張培風(fēng) 任帥 孫佩 王蕊 張瑞平 王文潔 馬朝陽 李合順 王學(xué)軍 周聯(lián)東

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

雜種優(yōu)勢(shì)是選育玉米新品種的重要理論基礎(chǔ)[1]。了解掌握玉米地方種質(zhì)群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和類群間遺傳關(guān)系，劃分雜優(yōu)類群，能夠使育種者思路更加清晰，降低雜交組合組配的盲目性，育種目標(biāo)更易實(shí)現(xiàn)[2]。分子標(biāo)記是主要以個(gè)體之間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，SNP作為繼RFLP 和SSR 之后最有前途的第三代分子標(biāo)記，具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性好、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等優(yōu)勢(shì)，因此目前被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、全基因組關(guān)聯(lián)分析和分子標(biāo)記輔助育種研究中，研究者也開始利用SNP 等分子標(biāo)記開展玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性和類群劃分的研究。吳金鳳等[3]利用1041 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)51 份玉米地方種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，最終將其劃分為7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群。高嵩等[1]利用6973 個(gè)高質(zhì)量SNP 標(biāo)記對(duì)205 份材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和類群間遺傳關(guān)系分析，最終劃分為7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群，與系譜來源具有較好的一致性。史亞興等[4]利用SNPs 對(duì)39 份不同基因型的糯玉米地方種質(zhì)進(jìn)行基因型分析，劃分為五大類群，明確了親緣關(guān)系，為糯玉米種質(zhì)資源利用及品種選育提供參考依據(jù)。曾艷華等[5]利用56K SNP 芯片對(duì)廣西45 個(gè)爆裂玉米農(nóng)家品種進(jìn)行基因組掃描，分為三大類群，其中，來源相同的農(nóng)家品種大多聚在一起，表明廣西農(nóng)家品種遺傳相似性較高。肖穎妮等[6]利用5067 個(gè)高質(zhì)量的SNP 對(duì)全國范圍內(nèi)385 個(gè)鮮食玉米進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)劃分和遺傳距離的估算，最終劃分為三大類群，結(jié)果與聚類分析結(jié)果大部分一致，較全面地解析了我國當(dāng)前鮮食玉米的遺傳多樣性，可為鮮食玉米育種提供理論指導(dǎo)。Van Inghelandt等[7]研究表明，利用SNP 標(biāo)記的方法計(jì)算的自交系遺傳距離和基因多樣性更加精確。

玉米地方種質(zhì)對(duì)地方環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳基礎(chǔ)豐富，已成為不可或缺的育種材料，而且受基因型和環(huán)境互作影響，育種家選擇理想的基因型和雜交組合較難實(shí)現(xiàn)[8]。同時(shí)，隨著大量優(yōu)質(zhì)玉米品種被不斷開發(fā)及應(yīng)用，有必要對(duì)現(xiàn)有的地方材料進(jìn)行系統(tǒng)分析，為未來育種提供理論依據(jù)[9]。本研究選用100 份河南省玉米地方種質(zhì)，基于SNP 芯片技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析和雜優(yōu)類群劃分，為玉米地方種質(zhì)資源雜優(yōu)模式開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試材料中100 份材料為河南省內(nèi)廣泛搜集、整理的玉米地方種質(zhì)，編號(hào)及名稱詳見表1。20 份參照品系分別為：SHEN5003、YE52106、81162、HUOBAI、HUANGZAOSI、YE478、Z58、C7-2、Woyu4B、B73、DK517A、XY335B、LH185、517B、PHTD5、SHEN137、Q319、P138、DMY2B、228B。

