陳 慧 肖 清 汪華棟 文 靜 馬朝芝 涂金星 沈金雄 傅廷棟 易 斌

甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員鑒定及基因的功能研究

陳 慧 肖 清 汪華棟 文 靜 馬朝芝 涂金星 沈金雄 傅廷棟 易 斌*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) / 作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國家油菜工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢 430070

蛋白翻譯后修飾對(duì)蛋白的功能非常重要。SUMO化修飾就是一種非常重要的蛋白翻譯后修飾, 它對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵過程有很大的影響。甘藍(lán)型油菜作為重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物在SUMO化修飾方面卻鮮有報(bào)道。為彌補(bǔ)這一空白, 本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜中的SUMO化修飾進(jìn)行了探究。首先通過生物信息學(xué)方法在甘藍(lán)型油菜中鑒定到31個(gè)SUMO蛋白成員, 分為3類: “典型”群組、“非典型”群組和SUMO-V。然后對(duì)甘藍(lán)型油菜中基因的同源基因進(jìn)行表達(dá)模式分析, 發(fā)現(xiàn)該基因在根、葉和角果中表達(dá)比較高。亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn), Bna.SUMO1.C08蛋白定位于細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。最后在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)其能夠增強(qiáng)植株對(duì)PEG脅迫的抵抗能力。本研究為后續(xù)甘藍(lán)型油菜中SUMO化修飾的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

甘藍(lán)型油菜; SUMO化修飾;

類泛素小蛋白修飾物(small ubiquitin-like modifier, SUMO)對(duì)真核細(xì)胞行使正常功能至關(guān)重要。SUMO蛋白是一個(gè)長(zhǎng)度為100～115個(gè)氨基酸的小分子多肽, 包含一個(gè)β-grasp fold結(jié)構(gòu)域, 在氨基酸序列上與泛素相似性非常低, 僅為18%, 但在三維結(jié)構(gòu)上卻與泛素比較相似, 不同的地方主要在于SUMO蛋白在羧基末端存在幾十個(gè)氨基酸的延伸[1]。SUMO蛋白可以分為“典型”組和“非典型”組。在典型類群中的SUMO蛋白比較保守, 然而在非典型類群中的SUMO蛋白不僅與典型類群中的SUMO蛋白在氨基酸序列上相似性低而且它們自己之間氨基酸序列相似性也比較低[2]。除上述的SUMO蛋白外, 還存在2種較長(zhǎng)的SUMO相關(guān)蛋白, 一種是SUMO-V蛋白, 另一種是DUSL蛋白。SUMO-V蛋白與常規(guī)SUMO蛋白相比在其β-grasp fold結(jié)構(gòu)域的N段延伸了126～212個(gè)氨基酸殘基, DUSL蛋白則包含2個(gè)β-grasp fold結(jié)構(gòu)域[2]。SUMO蛋白對(duì)底物進(jìn)行SUMO化修飾, 可以改變底物蛋白酶的活性, 促進(jìn)底物蛋白形成復(fù)合物以及改變底物蛋白的亞細(xì)胞定位等[3]。大量研究表明SUMO化修飾在控制植物生長(zhǎng)、發(fā)育、開花、環(huán)境脅迫和抵抗病原體侵染等重要生物學(xué)過程中起著非常重要的作用。例如: 擬南芥中雙突變體和以及單突變體、和都表現(xiàn)出胚胎致死的表型[4]。基因可以通過調(diào)控SA和IAA介導(dǎo)的過程來影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育[5-6]。Son等[7]在擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)的開花抑制受到SUMO化修飾的調(diào)控, 當(dāng)把FLC的SUMO修飾位點(diǎn)(K154)突變后, 表現(xiàn)出與野生型相似的開花時(shí)間。Li對(duì)[8]蘋果的研究發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾會(huì)影響植株對(duì)干旱的耐受。在高溫條件下, SUMO化修飾能夠穩(wěn)定DREB2A蛋白增強(qiáng)擬南芥植株的耐熱性[9]。SUMO化修飾對(duì)鋁脅迫也有一定的調(diào)控[10]。SUMO化修飾也能通過確保MAPK對(duì)底物蛋白的可選擇性來調(diào)控植物的免疫能力[11]。盡管SUMO化修飾在植物中有著多方面的研究, 但在甘藍(lán)型油菜中對(duì)SUMO化修飾卻鮮有報(bào)道。本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白的鑒定以及對(duì)的功能研究, 將為后續(xù)甘藍(lán)型油菜中SUMO化修飾的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員鑒定

