李云磊，原 濤，陸宇燕 ，李丕鵬

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽(yáng)，110034；2.濰坊市寒亭區(qū)第一中學(xué)，濰坊，261100）

在種群生態(tài)學(xué)研究中，準(zhǔn)確判斷種群年齡結(jié)構(gòu)可以為評(píng)估種群生存現(xiàn)狀、預(yù)測(cè)種群未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)、調(diào)節(jié)和管控野生動(dòng)物種群提供科學(xué)依據(jù)，并為制定相應(yīng)的保護(hù)利用和管理計(jì)劃提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)［1-3］。種群年齡結(jié)構(gòu)是指不同年齡組別的個(gè)體數(shù)目在整個(gè)種群內(nèi)的比例或配置情況，目前年齡結(jié)構(gòu)特征主要分為增長(zhǎng)型、穩(wěn)定型和衰退型3 種類型［4］，表示種群年齡分布特征最直接的方法是金字塔法，其中橫軸表示分布的比例，縱軸表示年齡。若種群年齡分布特征呈金字塔型，則表示該種群處于增長(zhǎng)狀態(tài)，屬于增長(zhǎng)型；若種群年齡分布特征呈倒金字塔型，則表示該種群處于老齡化狀態(tài)，屬于衰退型；若種群年齡分布特征呈鐘形，則表示該種群各年齡組分布相對(duì)均衡和穩(wěn)定，屬于穩(wěn)定型。

全球兩棲類物種數(shù)量呈急劇減少的趨勢(shì)，甚至有些物種瀕臨滅絕［5-6］。2012年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，有2 469 種兩棲類物種數(shù)量逐漸減少［7］，自20 世紀(jì)70年代以來(lái)，保守估計(jì)有3.1%的兩棲類物種已經(jīng)滅絕［8］，因此，對(duì)兩棲類物種種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和分析尤為重要，動(dòng)態(tài)信息的掌握對(duì)兩棲動(dòng)物生理、生態(tài)，甚至形態(tài)分類學(xué)的研究都具有重要意義［9］。

1 骨齡學(xué)基本概述

1.1 骨齡學(xué)方法

個(gè)體年齡是種群特征研究中重要的信息之一，但在野外調(diào)查和后續(xù)分析中，很難直接準(zhǔn)確地判斷動(dòng)物個(gè)體的年齡。人們逐漸摸索出了借助于一些常規(guī)的生物學(xué)量度、解剖觀察和特定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)等間接推斷動(dòng)物的年齡。兩棲類動(dòng)物代謝功能的強(qiáng)弱會(huì)隨環(huán)境溫度的變化而變化［10］，這種變化在骨骼生長(zhǎng)過(guò)程中有明顯的印記。通過(guò)骨組織或骨板上的特殊生長(zhǎng)標(biāo)記來(lái)確定個(gè)體年齡的方式已經(jīng)在一些動(dòng)物年齡研究中得到了應(yīng)用，如龜類，通過(guò)在龜板上留下類似年輪的特殊標(biāo)記線來(lái)推斷龜類的年齡［11-12］。這種利用動(dòng)物生長(zhǎng)在骨組織上的特殊標(biāo)記線來(lái)推斷年齡的方法叫作骨齡學(xué)方法［13］。

馬常夫［14］曾利用“十氫奈泡脊椎骨”的方法對(duì)兩棲動(dòng)物的年齡進(jìn)行探究，將解剖出來(lái)的動(dòng)物脊椎骨去除肌肉，自然干燥后放入十氫奈中處理一定時(shí)間后，在顯微鏡下可觀察到椎骨關(guān)節(jié)凹盤處呈現(xiàn)的黑白相間的年齡環(huán)帶，以計(jì)算個(gè)體的年齡。由于凹盤的左右側(cè)壁向外傾斜，其上的環(huán)帶易被觀察到，但也有個(gè)體椎骨凹盤上的年齡環(huán)帶不夠清晰，因此對(duì)年齡的判斷可能出現(xiàn)誤差。另外，觀察時(shí)需要將動(dòng)物處死，不利于對(duì)物種的保護(hù)。

目前，在骨齡學(xué)方法研究中最為廣泛運(yùn)用并被廣大研究者接受和認(rèn)可的是利用兩棲類動(dòng)物的趾骨或指骨制作石蠟切片［15］，HE 染色，觀察骨切片上的生長(zhǎng)抑制線（也稱為年輪線，lines of arrested growth，LAG）數(shù)目，進(jìn)而確定個(gè)體年齡。該方法操作簡(jiǎn)便且得出的結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確［16-18］，更重要的是對(duì)研究個(gè)體損傷有限，不危及生命，但是此法無(wú)法確定處于四季交替不明顯、沒(méi)有明顯骨骼生長(zhǎng)痕跡的動(dòng)物個(gè)體的年齡［19］。