表1 100 份河南省玉米地方種質(zhì)編號(hào)及名稱

1.2 DNA 提取苗期對(duì)每個(gè)品種5 株植株的幼嫩葉片進(jìn)行混合取樣，采用磁珠法提取306 個(gè)樣本，打孔至96 孔板，分別裝置5mm 鋼珠，蓋上硅膠蓋，常溫保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉腄NA 分別通過瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的純度、濃度等質(zhì)量狀況。瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA 條帶單一、明亮、完整無降解、無拖尾現(xiàn)象，將DNA 樣品風(fēng)干，加100μL 1×TE 緩沖液，37℃保溫箱溫育2h，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP 芯片分型及統(tǒng)計(jì)分析基于金苑（北京）農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司Affymetrix 測(cè)試平臺(tái)，采用高密度玉米微陣列芯片技術(shù)對(duì)SNP 標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)100 個(gè)玉米地方種質(zhì)進(jìn)行全基因組掃描，對(duì)樣本的原始SNP 分型，再對(duì)SNP 標(biāo)記進(jìn)行過濾，首先要?jiǎng)h除在群體中沒有多態(tài)性的標(biāo)記，其次刪除最小等位基因頻率較小的、缺失率較大的標(biāo)記，獲得質(zhì)量較高的SNP 標(biāo)記，用來進(jìn)行下一步的分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析利用Tassel 軟件對(duì)2 個(gè)品種之間的遺傳距離進(jìn)行分析，對(duì)類群進(jìn)行主成分分析，明確各類群材料的分群特征，根據(jù)品種之間的遺傳距離，利用MEGA7.0 軟件以鄰結(jié)法（NJ，Neighbor-joining）計(jì)算品種間的Nei's 遺傳距離，構(gòu)建聚類圖。采用組間平均聯(lián)接法對(duì)玉米地方種質(zhì)資源的綜合性狀進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP 位點(diǎn)總體評(píng)價(jià)利用1021 個(gè)SNP 標(biāo)記對(duì)120 份種質(zhì)資源的基因型進(jìn)行檢測(cè)，通過PowerMarker V3.25 分析其基因分型數(shù)據(jù)，雜合率在0～29.3%之間，平均值為2.5%；缺失率在0～19.4%之間，平均值為1.7%；多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0～0.395，平均值為0.295。PIC 值是衡量DNA 座位變異程度高低的重要指標(biāo)，當(dāng)PIC 值＞0.50 時(shí)，表明其為高度多態(tài)性；當(dāng)0.25＜PIC 值＜0.50 時(shí)，表明其為中度多態(tài)性；當(dāng)PIC 值＜0.25 時(shí)，表明其為低度多態(tài)性。本研究中，1021 個(gè)SNP 位點(diǎn)在120 份玉米地方種質(zhì)中的平均PIC 值為0.295，說明玉米地方種質(zhì)為中度多態(tài)性，遺傳多樣性較好。

2.2 聚類分析通過PowerMarkerV3.25 軟件應(yīng)用Nei's 算法計(jì)算120 份玉米種質(zhì)兩兩之間的遺傳距離，自交系遺傳距離變化范圍為在0.010～0.703，平均值為0.234，其中，遺傳距離最小的2 個(gè)自交系是短腿玉米和黃馬牙，遺傳距離最大的2 個(gè)自交系是鵝林白和PHTD5。

對(duì)120 份玉米地方種質(zhì)進(jìn)行遺傳距離聚類，構(gòu)建NJ 聚類圖，進(jìn)行聚類分析（圖1）。類群劃分結(jié)果表明，以20 個(gè)我國常用玉米骨干自交系作為雜種優(yōu)勢(shì)群劃分的參照，所有材料可被分為7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)類群。第1 類群為國內(nèi)瑞德群，包括SHEN5003、YE478、Z58、81162；第2 類群為黃源群，包括DF-81～YE52106 共105 份，其中大部分自交系為地方種質(zhì)資源；第3 類群為BSSS 群，包括DK517A、B73；第4 類群為NSSS 群，包括XY335B、LH185；第5類群為Iodent 群，包括PHTD5、517B；第6 類群為78599 群，包括P138、SHEN137、Q319；第7 類群為歐硬群，包括DMY2B、228B。地方種質(zhì)資源聚類結(jié)果與其地理來源無確定性關(guān)系，不同來源地的品種互相穿插聚在一起，單親緣關(guān)系較近的資源基本上聚到同一亞群中，如遺傳背景相似Woyu4B 和C7-2，B73 和DK517A，XY335B、LH185、517B 和PHTD5，SHEN137、Q319 和P138 分別聚在一起。

圖1 基于SNP 標(biāo)記的供試自交系的聚類圖

2.3 群體間遺傳距離根據(jù)類群劃分結(jié)果，計(jì)算出7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群的群體間遺傳距離（表2）。7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群之間的遺傳距離變化范圍在0.453～0.653 之間，其中，Iodent 群和NSSS 群之間的遺傳距離最近，歐硬群和78599 群之間的遺傳距離最遠(yuǎn)。

表2 雜種優(yōu)勢(shì)群群體的遺傳距離

在遺傳距離為0.25 時(shí)，根據(jù)同一類群的玉米品種間距離接近且綜合性狀值差異較小的原則，將100 份玉米地方種質(zhì)劃分為三大類群[10]（圖2）。第Ⅰ類群包括51 份種質(zhì)，對(duì)應(yīng)的編號(hào)分別為DF-118、DF-227、DF-60、DF-164、DF-4、DF-59、DF-11、DF-129、DF-428、DF-176、DF-45、DF-419、DF-88、DF-171、DF-84、DF-170、DF-98、DF-142、DF-44、DF-179、DF-130、DF-302、DF-108、DF-267、DF-280、DF-422、DF-5、DF-6、DF-150、DF-125、DF-354、DF-3、DF-431、DF-126、DF-66、DF-131、DF-392、DF-224、DF-362、DF-226、DF-236、DF-375、DF-387、DF-215、DF-216、DF-232、DF-52、DF-29、DF-30、DF-406、DF-368，這類種質(zhì)主要特征為早熟，株高、穗位高較高，穗粗較粗，千粒重較重；第Ⅱ類群包括46 份種質(zhì)，分別為DF-23、DF-107、DF-26、DF-426、DF-366、DF-51、DF-282、DF-83、DF-101、DF-36、DF-228、DF-292、DF-425、DF-251、DF-254、DF-195、DF-69、DF-220、DF-221、DF-2、DF-200、DF-225、DF-62、DF-70、DF-190、DF-286、DF-34、DF-141、DF-186、DF-93、DF-273、DF-395、DF-122、DF-152、DF-33、DF-158、DF-65、DF-104、DF-382、DF-380、DF-8、DF-376、DF-258、DF-261、DF-81、DF-35，這類種質(zhì)主要特征為晚熟，株高、穗位高較低，穗粗較細(xì)，千粒重較輕；第Ⅲ類群包括3 份種質(zhì)，分別為DF-77、DF-137、DF-46。