從甘藍(lán)型油菜基因組網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu. cn/bnapus/)下載甘藍(lán)型油菜“ZS11”的基因組序列文件和注釋文件。利用Tbtools[12]將擬南芥中鑒定到的SUMO成員的蛋白序列比對(duì)到ZS11基因組上篩選出一些候選基因。然后提取這些基因的蛋白序列提交到NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中, 利用Blastp做進(jìn)一步篩選, 在結(jié)果中剔除注釋不是SUMO蛋白家族的成員。最后將剩余成員的蛋白序列提交到NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd)中[13], 檢查SUMO蛋白保守結(jié)構(gòu)域的完整性, 刪除沒有完整結(jié)構(gòu)域的成員, 剩余成員即為甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員。

1.2 序列分析

利用在線網(wǎng)站ExPASy (https://www.expasy. org/)[14]和WoLFPSORT (http://www.genscript.com/ tools/wolf-psort)[15]分別對(duì)甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白成員的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算以及對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用軟件MEGA7.0對(duì)甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白成員的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì), 并使用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹; Bootstrap設(shè)為1000, 其他均為默認(rèn)參數(shù)[16]。利用在線網(wǎng)站Evolview (https://www. evolgenius.info/evolview/)對(duì)進(jìn)化樹美化[17]。利用在線工具M(jìn)EME (https://meme-suite.org/meme/tools/ meme)鑒定甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員的保守基序[18]。將甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員的保守基序和基因組注釋文件提交到Tbtools中進(jìn)行可視化。

1.3 共線性分析

利用TBtools內(nèi)置的MsScanX軟件對(duì)擬南芥、甘藍(lán)、白菜以及甘藍(lán)型油菜進(jìn)行物種內(nèi)及物種間共線性分析, 并可視化。

1.4 基因表達(dá)模式分析和亞細(xì)胞定位

根據(jù)基因的CDS序列, 在SnapGene上設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。應(yīng)用PerfectStart Green qPCR SuperMix試劑(Cat. No. AQ601, 購置于全式金生物技術(shù)有限公司), Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad, 美國), 以植物各組織(根、莖、葉、花和角果)的cDNA樣品為模板進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量分析。

將基因的開放閱讀框構(gòu)建至PMDC83-GFP的載體上, 然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化, 分別與接有紅色熒光標(biāo)簽的細(xì)胞核Marker和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker共轉(zhuǎn)入本氏煙草中, 將煙草培養(yǎng)2 d, 用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

基因定量引物:F: 5￠-GTCAGGATGGGAATGAGGTG-3￠;R: 5￠-GAACAAGAAGGCAATGGAGC-3￠。

1.5 植物材料的培養(yǎng)與各種處理

RR材料為甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系材料, 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜工程中心提供。隨后將擬南芥基因在甘藍(lán)型油菜中的同源基因的編碼區(qū)連接于超表達(dá)載體PMDC83上, 通過遺傳轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜RR, 后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè), 表達(dá)量中等的植株用于后續(xù)試驗(yàn)。

挑選飽滿RR材料的種子和以RR為受體材料的轉(zhuǎn)基因種子, 將這些種子浸水發(fā)芽, 等種子都露白后開始處理, 將RR的種子和轉(zhuǎn)基因的種子都分別播種于試驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)盒中進(jìn)行水培, 對(duì)照組中加入水培營(yíng)養(yǎng)液, 試驗(yàn)組中加入用水培營(yíng)養(yǎng)液配置的20% PEG溶液, 1周后測(cè)定表型。各組別都設(shè)置3次重復(fù), 生長(zhǎng)條件為: 溫度22℃, 16 h光照/8 h黑暗。

1.6 活性氧檢測(cè)與SOD和POD酶活性檢測(cè)

分別采用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidiine, DAB)和氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride, NBT)組織染色對(duì)過表達(dá)植株和野生型植株葉片中H2O2和O2?進(jìn)行檢測(cè)。

利用超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(Cat. No.AKAO001C)和過氧化物酶(POD)活性檢測(cè)試劑盒(Cat. No.AKAO005C)檢測(cè)過表達(dá)植株和野生型植株中SOD和POD酶活性(試劑盒購置于北京盒子生工科技有限公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員鑒定