1.2 骨齡學(xué)原理

骨齡學(xué)方法確定年齡的主要依據(jù)是兩棲動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的年周期變化，在環(huán)境溫度適宜、食物和陽(yáng)光充足的情況下，機(jī)體代謝功能很快得到提升，表現(xiàn)為個(gè)體生長(zhǎng)（包括骨骼的生長(zhǎng)）速度加快，即生長(zhǎng)期。在環(huán)境溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，兩棲類動(dòng)物主動(dòng)調(diào)節(jié)代謝水平，降低到一定水平后進(jìn)入冬眠或夏眠狀態(tài)，此時(shí)機(jī)體的生長(zhǎng)速度極度減緩，稱為生長(zhǎng)的慢速期或停滯期［20］。在這種生長(zhǎng)的周期性變化中，兩棲動(dòng)物長(zhǎng)骨骨干中的有機(jī)物和礦物質(zhì)的沉積也呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，即快速生長(zhǎng)期，骨質(zhì)的快速生成導(dǎo)致有機(jī)物和礦物質(zhì)沉積密度較低；而生長(zhǎng)停滯期的骨質(zhì)生長(zhǎng)雖然緩慢，但有機(jī)物和礦物質(zhì)沉積卻顯現(xiàn)出較高的密度。因此，顯微觀察長(zhǎng)骨骨干部切片可清晰分辨出第1 年冬眠期及其前后生長(zhǎng)緩慢階段形成的骨環(huán)（染色較深）和第2 年生活期形成的骨環(huán)（染色較淺）之間形成的同心環(huán)狀分界線，這個(gè)環(huán)狀分界線被稱為L(zhǎng)AG［21］，依 據(jù)LAG 數(shù)目可 間接判 斷出個(gè)體的年齡。

1.3 骨齡學(xué)LAG識(shí)別

最早研究幼蛙和成年蛙長(zhǎng)骨組織結(jié)構(gòu)的Kastschenko 指出，兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物在長(zhǎng)骨組織學(xué)結(jié)構(gòu)上存在著明顯的差異性［22］，兩棲動(dòng)物長(zhǎng)骨骨質(zhì)缺少像哺乳類那樣獨(dú)立的、完整的骨單位［23］，會(huì)呈現(xiàn)出同心圓狀的層層推進(jìn)的生長(zhǎng)方式，這正是骨齡學(xué)研究的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

對(duì)LAG 進(jìn)行識(shí)別時(shí)，需要對(duì)骨骼切片的結(jié)構(gòu)有一定的了解（圖1），首先在顯微鏡下觀察長(zhǎng)骨切面時(shí)，骨髓腔的外側(cè)有一著色較淺的環(huán)狀骨質(zhì)結(jié)構(gòu)為內(nèi)骨板，內(nèi)骨板離心生長(zhǎng)，從骨髓腔處推進(jìn)式向外生長(zhǎng)［25-26］，通常在經(jīng)歷了第2 個(gè)冬眠期后才可觀察到（1齡蛙的長(zhǎng)骨組織切片上未觀察到內(nèi)骨板結(jié)構(gòu)），之后每年都會(huì)在原有內(nèi)骨板的外側(cè)形成1 層新的內(nèi)骨板層［22］。

圖1 西藏蟾蜍5齡雄性趾骨切片［24］Fig.1 The phalangeal bone of 5th instar male of Bufo tibetanus

