潘琦 王浩 齊開杰 謝智華 崔艷波 包建平 張紹鈴 陶書田

摘要：利用DPI、H2O2、DPI+H2O2對(duì)梨幼果萼筒部位進(jìn)行處理，隨后對(duì)離區(qū)細(xì)胞進(jìn)行觀察，此外對(duì)樣品進(jìn)行液氮速凍，通過測(cè)定萼片離區(qū)木質(zhì)素和活性氧代謝相關(guān)指標(biāo)，研究萼片離區(qū)內(nèi)的木質(zhì)素生物合成過程與活性氧代謝間是否存在協(xié)同作用。結(jié)果表明，離層對(duì)DPI的抑制效果始終敏感，DPI可以通過降低過氧化氫含量來減少木質(zhì)素含量，外源過氧化氫在處理的早期沒有顯著作用，而在后期可以促進(jìn)離層內(nèi)源過氧化氫形成，從而減緩DPI的抑制效果。皮爾森相關(guān)系數(shù)表明，萼筒離層中活性氧代謝相關(guān)指標(biāo)與木質(zhì)素生物合成指標(biāo)呈正比例關(guān)系，特別是過氧化氫在離層中的累積可以促進(jìn)細(xì)胞壁增厚。

關(guān)鍵詞：萼片脫落；活性氧代謝；木質(zhì)素合成；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S661.201? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）23-0157-08

梨是我國(guó)生產(chǎn)上的第3大果樹，屬于薔薇科蘋果亞科梨屬植物，其栽培面積、產(chǎn)量、出口量均占世界第一［1］。在通常情況下，植物經(jīng)過花期，萼片會(huì)自然脫落，但也存在萼片宿存的情況［2］。果實(shí)的萼片脫落與宿存是衡量梨果實(shí)外觀品質(zhì)的重要特征之一，宿萼果實(shí)的殘留萼片不僅會(huì)影響外觀，造成果面粗糙，而且還與梨的石細(xì)胞含量呈明顯正相關(guān)關(guān)系，而脫萼果果面光滑整潔，石細(xì)胞含量少，口感較好［3-6］。梨果實(shí)的萼片脫落屬于器官脫落的一種表現(xiàn)形式，其遵循器官脫落的發(fā)生規(guī)律，都需要在脫落部位形成離區(qū)。張俊超研究發(fā)現(xiàn)，老芒麥種子離區(qū)細(xì)胞緊湊排列，且這些細(xì)胞木質(zhì)化程度高于周圍組織細(xì)胞［7］。Lee等研究報(bào)道，植物體實(shí)際分離后，在離層的遠(yuǎn)端形成木質(zhì)化保護(hù)層，這種木質(zhì)化過程受到活性氧代謝的調(diào)控［8］。其中，過氧化氫作為重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵樞紐［9］。在棉花纖維次生細(xì)胞壁分化過程中，過氧化氫起到關(guān)鍵促進(jìn)作用，而抑制過氧化氫的產(chǎn)生會(huì)延緩細(xì)胞壁的發(fā)育過程［10］。Huang等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞木質(zhì)化過程經(jīng)常伴隨著活性氧的暴發(fā)，水稻根結(jié)線蟲感染過程中，可以觀察到木質(zhì)素和過氧化氫二者同時(shí)大量累積［11］。在逆境條件下，活性氧同樣參與木質(zhì)素合成的累積過程。例如Donnini等研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵環(huán)境會(huì)導(dǎo)致梨根系活性氧含量增加，并引起根系的木質(zhì)化［12］；銅脅迫條件下，DPI顯著抑制水稻根系中過氧化物酶的活性及減少木質(zhì)素的含量，而外源H2O2處理顯著增加了根中木質(zhì)素含量，證明了過氧化氫在銅脅迫條件下木質(zhì)素合成中的關(guān)鍵作用［13］。同時(shí)，木質(zhì)素合成需要在過氧化物酶/漆酶的作用下，將不同的木質(zhì)素單體聚合而形成木質(zhì)素，這個(gè)過程中過氧化物酶主要以過氧化氫作為電子接受體來發(fā)生反應(yīng)［14］。Shigeto等研究報(bào)道，在擬南芥中AtPrx2、AtPrx71和AtPrx25的單一或雙重突起會(huì)減少木質(zhì)素的積累而不影響植物高度［15-16］。Fagerstedt等利用RNA干擾方法證明了不同的過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素含量的不同影響［17-18］。鑒于其他文獻(xiàn)報(bào)道中木質(zhì)化和活性氧之間的關(guān)系，本研究將在離區(qū)形成過程中，通過活性氧抑制劑處理及回補(bǔ)試驗(yàn)，來探明萼片脫落中活性氧代謝和木質(zhì)素生物合成的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料與樣本采集

