個(gè)基因有7個(gè)TMD, 31個(gè)基因有5～6個(gè)TMD。

表1 本研究所用PCR引物

2.2 染色體分布及進(jìn)化關(guān)系分析

除野生種花生A2、A9、B2染色體以及栽培種2號(hào)、9號(hào)染色體, 各染色體均有SWEET基因分布, 且大部分基因在染色體的兩端分布(圖1)。其中, B3和8號(hào)染色體是包含SWEET基因最多的染色體, 各含有8個(gè)基因。A3、A8、4號(hào)、13號(hào)染色體各6個(gè)基因, 3號(hào)染色體5個(gè)基因, A4、B8、14號(hào)染色體各4個(gè)。其余染色體均包含1～3個(gè)SWEET基因。同源基因在不同染色體上位置相近, 比如,、、和基因分別位于野生種A10、B10染色體以及栽培種10號(hào)、20號(hào)染色體。

為更好地了解花生SWEET蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 將花生屬(88個(gè))、擬南芥(17個(gè))和水稻(20個(gè)) SWEET蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì), 構(gòu)建無根進(jìn)化樹(圖2)。根據(jù)進(jìn)化樹分支, 分為Clade I、Clade II、Clade III、Clade IV 4個(gè)亞家族, 其中Clade I包括～、、、～和～, Clade II包括～、～～、～和～, Clade III包括～、～、～、～和～, Clade IV包括～、～、～、～和～。

圖1 花生基因組SWEET基因的染色體定位

圖2 擬南芥、水稻和花生SWEET蛋白的聚類分析

At: 擬南芥; Os: 水稻; Ad: 野生花生; Ai: 野生花生; Ah: 栽培種花生。

At:; Os: rice; Ad: wild peanut; Ai: wild peanut; Ah: cultivated peanut.

2.3 基因結(jié)構(gòu)及順式作用元件分析

為進(jìn)一步研究SWEET基因同源關(guān)系, 本研究分析了栽培種花生SWEET基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 所有基因均具有2～14個(gè)外顯子, 其中包含有14個(gè)外顯子。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹和基因結(jié)構(gòu)圖分析發(fā)現(xiàn), 位于進(jìn)化樹同一分支的大多數(shù)SWEET基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。如、、和均含有5個(gè)外顯子, 且外顯子位置相似。

花生SWEET基因啟動(dòng)子區(qū)域富含響應(yīng)脫落酸、乙烯、赤霉素、茉莉酸和水楊酸等激素以及干旱、低溫等逆境脅迫相關(guān)順式作用元件(表3)。每個(gè)SWEET基因啟動(dòng)子含有5個(gè)以上順式作用元件。其中,啟動(dòng)子序列存在至少30個(gè)元件, 包括響應(yīng)低溫脅迫的as-1元件7個(gè)、響應(yīng)MeJA激素的TGACG元件和CGTCA元件各7個(gè), 以及其他一些響應(yīng)干旱、乙烯、赤霉素等元件?；ㄉ鶶WEET基因啟動(dòng)子序列存在數(shù)目最多的順式作用元件是響應(yīng)ABA的ABRE元件和響應(yīng)乙烯的ERE元件, 分別有190個(gè)和137個(gè)。表明SWEET基因可能在花生響應(yīng)逆境脅迫等反應(yīng)中發(fā)揮重要作用?；ㄉ鶶WEET基因家族的啟動(dòng)子中含有多個(gè)響應(yīng)脫激素以及逆境脅迫相關(guān)順式作用元件, 但不同啟動(dòng)子含順式作用元件的類型和數(shù)量有差異, 預(yù)示了花生SWEET基因功能上存在的差異。

圖3 花生SWEET基因結(jié)構(gòu)

2.4 組織表達(dá)模式分析

對(duì)野生種花生不同發(fā)育時(shí)期22個(gè)不同組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 各SWEET基因在花生各組織均有不同程度的表達(dá)(圖4)。部分基因在某些組織中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)表達(dá), 比如、、、等基因在花的雌蕊和雄蕊中有較高的表達(dá)量。此外,、、、、等也表現(xiàn)出在雌蕊和雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。暗示這些SWEET基因可能在花發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。此外, 同源基因表現(xiàn)出相近的表達(dá)模式, 比如,、和均在種子中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 暗示在花生種子發(fā)育過程發(fā)揮作用相同或相似的作用。

圖4 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析SWEET基因在不同發(fā)育時(shí)期22個(gè)不同組織表達(dá)模式

2.5 不同逆境脅迫下表達(dá)模式分析

為挖掘響應(yīng)干旱、高鹽等逆境脅迫的花生SWEET基因, 本研究利用前期花生干旱和高鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了SWEET基因的表達(dá)情況(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 栽培種花生55個(gè)SWEET基因中, 14個(gè)基因在干旱脅迫下表達(dá)出現(xiàn)2倍以上的變化, 12個(gè)在鹽脅迫下表達(dá)變化2倍以上。其中、和在干旱和高鹽脅迫下表達(dá)量均提高,在干旱和鹽脅迫下表達(dá)量均表現(xiàn)下降。和在干旱脅迫下表達(dá)量提高, 而在鹽脅迫下表達(dá)量降低。、和表達(dá)量只在干旱脅迫下有變化, 均提高了8倍以上。和只響應(yīng)鹽脅迫, 表達(dá)量分別提高了9.7倍和7.9倍。