在內(nèi)骨板與外骨板之間有2 條染色特征不同的環(huán)狀線條，靠近內(nèi)骨板外側(cè)的1 條著色較深且較粗的線條以及其外側(cè)靠近外骨板內(nèi)側(cè)著色較淺且較細(xì)的線條。前者為重吸收線，又稱回復(fù)線，其高度礦化，能夠被蘇木精深染色，同時(shí)可作為內(nèi)骨板與外骨板的分界線，在估計(jì)動(dòng)物的年齡時(shí)不可用，即沒(méi)有年代學(xué)價(jià)值［27］；后者是以首次發(fā)現(xiàn)此結(jié)構(gòu)的Kastschenko的名字命名［28］，稱Kastschenko 線（KL 線），其組織學(xué)結(jié)構(gòu)為1 層均質(zhì)的軟骨組織。在觀察長(zhǎng)骨切片時(shí)常可見(jiàn)內(nèi)、外骨板間出現(xiàn)部分分離的現(xiàn)象，這是由于內(nèi)、外骨板組織學(xué)結(jié)構(gòu)特性不同，在制片過(guò)程中化學(xué)和物理因素的收縮程度差異導(dǎo)致在KL 線處出現(xiàn)撕裂現(xiàn)象，這種現(xiàn)象并不影響內(nèi)、外骨板結(jié)構(gòu)的完整性，不妨礙對(duì)外骨板上LAG 的計(jì)數(shù)［29-30］。Kastschenko 認(rèn)為KL 線的軟骨組織結(jié)構(gòu)可能是幼體軟骨組織的部分殘余，該結(jié)構(gòu)在成體動(dòng)物骨骼發(fā)育中的作用還尚不清楚。也有學(xué)者認(rèn)為KL 與內(nèi)骨板的形成有關(guān)［31］。在KL線附近常常會(huì)發(fā)生重吸收現(xiàn)象［18］，該現(xiàn)象通常發(fā)生在近外骨板的區(qū)域，有可能會(huì)損傷外骨板最內(nèi)圈的LAG1，致使動(dòng)物個(gè)體年齡有被低估的可能［32-33］。重吸收現(xiàn)象僅出現(xiàn)在最內(nèi)圈LAG1 局部，并未發(fā)現(xiàn)將最內(nèi)圈LAG1 全部吸收的現(xiàn)象，只要切片質(zhì)量較好，并仔細(xì)觀察，對(duì)于LAG 計(jì)數(shù)的影響可以忽略［34］。Castanet 等［35］認(rèn)為外骨板骨質(zhì)的重吸收程度與個(gè)體的性成熟有關(guān)，性成熟越晚重吸收程度越嚴(yán)重，但是對(duì)博斯歐螈（Triturus boscai）的研究顯示，重吸收的程度與物種的性成熟年齡幾乎沒(méi)有必要的聯(lián)系，個(gè)體1 齡之前生長(zhǎng)期的時(shí)間長(zhǎng)短才是重吸收程度的決定性因素［36］。

在KL 區(qū)域內(nèi)可能存在著與骨質(zhì)形成有關(guān)的成骨細(xì)胞和與骨質(zhì)重吸收有關(guān)的破骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞作用于內(nèi)骨板的離心生長(zhǎng)；破骨細(xì)胞則作用于外骨板內(nèi)側(cè)的重吸收。在最外層以骨髓腔為中心呈現(xiàn)輻射狀生長(zhǎng)的為外骨板，它的生長(zhǎng)使長(zhǎng)骨骨壁逐年變粗［22］。外骨板由致密的骨組織構(gòu)成，顯微觀察長(zhǎng)骨橫切片時(shí)，可以清晰地看到外骨板上經(jīng)HE染色后同心排列的LAG［37］，它是鑒定年齡的唯一標(biāo)記。確定KL 后，可以輔助確定LAG1 的位置［38］，從第1 條LAG開始到外骨板最外緣所有的LAG 數(shù)目，即是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡［39］。

1.4 骨齡學(xué)LAG提示信息

在觀察中發(fā)現(xiàn)，每相鄰2 條LAG 之間骨組織的顏色與寬度均不同［40］，寬度反映了兩棲動(dòng)物對(duì)應(yīng)年份的生長(zhǎng)情況。2 條LAG 之間距離較寬，提示對(duì)應(yīng)年份環(huán)境條件（溫度、食物等）良好，適宜個(gè)體生長(zhǎng)，骨質(zhì)積累狀態(tài)良好。而環(huán)境條件相對(duì)較差時(shí)，個(gè)體的生長(zhǎng)速度明顯降低，2 條抑制線之間的寬度就較窄［41］。研究證明兩棲類個(gè)體在進(jìn)入繁殖期前有一個(gè)限制性條件，即個(gè)體必須到達(dá)本物種的最小體長(zhǎng)［42］，完成變態(tài)發(fā)育后，均有幾年的快速生長(zhǎng)期，因而在高海拔寒冷區(qū)域生活的兩棲類較溫暖區(qū)域的兩棲類物種需要更長(zhǎng)的時(shí)間達(dá)到最小繁殖體長(zhǎng)［43］，這種現(xiàn)象在長(zhǎng)骨切面有良好的印記，完成變態(tài)發(fā)育后1～4 年（不同物種有所不同）主要為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，此時(shí)2 條LAG 線間的距離較寬。一旦觀察到2 條LAG 線間的寬度明顯小于其內(nèi)側(cè)2 條LAG 線間的寬度時(shí)，則預(yù)示著此個(gè)體達(dá)到了性成熟年齡［41］。究其原因，是由于兩棲類動(dòng)物個(gè)體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)之間的能量投入發(fā)生了顯著變化，在前期為了盡早達(dá)到性成熟的最小體長(zhǎng)，兩棲類動(dòng)物將大部分能量用于生長(zhǎng)和發(fā)育，在達(dá)到目標(biāo)后轉(zhuǎn)而將更多的能量投入到生殖腺及其相關(guān)器官的結(jié)構(gòu)和功能的構(gòu)建和完善中，為進(jìn)入繁殖期做好充分的準(zhǔn)備［44-45］。當(dāng)然也存在一些特殊情況，如個(gè)體達(dá)到性成熟后，來(lái)年的環(huán)境條件優(yōu)渥，機(jī)體在保證生殖投入的前提下，仍能保持較好的生長(zhǎng)速度，就會(huì)出現(xiàn)性成熟后1 年的2 條LAG 線間寬度大于性成熟當(dāng)年所形成的LAG 線寬度的情況［46］。