試驗(yàn)材料為種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心南京湖熟種質(zhì)資源圃的庫(kù)爾勒香梨，在盛花期后0、5、15、20 d，用預(yù)先準(zhǔn)備好的蒸餾水、150 μmol/L DPI、3 mmol/L H2O2和150 μmol/L DPI+3 mmol/L H2O2溶液處理庫(kù)爾勒香梨幼果萼筒。處理方法為用無菌微量注射器吸取不同的抑制劑，從果柄處沿著維管束向萼筒部位進(jìn)行注射。處理后每7 d進(jìn)行取樣，并置于液氮中速凍；取樣時(shí)應(yīng)選取每株中10～15個(gè)發(fā)育良好且無病害的梨幼果萼筒部位，滿足3次生物學(xué)重復(fù)。樣品裝于凍存管中并放置于-80 ℃冰箱貯藏，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 木質(zhì)素相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

木質(zhì)素含量：參照Tao等的方法［19］采用乙酰溴法進(jìn)行測(cè)定。

石細(xì)胞含量：參照Tao等的方法［19］采用冷凍-鹽酸法進(jìn)行測(cè)定。

間本三酚染色：將1%間本三酚（溶于80%乙醇）和30% HCl（v/v）混合，將樣品浸泡在混合液中染色5 min，滴加NaOH中和反應(yīng)，用清水洗去表面液體，利用Canon相機(jī)拍照。

木質(zhì)素染色：參照劉若南的方法［20］采用番紅固綠法進(jìn)行染色。

細(xì)胞壁觀察：參照張虎平的方法［21］采用透射電鏡法進(jìn)行觀察。

1.2.2 活性氧相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

POD活性：采用過氧化物酶活性測(cè)定試劑盒（北京索爾比奧科技有限公司）測(cè)定。

過氧化氫含量：采用過氧化氫檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司）測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)收集采用Excel 2010，統(tǒng)計(jì)分析與繪圖采用GraphPad Prism 8.0，切片圖片使用ImageJ統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 25.0軟件分析差異、相關(guān)性和方差的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫萼果、宿萼果品質(zhì)差異比較

為了揭示脫萼性狀產(chǎn)生的原因，對(duì)幼果早期中脫萼果和宿萼果進(jìn)行組織部位觀察。在脫萼過程中，脫萼果萼筒部位的維管束縱切直徑顯著窄于宿萼果，且脫萼果離層細(xì)胞相比于宿萼果要更早木質(zhì)化（圖1）。這是由于萼筒中直徑更小的維管束更不利于運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致離層細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不充足，更容易產(chǎn)生木質(zhì)化。然而，果實(shí)內(nèi)部維管束的切片結(jié)果表明，脫萼果宿萼果幼果時(shí)期的維管束直徑大小間并沒有明顯差異（圖1）。因此，離層的木質(zhì)化是影響脫萼的關(guān)鍵因素，且這種木質(zhì)化與幼果萼筒基部至離層的維管束的發(fā)育密切關(guān)聯(lián)。研究表明，過氧化氫可以參與棉花纖維次生細(xì)胞壁分化過程，同時(shí)抑制過氧化氫的產(chǎn)生會(huì)延緩細(xì)胞壁的發(fā)育過程［10］。因此筆者初步推測(cè)活性氧代謝可能與離層木質(zhì)化關(guān)系密切，隨即通過田間活性氧抑制劑回補(bǔ)試驗(yàn)來探明其中關(guān)系。