以擬南芥中SUMO蛋白的蛋白序列為參考, 在甘藍(lán)型油菜中鑒定到了31個(gè)SUMO蛋白(具體成員信息詳見附表1)。把這31個(gè)成員與擬南芥、水稻和玉米中的SUMO蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹, 甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白分為3類(圖1-A)。Group 1是與擬南芥聚成一類的“典型”群組, 甘藍(lán)型油菜中有14個(gè)成員屬于這一個(gè)群組。Group 2是與Group 1相對(duì)的“非典型”群組, “非典型”群組里面包含了15個(gè)甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白成員。Group 3是SUMO-V, 在甘藍(lán)型油菜中只鑒定到2個(gè)成員。

進(jìn)一步對(duì)31個(gè)SUMO蛋白進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析和保守基序分析(圖1-B)。在甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白的氨基酸序列中共鑒定到5個(gè)保守基序(Motif 1～Motif 5), 其中Motif 1～Motif 3在大多數(shù)SUMO蛋白成員中是保守的, 表明這3個(gè)Motif可能構(gòu)成SUMO蛋白的核心結(jié)構(gòu)域。而Motif 4主要存在于“典型”群組中, Motif 5主要存在于“非典型”群組中, 表明典型群組成員和非典型群組成員在功能上有一定的分化。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)典型群組中SUMO蛋白成員基因結(jié)構(gòu)較為相似, 其內(nèi)含子和外顯子數(shù)目主要分別為2個(gè)和3個(gè), 非典型群組中SUMO蛋白成員的基因結(jié)構(gòu)存在較大的差異, 其內(nèi)含子和外顯子數(shù)目主要分別介于0～10個(gè)之間和1～11個(gè)之間, SUMO-V的基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜, 內(nèi)含子和外顯子個(gè)數(shù)都超過5個(gè)。

(圖1)

A: 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。紅色標(biāo)注的Group 1為“典型”群組; 藍(lán)色標(biāo)注的Group 2為“非典型”群組; 紫色標(biāo)注的Group 3為SUMO相關(guān)蛋白。B: Motif、Domain和基因結(jié)構(gòu)分析。第1列為Motif; 第2列為Domain; 第3列為基因結(jié)構(gòu)。C: 蛋白序列比對(duì)。紅色長(zhǎng)方體標(biāo)注為β-grasp domain范圍; 圓點(diǎn)標(biāo)注為各作用位點(diǎn)。

A: phylogenetic tree analysis. Group 1 in red is a “canonica” group. Group 2 in blue is a “non-canonica” group. Group 3 in purple is a sumo-related protein. B: the analyses of motif, domain, and gene structure. The first column is Motif; the second column is Domain; the third section is genetic structure. C: protein sequence alignment. The red cuboid is labeled as β-grasp domain range; dots are action sites.

將甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白成員與酵母ScSmt3蛋白、人類HsSUMO2蛋白和擬南芥AtSUMO1蛋白進(jìn)行蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), β-grasp domain在甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白成員中是比較保守的, 并且在此結(jié)構(gòu)域中包含許多E1激活酶作用位點(diǎn)、E2結(jié)合酶作用位點(diǎn)和SUMO化修飾位點(diǎn), 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有些SUMO蛋白不存在對(duì)底物行使功能的雙甘氨酸殘基, 說明這些SUMO蛋白可能不具有對(duì)底物進(jìn)行SUMO化修飾的功能(圖1-C)。

2.2 甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白基因的染色體分布及共線性分析

為了比較直觀的觀察SUMO蛋白基因在染色體上的分布情況, 本研究將基因在染色體的位置進(jìn)行可視化(圖2-A)。SUMO蛋白基因分布于甘藍(lán)型油菜19條染色體上, 且分布較為均勻, 每條染色體上分布的SUMO蛋白基因個(gè)數(shù)介于1～4個(gè)之間, scaffoldC04染色體上存在個(gè)數(shù)最多。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)同一類別的SUMO蛋白基因存在不在某一染色體區(qū)間聚集的現(xiàn)象。多個(gè)基因定位在一條染色體上時(shí), 其定位的位置是不均勻的, 多數(shù)情況下這些基因都是定位于染色體的兩端。

進(jìn)一步對(duì)擬南芥、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜進(jìn)行了物種內(nèi)共線性分析和物種間共線性分析(圖2-B)。在擬南芥、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中分別鑒定到1、12、8和47對(duì)旁系同源基因?qū)? 在擬南芥和甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜以及白菜和甘藍(lán)型油菜之間分別鑒定到18、78和40對(duì)直系同源基因?qū)?。同時(shí)對(duì)甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)油菜SUMO蛋白基因保留率分析發(fā)現(xiàn), 在進(jìn)化過程中“典型”群組的SUMO蛋白都被100%保留下來, 然而“非典型”群組中的SUMO蛋白存在部分丟失。