2 骨齡學(xué)方法的運(yùn)用

對(duì)兩棲動(dòng)物骨齡學(xué)的研究可以追溯到20 世紀(jì)40 年代，兩棲動(dòng)物第1 次骨齡學(xué)技術(shù)的成功嘗試是以顱骨為試驗(yàn)材料完成的［13］，1940—1968 年，有學(xué)者利用不同的骨塊作為試驗(yàn)材料探究了兩棲動(dòng)物的年齡問(wèn)題。Senning［13］采用副蝶骨測(cè)定了泥螈（Necturus maculosus）的個(gè)體年齡，Schroeder 等［47］采用翼狀骨對(duì)牛蛙（Lithobatus catesbeianus）的年齡進(jìn)行分析和研究，在后續(xù)的研究中分別有學(xué)者利用肱骨、股骨、脛腓骨和椎骨等作為試驗(yàn)材料探究動(dòng)物的年齡［48］，直到Smirina［18］的試驗(yàn)證明動(dòng)物趾/指骨同樣能良好地呈現(xiàn)出LAG 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，指出該試驗(yàn)的取材方式可以更好地避免對(duì)動(dòng)物個(gè)體造成破壞性傷害，此后利用趾/指骨測(cè)定動(dòng)物年齡的方法逐步被認(rèn)可并廣泛使用。

2003 年，Pancharatna 等［48］對(duì)印度大頭蛙（Limnonectes limnocharis）的肱骨、股骨、脛腓骨、橈尺骨和趾骨5 種長(zhǎng)骨的LAG 對(duì)比分析，結(jié)果顯示趾/指骨的LAG 數(shù)量基本與其他長(zhǎng)骨的LAG 數(shù)量保持一致，進(jìn)一步證明趾/指骨作為兩棲動(dòng)物骨齡學(xué)研究材料的可行性。2008年，美國(guó)內(nèi)政部（U.S.Department of the Interior）和美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局（U.S.Geological Survey）組織專家編寫使用骨齡學(xué)方法研究無(wú)尾兩棲動(dòng)物年齡的方法指南［49］，旨在對(duì)骨齡學(xué)試驗(yàn)技術(shù)方法建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)研究工作的規(guī)范化。陳貴英等［50］在2008 年提出，根據(jù)骨齡學(xué)方法利用動(dòng)物指骨或趾骨除可鑒定動(dòng)物年齡外，還可兼顧種群生態(tài)學(xué)研究中的個(gè)體標(biāo)記和分子生物學(xué)研究中的組織取樣，在必要的取材需求下，盡量降低對(duì)個(gè)體的創(chuàng)傷以達(dá)到對(duì)兩棲動(dòng)物資源的保護(hù)。對(duì)近年來(lái)的研究結(jié)果統(tǒng)計(jì)，顯示現(xiàn)存的8 146種兩棲動(dòng)物中，只有266種（3.3%）進(jìn)行了骨齡學(xué)研究，其中蠑螈56 種、無(wú)尾兩棲類208種，溫帶物種多于熱帶物種［51］。由此可見(jiàn)，兩棲類種群的年齡結(jié)構(gòu)信息仍存在嚴(yán)重不足，對(duì)全面掌握兩棲類種群現(xiàn)狀、發(fā)展信息及物種保護(hù)極為不利。