本研究利用RT-qPCR分析了部分響應(yīng)干旱和高鹽脅迫的SWEET基因表達(dá)情況(圖6)。與比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致,和在干旱和高鹽脅迫下, 表達(dá)量均提高;只在受干旱脅迫時(shí)表達(dá)量上升;和干旱脅迫下表達(dá)量提高, 受鹽脅迫表達(dá)量降低。在干旱條件下表達(dá)量上升, 而在鹽脅迫下表現(xiàn)為下調(diào)。這暗示這些基因在花生應(yīng)對(duì)干旱和高鹽脅迫等逆境條件下發(fā)揮重要作用。

圖5 干旱和鹽脅迫條件下花生SWEET基因表達(dá)模式

圖6 不同脅迫條件下花生SWEET基因表達(dá)分析

3 討論

SWEET基因家族是一類新型的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 在植物生長(zhǎng)發(fā)育、病原菌互作以及逆境調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用[8,10]。目前, 擬南芥、水稻、小麥等SWEET基因家族已經(jīng)陸續(xù)被研究[5-6,25]。然而至今未見花生SWEET基因研究的報(bào)道?；ㄉ蚪M測(cè)序的完成及公布, 為SWEET家族全基因組鑒定及抗逆基因挖掘等提供了極為有利的條件。

本研究從栽培種花生基因組中挖掘出55個(gè)SWEET基因(表2), 數(shù)量遠(yuǎn)高于被子植物SWEET數(shù)量平均值20個(gè)[7], 類似現(xiàn)象在六倍體小麥、四倍體馬鈴薯等作物中存在, 分別有59個(gè)和35個(gè)SWEET基因[25-26]。栽培種花生SWEET基因數(shù)目接近野生種花生(25個(gè))和(28個(gè))的總和, 這可能是由于異源四倍體栽培種花生在基因復(fù)制和加倍過程中, 發(fā)生串聯(lián)重復(fù)[26]或突變導(dǎo)致基因假基因化或新功能化[27]。擬南芥基因組存在～基因[5], 但水稻基因組無～同源基因[6]。Gao等[25]發(fā)現(xiàn)小麥基因組缺乏～的同源基因, 推測(cè)這可能來自雙子葉植物和單子葉植物的區(qū)別。本研究發(fā)現(xiàn)花生基因組不存在和同源基因(表2)。除和外, 每個(gè)擬南芥SWEET基因在花生基因組中均存在1個(gè)以上同源基因(表2)。因此, 借助已知功能的擬南芥同源基因, 可以初步預(yù)測(cè)花生SWEET基因功能。

染色體定位分析發(fā)現(xiàn)花生SWEET基因大多分布于染色體的兩端, 且部分基因成簇出現(xiàn), 比如栽培種花生、和集中于8號(hào)染色體大約47.8 Mb處(圖1), 推測(cè)它們可能功能冗余或者協(xié)同行使作用。這可能是由于進(jìn)化過程中基因串聯(lián)復(fù)制或染色體復(fù)制加倍產(chǎn)生, 以便增強(qiáng)花生適應(yīng)環(huán)境的能力[28]。此外, 栽培種花生SWEET基因與其野生種直系同源基因在染色體位置相似(圖1), 這與異源四倍體花生(AABB)由2個(gè)野生種(AA)和(BB)染色體加倍和重組形成的結(jié)論一致[28]。比如, 野生種花生A1和B1染色體上的和, 在重組進(jìn)化過程中分別演變成栽培種花生1號(hào)、11號(hào)染色體上的和。在野生種A10、B10染色體以及栽培種10號(hào)、20號(hào)染色體各存在同源基因、、和, 栽培種20號(hào)染色體還存在一個(gè)。這可能是由于在全基因組加倍過程中, 一些同源基因發(fā)生丟失或擴(kuò)張[29]。

研究發(fā)現(xiàn)花生SWEET家族蛋白的結(jié)構(gòu)域保守性較高, 所有成員均具有1個(gè)以上的MtN3/saliva結(jié)構(gòu)域以及跨膜區(qū)域(表2)。內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)模式攜帶有基因家族進(jìn)化的烙印[27]。由于外顯子數(shù)目和位置差別較大, 導(dǎo)致花生SWEET基因在長(zhǎng)度和蛋白質(zhì)大小存在較大差異(表2和圖3), 暗示了花生SWEET基因功能的多樣性。聚類分析發(fā)現(xiàn), 與擬南芥、水稻等一致, 花生SWEET基因可分為Clade I、Clade II、Clade III、Clade IV 四個(gè)亞家族, 大部分花生SWEET基因?qū)儆贑lade III亞家族(圖2)。直系同源基因表現(xiàn)出相似的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu), 比如同屬Clade III分支的、以及和等基因均具有6個(gè)外顯子, 且位置相似(圖3), 我們推測(cè)其具有相似的功能。來源不同但屬于相同Clade的基因往往具有共同的進(jìn)化起源和保守功能[5-6,30], 可以通過了解已知基因成員的功能來預(yù)測(cè)同源基因的功能。