2.3 Bna.SUMO1.C08表達(dá)模式分析及亞細(xì)胞定位

擬南芥中基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育起著非常重要的作用, 為了在甘藍(lán)型油菜中進(jìn)一步研究基因, 本研究將擬南芥的基因蛋白序列比對(duì)到甘藍(lán)型油菜ZS11基因組上鑒定到了同源性最高的基因。并對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。試驗(yàn)結(jié)果表明基因在根、葉和角果中都大量表達(dá), 其中在葉中該基因的表達(dá)量最高, 然而在莖和花中該基因的表達(dá)量比較低(圖3-A)。蛋白的亞細(xì)胞定位能夠顯示出蛋白的作用位置, 這對(duì)解析基因功能有一定的幫助。因此, 進(jìn)一步對(duì)基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),基因接的綠色熒光標(biāo)簽散發(fā)的綠色熒光能和細(xì)胞核Marker與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker連接的紅色熒光標(biāo)簽散發(fā)的紅色熒光重合, 這表明基因定位于細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(圖3-B)。

圖2 甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白基因染色體定位和共線性分析

A: SUMO蛋白基因染色體位置可視化。B: 擬南芥、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜物種物種內(nèi)和物種間共線性分析。

A: the chromosome location visualization of SUMO protein genes. B: the intra-species and interspecies collinearity analysis of,,, and.

圖3 Bna.SUMO1.C08表達(dá)模式分析和亞細(xì)胞定位

A: 表達(dá)模式分析。主要在根、葉和角果中表達(dá)。B: 亞細(xì)胞定位。定位于細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。標(biāo)尺: 1 μm。

A: the relative expression pattern.is mainly expressed in roots, leaves, and scones. B: the subcellular localization.locates in the nucleus and endoplasmic reticulum. Bar: 1 μm.

2.4 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的分子鑒定

為進(jìn)一步分析基因在甘藍(lán)型油菜中的基因功能, 本研究將基因的編碼區(qū)連接到過表達(dá)載體PMDC83上(圖4-A), 通過遺傳轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜RR。提取野生型植株和過表達(dá)植株RNA進(jìn)行qRT-PCR, 過表達(dá)植株中基因表達(dá)量明顯高于野生型(圖4-B)。本研究挑選表達(dá)量接近的3個(gè)株系#30、#35和#36進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.5 過表達(dá)Bna.SUMO1.C08植株在PEG處理下的表型

根據(jù)前人研究表明SUMO化修飾能夠調(diào)控植物的抗旱性。同時(shí)對(duì)基因ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子用plantCARE進(jìn)行順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)存在響應(yīng)干旱脅迫的元件, 所以本研究對(duì)過表達(dá)植株和野生型植株用PEG進(jìn)行模擬干旱處理。通過前期的預(yù)試驗(yàn), 本研究將PEG處理的濃度定為PEG︰水的質(zhì)量體積比為20%。根系的強(qiáng)弱對(duì)植物的抗旱性有著很大的影響, 本研究著重對(duì)根系長(zhǎng)度進(jìn)行考察, 對(duì)野生型植株和過表達(dá)植株在正常條件和20% PEG處理下觀察其根系長(zhǎng)度并進(jìn)行根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常條件這2種材料的根系長(zhǎng)度無明顯差異, 在20% PEG處理下這2種材料的根系長(zhǎng)度都比正常條件下生長(zhǎng)的短, 并且這兩種材料的根系長(zhǎng)度之間存在明顯的差異, 過表達(dá)基因的植株根系長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型植株(圖5-A, B)。

圖4 過表達(dá)Bna.SUMO1.C08的轉(zhuǎn)基因植株在mRNA水平上的鑒定

A: 過表達(dá)基因的載體結(jié)構(gòu)圖。B: 過表達(dá)植株的表達(dá)量檢測(cè)。

A: the vector structure diagram ofoverexpressed genes. B: the relative expression levels ofin overexpressed plants.