3 骨齡學(xué)LAG計(jì)數(shù)

骨齡學(xué)方法雖然快速、簡(jiǎn)便，但在年齡的確定過(guò)程中依舊容易出現(xiàn)誤差，需要掌握形態(tài)學(xué)方面的知識(shí)來(lái)避免年齡鑒定過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤。

3.1 選取觀察部位

Rozenblut 等［22］通過(guò)對(duì)3 種歐洲水蛙（Rana lessonae，R.ridibunda，R.esculenta）長(zhǎng)骨分化與發(fā)育的研究，發(fā)現(xiàn)在蝌蚪40～44 期時(shí)，軟骨原始細(xì)胞最外層的細(xì)胞分化成外骨膜，開始逐漸形成外骨板（外骨膜骨）；從41 期開始，長(zhǎng)骨骨干中央肥大的軟骨細(xì)胞退化，骨髓腔逐漸形成；到46 期，骨髓腔向兩端擴(kuò)大至靠近骨骺處，最終形成1 個(gè)沙漏型的長(zhǎng)管狀。因此在做長(zhǎng)骨切片觀察LAG 時(shí)，首選長(zhǎng)骨近中部髓腔較小的部位切片，以便觀察到較為完整的外骨板結(jié)構(gòu)，為準(zhǔn)確計(jì)數(shù)LAG 提供保障［22］。尤其在長(zhǎng)骨骨干中部，長(zhǎng)度為整塊骨長(zhǎng)度的25%～35%處，可得到LAG的最大數(shù)值［52］。

3.2 附加線

附加線即所謂的假線，假線的形成是由于個(gè)體受傷或遇到短暫的氣候劇烈變化或食物缺乏而在長(zhǎng)骨切面上的反映，一般假線僅在局部出現(xiàn)，未見(jiàn)其形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且線條結(jié)構(gòu)不清晰［53］。它雖然代表動(dòng)物在某個(gè)生長(zhǎng)期的停滯生長(zhǎng)卻不代表年周期的生長(zhǎng)停滯［54］，計(jì)數(shù)時(shí)很容易與LAG區(qū)分。

3.3 雙重線

有些兩棲動(dòng)物以夏眠的方式度過(guò)酷熱缺水的夏季，此時(shí)在長(zhǎng)骨切面上將出現(xiàn)2 條清晰且非?？拷念愃芁AG 的結(jié)構(gòu)，稱之為“雙重線”［54］。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常把這種情況記為1條LAG。

3.4 外側(cè)LAG判斷

在觀察一些老年個(gè)體的LAG 時(shí)，由于生長(zhǎng)緩慢致使2 個(gè)年周期的LAG 距離極為接近，若同時(shí)出現(xiàn)假線將更加難以區(qū)分［39］，此時(shí)需要有高質(zhì)量的組織學(xué)切片，在高倍鏡下還可較清晰地辨認(rèn)每條LAG，對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果影響不大［55］。如果是在生長(zhǎng)期后期或冬眠前期捕獲的個(gè)體，可觀察到在外骨板的最外側(cè)有一淺染的骨質(zhì)環(huán)，此環(huán)是當(dāng)年生長(zhǎng)期產(chǎn)生的骨質(zhì)，由于沒(méi)有冬眠期產(chǎn)生的致密骨質(zhì)的“襯托”，其尚未形成清晰的LAG，因此，計(jì)數(shù)骨齡時(shí)需要將其計(jì)算在內(nèi)，若忽略此環(huán)則會(huì)低估個(gè)體年齡。

4 結(jié)論

出于對(duì)兩棲動(dòng)物保護(hù)的迫切需要，骨齡學(xué)領(lǐng)域的研究越來(lái)越活躍，除了對(duì)生長(zhǎng)停滯具有明顯周期性變化的溫帶兩棲動(dòng)物，如大蟾蜍（Bufo bufo）［56］、美洲林蛙（Rana sylvatica）［57］和歐洲林蛙（R.temporaria）［42］等開展研究外，對(duì)代謝功能變化不明顯的熱帶和亞熱帶兩棲動(dòng)物年齡的研究也逐漸增多［58-59］，一部分研究表明骨齡學(xué)方法可以應(yīng)用于沒(méi)有明顯四季變化的熱帶和亞熱帶物種，但也有一部分熱帶兩棲動(dòng)物骨骼沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)痕跡。在未來(lái)的研究中，挖掘出更多骨齡學(xué)研究信息，是值得期待和努力的。