2.2 活性氧相關(guān)處理早期離區(qū)的指標(biāo)變化

2.2.1 處理早期離區(qū)的木質(zhì)化

對(duì)4個(gè)處理的梨果實(shí)萼筒進(jìn)行縱切，并進(jìn)行番紅固綠染色。研究結(jié)果表明，在脫萼發(fā)生前期，離層細(xì)胞開始木質(zhì)化，DPI、DPI+H2O2處理可以明顯縮小離層細(xì)胞的木質(zhì)化范圍（圖2-B、圖2-D）。然而，對(duì)離層細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡觀察，僅在DPI處理發(fā)現(xiàn)離層細(xì)胞的細(xì)胞壁出現(xiàn)增厚緩慢的現(xiàn)象（圖3-B）。從木質(zhì)素含量的測(cè)定結(jié)果來看，DPI處理下木質(zhì)素含量極顯著降低，而H2O2和DPI+H2O2處理對(duì)木質(zhì)素含量沒有產(chǎn)生顯著影響（圖4-A）。DPI處理對(duì)木質(zhì)素的抑制效果，不僅是細(xì)胞水平上抑制細(xì)胞壁增厚，同時(shí)也減少萼筒離區(qū)的木質(zhì)化細(xì)胞數(shù)量（圖5）。以上結(jié)果表明，DPI抑制早期離區(qū)木質(zhì)素生物合成，而過氧化氫處理在這一時(shí)期對(duì)木質(zhì)素合成的影響不顯著。

2.2.2 處理早期離區(qū)的活性氧變化

內(nèi)源過氧化氫含量測(cè)定結(jié)果表明，外源H2O2、DPI和DPI+H2O2處理在7 d后均沒有改變內(nèi)源過氧化氫水平（圖4-B）。POD活性在DPI處理下極顯著降低，這直接導(dǎo)致了單體木質(zhì)素聚合的過程受到顯著影響，才使得其在這個(gè)時(shí)間段木質(zhì)素含量極顯著降低；而外源H2O2處理導(dǎo)致POD活性極顯著升高，DPI+H2O2處理導(dǎo)致POD活性極顯著降低，但這些變化并未改變木質(zhì)素含量。這說明單體木質(zhì)素聚合過程不僅僅受到POD活性的影響，還存在其他因素影響此聚合過程（圖4-C）。以上結(jié)果都說明，在萼片脫落的早期，DPI處理可以影響萼筒的活性氧代謝水平，尤其是POD活性，并影響木質(zhì)素生物合成。

2.3 活性氧相關(guān)處理中期離區(qū)的指標(biāo)變化

2.3.1 處理中期離區(qū)的木質(zhì)化

縱切的梨果實(shí)萼

筒番紅固綠染色結(jié)果表明，在抑制劑處理后的中期，離層細(xì)胞木質(zhì)化進(jìn)一步加劇，DPI和DPI+H2O2處理可以明顯縮小離層細(xì)胞的木質(zhì)化范圍（圖6-B、圖6-D）。離層細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果表明，單獨(dú)DPI處理仍然抑制離層細(xì)胞的細(xì)胞壁增厚，H2O2和DPI+H2O2處理可以明顯增厚離層細(xì)胞壁（圖7）。細(xì)胞木質(zhì)化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，DPI處理可以減少木質(zhì)化細(xì)胞數(shù)量和降低離層細(xì)胞細(xì)胞壁的厚度，而H2O2和DPI+H2O2處理的細(xì)胞壁厚度整體水平上與對(duì)照沒有顯著變化，說明外源過氧化氫的促進(jìn)效果不夠明顯，具有一定局限性（圖8）。外源過氧化氫處理下木質(zhì)素含量極顯著上升，而DPI+H2O2處理沒有顯著差異；DPI處理下木質(zhì)素含量極顯著降低，同時(shí)過氧化氫含量在DPI處理下也受到極顯著抑制（圖9-A）。這是由于木質(zhì)素單體的聚合需要以過氧化氫作為電子接受體，然后經(jīng)由POD的催化作用，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的單體木質(zhì)素。