干旱脅迫很多時(shí)候會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧大爆發(fā), 清除多余的活性氧在一定程度上能夠提升植物的抗旱性。為探究野生型植株和過表達(dá)植株中活性氧的含量, 本研究利用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidiine,DAB)和氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride, NBT)對(duì)2種材料的葉片進(jìn)行染色, 分別對(duì)2種材料中的H2O2和O2?的含量進(jìn)行檢測(cè)。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn), 無論是在正常條件還是在20% PEG條件下過表達(dá)植株的2種染色程度都比野生型植株淺, 在20% PEG處理下的結(jié)果更加明顯。這表明過表達(dá)植株中H2O2和O2?的含量比野生型植株中低(圖5-C, D)。為探究過表達(dá)植株葉片內(nèi)H2O2和O2?的含量為什么比較低, 本研究對(duì)過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的酶活進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明在正常條件下POD和SOD酶的活性沒有明顯的差異, 但在20% PEG處理下POD和SOD酶的活性在過表達(dá)植株中相較于野生型植株有呈顯著的提升(圖5-E, F)。

圖5 PEG處理下過表達(dá)Bna.SUMO1.C08植株和野生型植株表型

A, B: 根長(zhǎng)表型及統(tǒng)計(jì)。C, D: DAB染色和NBT染色。E, F: POD酶和SOD酶活性檢測(cè)。*< 0.05; **< 0.01; ***< 0.001。

A, B: the phenotype and statistics of root length. C, D: DAB staining and NBT staining. E, F: the enzyme activity detection of POD and SOD. *:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001.

3 討論

有研究表明白菜和甘藍(lán)都屬于蕓薹屬物種, 它們與擬南芥共同的祖先在大約2000萬年前開始分化, 隨后在大約在1600萬年前, 它們的全基因組經(jīng)歷了一個(gè)三倍化的過程[19]。按照這個(gè)理論, 一個(gè)擬南芥基因在白菜和甘藍(lán)中應(yīng)該存在3個(gè)同源基因。而甘藍(lán)型油菜是白菜和甘藍(lán)雜交后進(jìn)行染色體加倍的產(chǎn)物[20], 同理, 一個(gè)擬南芥基因在甘藍(lán)型油菜中應(yīng)該存在6個(gè)同源基因。實(shí)際上利用擬南芥的SUMO蛋白通過蛋白同源比對(duì)在白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中分別鑒定到11個(gè)、12個(gè)和32個(gè)成員(圖2), 都比理論上的少, 說明在整個(gè)進(jìn)化過程中SUMO蛋白家族成員存在一定的丟失。本研究鑒定到的31 SUMO蛋白成員可分為3組: “典型”群組、“非典型”群組和SUMO相關(guān)蛋白(圖1), 這與擬南芥、玉米和大豆等植物中對(duì)SUMO蛋白的分類相同[2,21-22]。對(duì)“典型”群組成員和“非典型”群組成員的基因保留率分析發(fā)現(xiàn)“典型”群組成員在進(jìn)化過程中被100%保留并且還在進(jìn)一步擴(kuò)大, 然而有些“非典型”群組成員卻在進(jìn)化過程中被丟失(圖2)。推測(cè)在進(jìn)化過程中SUMO蛋白成員經(jīng)歷了強(qiáng)烈的選擇, 而“典型”群組成員能夠100%保留, 說明“典型”群組成員在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育起著非常重要的功能。

干旱脅迫對(duì)植物的損害很大一部分是由于干旱誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS打破了植物體內(nèi)原有ROS平衡, 過量的ROS會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[23]。有研究表明清除干旱脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的多余ROS, 將在一定程度上增強(qiáng)植物的耐旱性[24]。植物主要通過酶促防御系統(tǒng)來清除干旱誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS[25-26]。為探究過表達(dá)基因能夠增加甘藍(lán)型油菜抗旱性的原因, 本研究對(duì)植株內(nèi)的ROS和抗氧化酶系統(tǒng)中的2種酶(SOD和POD)的活性進(jìn)行了檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)基因的甘藍(lán)型油菜中2種酶的活性都顯著上升, 并且ROS的含量比較低(圖5)。這說明過表達(dá)基因的甘藍(lán)型油菜也可能通過清除植株體內(nèi)ROS的含量來提升抗旱性。

4 結(jié)論

甘藍(lán)型油菜中存在31個(gè)SUMO蛋白成員, 分為3組: “典型”群組、“非典型”組和SUMO相關(guān)蛋白, 其中典型組成員在進(jìn)化過程中100%被保留, 可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程具有重要大功能。之后對(duì)典型組成員的功能進(jìn)行研究, 表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)其主要在根、葉和角果中表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中, 該基因在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)發(fā)現(xiàn)能夠清除活性氧來增強(qiáng)植株的抗旱性。