圖2 基于遺傳距離構(gòu)建的聚類圖

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記的發(fā)展使得在分子水平上研究玉米遺傳多樣性得以實(shí)現(xiàn)。目前國內(nèi)外諸多學(xué)者利用SSR標(biāo)記研究不同來源的甜玉米種質(zhì)的遺傳多樣性，并劃分了類群。近年來，SNP 標(biāo)記逐漸取代了傳統(tǒng)標(biāo)記，并且在普通玉米種質(zhì)遺傳組成分析上被廣泛應(yīng)用[11]。玉米雜種優(yōu)勢(shì)群及其模式也已成為指導(dǎo)玉米育種實(shí)踐的重要依據(jù)，利用SNP 標(biāo)記分析玉米地方種質(zhì)之間的遺傳距離及遺傳構(gòu)成，是聚類分析和雜種優(yōu)勢(shì)劃分類群的基礎(chǔ)[12]。SNP 標(biāo)記也因具有遺傳穩(wěn)定性好、位點(diǎn)豐富且分布廣泛、代表性強(qiáng)、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在高密度遺傳圖譜構(gòu)建、基因精確定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)發(fā)育等方面廣泛應(yīng)用[13-17]。Lu等[18]利用SNP 標(biāo)記對(duì)770 份國內(nèi)外玉米地方種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，1034 個(gè)SNP 位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量在0.003～0.375 之間，平均值為0.259。師亞琴等[19]利用4550 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)80 份玉米地方種質(zhì)進(jìn)行遺傳分析，將79 份玉米地方種質(zhì)劃分為兩大類、7 個(gè)亞群，結(jié)果與系譜來源有較好的一致性。本研究利用1021 個(gè)SNP 標(biāo)記對(duì)120 份地方種質(zhì)資源的基因型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，1021 個(gè)SNP 標(biāo)記在供試材料中的多態(tài)性信息含量的平均值為0.295，雜合率平均值為2.5%，缺失率平均值為1.7%。將供試的20 份參照物和100 份地方種質(zhì)劃分為7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群，劃群結(jié)果和系譜來源具有較好的一致性，利用SNP 標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分可獲得比較理想的結(jié)果，特別是對(duì)于系譜不清晰的新系，可很好地通過類群劃分對(duì)雜交種進(jìn)行組配，這樣能夠盡可能地避免大量且盲目的測(cè)配工作，從而提高育種組配效率。

本研究中類群劃分結(jié)果表明，以20 個(gè)我國常用玉米骨干自交系作為雜種優(yōu)勢(shì)群劃分的參照，120份材料可被分為7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)類群，劃分結(jié)果與系譜來源有較好一致性，如100 份地方種質(zhì)全部被聚為黃源類群，表明來自河南地方種質(zhì)資源遺傳背景相同，親緣關(guān)系較近，純合度較高。其中，大柿黃和黃皮糙的矩陣輸出圖遺傳距離為0.023；黃皮糙和高桿青的矩陣輸出圖遺傳距離為0.051；白琉璃頭和小白糙的矩陣輸出圖遺傳距離為0.147，遺傳距離較近，可以看出地方種質(zhì)資源間遺傳相似度較高，有相似血緣關(guān)系。說明利用SNP 標(biāo)記對(duì)玉米地方種質(zhì)資源進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分能夠獲得比較理想的結(jié)果。由群體間遺傳距離結(jié)果顯示，Iodent 群和NSSS群之間的遺傳距離最近，這與其系譜關(guān)系也是相吻合的；歐硬群和78599 群之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，這也與78599 該雜交種血緣與國內(nèi)的七大類群關(guān)系較遠(yuǎn)相吻合。其中遺傳距離最小的2 個(gè)地方種質(zhì)資源是短腿玉米和黃馬牙，純合度較高，遺傳關(guān)系最近，遺傳距離為0.010。本研究結(jié)果可作為雜優(yōu)模式的選擇依據(jù)。