2.3.2 處理中期離區(qū)的活性氧變化

如圖9所示，外源施加H2O2能夠間接提高內(nèi)源過氧化氫水平，而DPI+H2O2處理下，則由于DPI的作用更加明顯，導(dǎo)致內(nèi)源過氧化氫水平受到抑制， H2O2的外源促進(jìn)并未對(duì)DPI的抑制作用產(chǎn)生顯著影響（圖9-B）。對(duì)POD活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)DPI處理下POD活性極顯著下降，而H2O2和DPI+H2O2處理未產(chǎn)生顯著影響（圖9-C）。經(jīng)DPI、H2O2和DPI+H2O2處理后14 d，外源過氧化氫在脫萼發(fā)生的中期開始起作用可以抵消DPI的抑制作用，但還并未有顯著效果。

2.4 活性氧相關(guān)處理后期離層的指標(biāo)變化

2.4.1 處理后期離區(qū)的木質(zhì)化

相對(duì)于之前2個(gè)時(shí)期，在活性氧相關(guān)處理后期，H2O2和DPI+H2O2處理可以明顯擴(kuò)增離層細(xì)胞木質(zhì)化范圍，DPI仍明顯縮小離層細(xì)胞的木質(zhì)化范圍（圖10-A）。離層細(xì)胞透射電鏡觀察的結(jié)果表明，3個(gè)處理的離層細(xì)胞壁增厚沒有明顯差異（圖11）。細(xì)胞木質(zhì)化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，DPI處理可以減少木質(zhì)化細(xì)胞數(shù)量但抑制效果不如前2個(gè)時(shí)期，而3種處理離層細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度與對(duì)照沒有顯著差異（圖12）。這是因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期離層細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育完全，各處理對(duì)萼筒細(xì)胞水平發(fā)育的影響已經(jīng)不顯著。與染色分布結(jié)果一致，DPI處理下木質(zhì)素含量極顯著降低，而H2O2和DPI+H2O2處理下木質(zhì)素含量極顯著上升（圖13-A）。

2.4.2 處理后期離區(qū)的活性氧變化

隨后對(duì)內(nèi)源過氧化氫水平進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了與前面2個(gè)時(shí)期不一樣的結(jié)果，DPI+H2O2處理下，內(nèi)源過氧化氫水平極顯著提高；DPI處理降低內(nèi)源過氧化氫含量，而外源H2O2處理提高內(nèi)源過氧化氫含量，這與7 d和14 d結(jié)果一致（圖13-B）。POD的活性依然對(duì)于DPI的抑制效果較為敏感，當(dāng)外源DPI處理21 d后，POD活性極顯著下調(diào)，而另外2種處理沒有顯著差異（圖13-C）。以上結(jié)果表明，外源過氧化氫在處理后期可以顯著促進(jìn)內(nèi)源過氧化氫的形成，導(dǎo)致木質(zhì)素增加；而DPI處理對(duì)內(nèi)源過氧化氫和POD活性的具有抑制作用，降低木質(zhì)素含量，二者均證明了內(nèi)源過氧化氫和POD活性的變化是影響木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵。

2.5 脫萼過程中木質(zhì)素生物合成和活性氧代謝的相關(guān)性分析

為了探明脫萼過程中木質(zhì)素生物合成和活性氧的關(guān)聯(lián)，分別使用抑制劑處理后前中后3個(gè)時(shí)期的各項(xiàng)活性氧代謝和木質(zhì)素合成相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，并繪制出皮爾森相關(guān)系數(shù)相關(guān)性熱圖。由圖14可以看出， 活性氧相關(guān)處理后前期， 超氧陰離