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附表1 甘藍(lán)型油菜SUMO蛋白家族成員基本信息表

Table S1 Basic information of SUMO protein family members in

基因名Gene name序列號(hào)Sequence number基因長(zhǎng)度Gene length (bp)蛋白長(zhǎng)度Protein length (aa)分子量Molecular weight (Da)等電點(diǎn)Isoelectric point Bna.SUMO1.C08BnaC08T0170600ZS30410111,083.394.91 Bna.SUMO1.A08BnaA08T0169400ZS30410111,124.434.91 Bna.SUMO1.C01BnaC01T0209100ZS31610511,589.984.93 Bna.SUMO1.A03BnaA03T0494800ZS30410111,123.504.91 Bna.SUMO1.A01BnaA01T0162300ZS30310011,120.404.93 Bna.SUMO1.C07BnaC07T0472900ZS2959810,889.234.91 Bna.SUMO1.A05BnaA05T0335100ZS2598610,309.8610.61 Bna.SUMO1.C04BnaC04T0237000ZS256859964.399.18 Bna.SUMO1.C06BnaC06T0107300ZS211708117.079.25 Bna.SUMO1.C03BnaC03T0634700ZS211708158.229.73 Bna.SUMO2.C09BnaC09T0378000ZS31310411,668.174.93 Bna.SUMO2.A10BnaA10T0112600ZS31310411,716.224.93 Bna.SUMO2.A02BnaA02T0129200ZS2959811,017.384.93 Bna.SUMO2.C02BnaC02T0161400ZS48116018,387.545.26 Bna.SUMO3.C03BnaC03T0307000ZS32810912,774.638.69 Bna.SUMO4.C07BnaC07T0331100ZS121340446,871.139.15 Bna.SUMO4.A09BnaA09T0050000ZS244819306.375.26 Bna.SUMO5.A04BnaA04T0211000ZS30410111,358.089.55 Bna.SUMO5.C03BnaC03T0183400ZS36412113,485.519.57 Bna.SUMO5.C04bBnaC04T0521300ZS30410111,358.089.55 Bna.SUMO5.A05BnaA05T0114400ZS30710211,257.989.33 Bna.SUMO5.A03BnaA03T0157500ZS166556198.189.52 Bna.SUMO5.A06BnaA06T0124100ZS32510812,451.378.66 Bna.SUMO5.C04cBnaC04T0143500ZS2959810,885.659.61 Bna.SUMO5.C05BnaC05T0152200ZS31310411,998.788.69 Bna.SUMO5.C08BnaC08T0244100ZS2929711,140.705.04 Bna.SUMO5.C04aBnaC04T0143300ZS30710211,279.039.73 Bna.SUMO6.A06BnaA06T0362200ZS119239745,931.676.45 Bna.SUMO6.C09BnaC09T0036100ZS2719010,505.945.12 Bna.SUM-V.C06BnaC06T0314000ZS104234738,854.965.23 Bna.SUM-V.A07BnaA07T0276200ZS72424127,254.875.32

Identification of SUMO protein family members and functional study ofgene in

CHEN Hui, XIAO Qin, WANG Hua-Dong, WEN Jing, MA Chao-Zhi, TU Jin-Xing, SHEN Jin-Xiong, FU Ting-Dong, and YI Bin*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Engineering Research Center for Rapeseed / Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Post-translational modifications are very important for protein function. SUMOylation is a very important post-translational modification, which has great influence on the key processes of plant growth and development. As an important oil and economic crops, thereis few studies on SUMO modification in. To remedy this gap, SUMOylation inwas investigated in this study. Firstly, 31 SUMO proteins were identified inby bioinformatics methods, which were divided into three groups (“canonical” SUMO, “non-canonical” SUMO, and SUMO-V). Secondly, the relative expression pattern indicated that,, a homologous gene of, was highly expressed in roots, leaves, and silique. Subcellular localization revealed that Bna.SUMO1.C08 was localized in the nucleus and endoplasmic reticulum. Finally,was overexpressed inandcould enhance plant resistance to PEG stress. This study laid a foundation for the subsequent research on SUMO modification in.

; SUMOylation;

10.3724/SP.J.1006.2023.24064

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD01008)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD01008).

易斌, E-mail: yibin@mail.hzau.edu.cn

E-mail: 15661644378@163.com

2022-03-22;

2022-07-21;

2022-08-12.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220812.0910.002.html

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