基因組織表達(dá)模式能反應(yīng)基因行使功能所在的部位, 甚至可以預(yù)測(cè)基因的功能。Clevenger等[21]繪制了花生22個(gè)不同發(fā)育時(shí)期不同組織表達(dá)譜, 這為分析花生SWEET基因表達(dá)模式提供了便利。結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分SWEET基因表現(xiàn)為組織優(yōu)勢(shì)表達(dá), 比如、、、、、、、等基因在花生雄蕊或雌蕊中具有極高的表達(dá)量(圖4)。研究表明與以上基因位于同一進(jìn)化分支的、、等基因參與調(diào)控了擬南芥花發(fā)育[31-33], 暗示它們?cè)诨ㄉ称鞴侔l(fā)育中發(fā)揮重要作用。野生種花生和基因組分別與栽培種A、B基因組具有98.66%和99.96%的同源性[28], 我們認(rèn)為Clevenger等[21]表達(dá)譜數(shù)據(jù)可以用于預(yù)測(cè)栽培種花生同源基因表達(dá)模式。基于前期本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及RT-qPCR分析, 本研究鑒定出、和等潛在抗旱基因, 其中和在高鹽脅迫下表達(dá)量也顯著提高(圖6)。之前的研究表明,同源基因的表達(dá)受高鹽、干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)[15]。因此, 我們認(rèn)為這些候選基因可能在花生抗旱或耐鹽信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究首次在栽培種花生及其2個(gè)祖先野生種基因組中鑒定出55、25、28個(gè)SWEET基因, 并對(duì)其分子特征進(jìn)行了細(xì)致描述?；ㄉ鶶WEET基因內(nèi)含子-外顯子數(shù)目和位置以及啟動(dòng)子中順式作用元件種類和數(shù)量均存在差異。進(jìn)化樹分析將它們分成4個(gè)亞家族Clade I～Clade IV, 同一亞家族同一分支的基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。來源于野生種和栽培種的SWEET同源基因在各染色體位置相近, 但也存在個(gè)別的缺失。22個(gè)不同發(fā)育時(shí)期不同組織基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)部分基因表現(xiàn)出組織特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)?；谇捌诎l(fā)表的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析以及RT-qPCR挖掘出和等響應(yīng)花生干旱或高鹽脅迫的基因, 功能有待進(jìn)一步鑒定。研究結(jié)果為下一步深入分析花生SWEET基因功能奠定了基礎(chǔ)。

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Genome-wide identification and expression analysis of SWEET genes from peanut genomes

sun quan-xi1, YUAN Cui-Ling1, mou yi-fei1, Yan cai-xia1, zhao xiao-bo1,wang juan1, wang qi1, SUN Hui2, LI Chun-Juan1, and shan shi-hua1,*

1Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong, China;2Northeast Agricultural University, Harbin 150038, Heilongjiang, China

SWEET (sugars will eventually be exported transporter) proteins are structurally conserved and energy independent sugar transporters, which play important roles in many physiological processes, such as plant growth development and response to biotic and abiotic stresses. At present, there is no research study about SWEET gene in peanut yet. In this study, we explored SWEET gene in the whole genome of peanut for the first time and analyzed its molecular characteristics and expression pattern in detail. These results showed that there were 55, 25, and 28 SWEET genes in the genomes of cultivated peanut and two ancestral wild peanuts, respectively, which were randomly and unevenly distributed on each chromosome. Orthologous genes from wild peanut and cultivated peanut usually shared the similar chromosome location, which confirmed that cultivated peanut originated from two ancestral wild peanuts. There were also some orthologous gene lost, which might be attributed to gene deletion or expansion during genome replication and doubling process. Gene structure and-elements in the promoter region were different in the SWEET genes, suggesting the diversity of biological functions. Phylogenetic analysis dividedSWEET proteins into four subfamilies Clade I–Clade IV. Genes in the same clade of the same subfamily exhibited the similar gene structure. Based on Clevenger et al. tissue expression analysis, we found that some genes were tissue preferentially expressed, which provided a reference for further understanding the functional location of SWEET genes. Moreover, we identified several drought or salt stress responsive genes, such asandby re-analysis transcriptome expression data under abiotic stress and RT-qPCR. Their functions were still needed to be further identified. These results provide a theoretical reference for further analysis of SWEET gene function in peanut.

SWEET gene family; molecular characteristics; the relative expression pattern; abiotic stress; peanut

10.3724/SP.J.1006.2023.24066

本研究由山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2021MC128), 山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2020LZGC001, 2021LZGC025)和山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(SDAIT-04-02)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2021MC128), the Shandong Elite Variety Project (2020LZGC001, 2021LZGC025), and the Agro-industry Technology Research System of Shandong Province (SDAIT-04-02).

單世華, E-mail: shansh1971@163.com

E-mail: squanxi@163.com

2022-03-25;

2022-07-21;

2022-08-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220818.1029.002.html

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