子含量分別與細(xì)胞壁厚度（r=0.917**）和木質(zhì)素含量（r=0.917**）呈極顯著正相關(guān)；活性氧相關(guān)處理后中期，木質(zhì)素含量分別與過氧化氫含量（r=0.678*）和POD活性（r=0.864**）呈顯著或極顯著正相關(guān)，且染色分布范圍分別與過氧化氫含量（r=0.509）和POD活性（r=0.781**）呈正相關(guān)；活性氧相關(guān)處理后后期，染色分布分別與過氧化氫含量（r=0.632*）和POD活性（r=0.668*）呈顯著正相關(guān)，且木質(zhì)素含量分別與過氧化氫含量（r=0.921**）和POD活性（r=0.920**）呈極顯著正相關(guān)，而與羥基自由基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.900**）（圖14）。綜上所述，萼筒離層中中木質(zhì)素生物合成和活性氧代謝整體上呈正比例關(guān)系。其中，離區(qū)過氧化氫含量和POD活性與木質(zhì)素含量呈正比例關(guān)系，從而促進(jìn)了離層細(xì)胞壁增厚。

3 討論與結(jié)論

本研究中，觀察到脫萼果離層維管束直徑顯著小于宿萼果，且離層細(xì)胞壁開始木質(zhì)化增厚（圖1）。Ma等研究報(bào)道，更大的萼筒維管束平均面積可以為萼片提供足夠營(yíng)養(yǎng)和水分，防止離層的形成［22］。在擬南芥花瓣脫落中，DPI可以抑制離層NADPH氧化酶活性，影響木質(zhì)素單體的聚合過程，阻止花瓣脫落層中木質(zhì)素的積累［8］。脫萼過程可能也受到活性氧代謝和木質(zhì)素生物合成兩者的協(xié)同作用。因此，在本研究中篩選了參與活性氧代謝的抑制劑DPI來進(jìn)行試驗(yàn)。有研究報(bào)道，DPI可以與血紅素修復(fù)基團(tuán)反應(yīng)形成穩(wěn)定的化合物，特異性地抑制NADPH氧化酶活性影響活性氧代謝［23］。Hoffmann等研究表明，在木質(zhì)素聚合過程中，過氧化物酶可以利用H2O2催化單木酚氧化［24］。在脫萼關(guān)鍵形成時(shí)期，對(duì)梨幼果果實(shí)萼筒進(jìn)行DPI、H2O2以及DPI+H2O2處理的微量注射，每次間隔5 d進(jìn)行處理的抑制劑的補(bǔ)充注射。研究結(jié)果表明，處理后7 d，DPI處理能夠降低過氧化氫含量，減少木質(zhì)素含量，而外源過氧化氫早期不影響木質(zhì)素含量（圖2至圖5）。Liu等在水稻中發(fā)現(xiàn)外源H2O2可以增加水稻根部的木質(zhì)素含量，而DPI處理可以抑制這一現(xiàn)象［25］。中期萼筒離層在DPI處理下，仍可以通過降低離層過氧化氫的含量，抑制木質(zhì)素生物合成，而這個(gè)時(shí)期離層開始對(duì)過氧化氫促進(jìn)效果敏感，可以促進(jìn)內(nèi)源過氧化氫合成，但不影響木質(zhì)素含量（圖6至圖9）。Heng等報(bào)道已經(jīng)證明多胺代謝產(chǎn)生的H2O2影響了梨外皮組織的木質(zhì)化［26］。在處理后期，萼筒離層外源處理過氧化氫可以彌補(bǔ)DPI的抑制效果（圖10～圖13）。LAC啟動(dòng)氧化聚合后，POD在木質(zhì)素、半纖維素和擴(kuò)展素之間形成剛性交聯(lián)，進(jìn)而影響木質(zhì)化［27］。脫萼過程中木質(zhì)素生物合成和活性氧代謝之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，離區(qū)中過氧化氫和POD活性水平的升高可以增加離區(qū)木質(zhì)化染色分布，并提高木質(zhì)素的含量。

綜上結(jié)果表明，處理后全時(shí)期萼筒離層對(duì)DPI的抑制效果敏感，DPI可以抑制梨果實(shí)萼筒的細(xì)胞壁木質(zhì)化，過氧化氫可以在一定程度上彌補(bǔ)這一抑制過程，從而促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成過程。

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