鄧振 王欣然 譚瑞娜 馬玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)，又名白樺茸[1]，是一種應用前景廣泛的藥用真菌，有效成分主要是三萜類、木質(zhì)素類、黑色素類、葉酸衍生物等化合物[2]，對糖尿病、高血脂、高血糖等多種疾病具有一定的療效[3]，且已證實具有安全性高、低毒性的特點，可被用于開發(fā)為保健品等[4-5]；由于人工栽培的樺褐孔菌藥用價值遠不及野生菌株[6]，而樺褐孔菌野外資源十分短缺[7]。目前，如何提高樺褐孔菌活性成分的產(chǎn)量是人工培養(yǎng)過程中的研究熱點[8]。朱春玉[9]等人發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌菌絲體具有和子實體相同的藥用價值；Wang et al.[10]發(fā)現(xiàn)維生素能夠提高樺褐孔菌胞外多糖(EPS)含量。維生素通常以輔酶或輔基的形式參與合成與代謝相關的酶類，促進甲基的形成和轉(zhuǎn)移，促進細胞周圍組織中碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝，并參與調(diào)節(jié)DNA鏈的合成[11]。研究顯示維生素促進靈芝三萜類化合物的合成[12]。研究還發(fā)現(xiàn)維生素對滑菇和金針菇具有促生作用[13-14]。真菌在細胞質(zhì)中以乙酰CoA為原料，通過MVA途徑合成三萜[15-16]。在這個過程中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、角鯊烯合酶(SQS)、羊毛甾醇合酶(LS)等是該代謝途徑的關鍵酶[17]。因此，本研究測定了樺褐孔菌培養(yǎng)第10天時B族維生素對樺褐孔菌內(nèi)的法尼基焦磷酸合酶、角鯊烯合酶的活力影響。

目前，維生素對樺褐孔菌的生長及三萜類化合物積累的影響的研究報道較少，因此本研究通過液態(tài)發(fā)酵的方式，以樺褐孔菌作為研究對象，維生素作為生長因子，探究VB1、VB3、VB6、VB12對樺褐孔菌生物量、三萜質(zhì)量分數(shù)及三萜相關代謝途徑關鍵酶活性的影響，以提高樺褐孔菌及其活性成分的產(chǎn)量，為樺褐孔菌的人工栽培提供一定參考。

1 材料與方法

樺褐孔菌菌株來自東北林業(yè)大學生物農(nóng)藥與分子生物學實驗室；高氯酸、VB1、VB3、VB6、VB12均為國產(chǎn)分析純；無水乙醇(分析純)、冰乙酸(分析純)購自天津市富宇精細化工有限公司；香草醛(CAS號：121-33-5)購自天津市天新精細化工開發(fā)中心；維生素B1(分析純)、白樺脂醇(標準品)(CAS號：473-98-3)購自上海源葉生物科技有限公司；法尼基焦磷酸合酶試劑盒、角鯊烯合成酶試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市儀器有限公司；MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌鍋，Panasonic(日本)；Eppendorf移液器(德國)；電子天平，賽多利科學儀器(北京)；MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠(中國)；Sorvall Legend MicroCL 17R微量離心機，Thermo Scientific(美國)；JXFSTPRP-32全自動多樣品液氮研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司(中國)；SW-CJ-1FD(垂直)醫(yī)用型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司(中國)；SIM-F124型制冰機，日本SANYO(日本)；微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司；ZD-85恒溫振蕩器，蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；全波長酶標分析儀，天津澤瑞分析儀器有限公司。

1.1 菌株的活化

制備PDA培養(yǎng)基(200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖和20 g/L瓊脂)，滅菌結束后倒入培養(yǎng)皿，將4 ℃保存的樺褐孔菌菌種，在超凈工作臺中用接種鉤將樺褐孔菌菌絲接種到PDA培養(yǎng)基中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃避光培養(yǎng)，待長滿平板后備用。制備PD培養(yǎng)基(200 g/L馬鈴薯和20 g/L葡萄糖)，冷卻后添加VB1、VB3、VB6、VB12至50 mL(質(zhì)量濃度為20、15、10、5 mg/L)，取提前活化的樺褐孔菌菌株3～4塊于培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)10 d[18]。

生物量的測定：將搖床培養(yǎng)10 d的樺褐孔菌通過8層紗布過濾得到樺褐孔菌菌絲體，用去離子水潤洗3次，收集菌絲體，將菌絲體置于烘箱60 ℃烘干，稱其質(zhì)量以計算菌絲體質(zhì)量，并于4 ℃保存直至下一步分析。

1.2 三萜質(zhì)量分數(shù)測定

以白樺脂醇為標準品，采用超聲波輔助香草醛-冰醋酸-高氯酸法測定總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)。

標準曲線的繪制：精密稱取10.00 mg干燥恒質(zhì)量的白樺脂醇標準品，加體積分數(shù)95%的乙醇溶液，稀釋至刻度并搖勻，即質(zhì)量濃度為0.2 g/L的標準品溶液，分別精密吸取標準溶液0、200、400、600、800、1 000 μL于具塞試管中，70 ℃水浴揮去溶劑。加入新配制得的5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，再加入高氯酸1.0 mL搖勻，于70 ℃恒溫水浴25 min，迅速冷卻，加乙酸5 mL，搖勻，在550 nm處測定吸光值。白樺脂醇質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[19]。

圖1 三萜標準曲線(白樺脂醇標準品)

三萜質(zhì)量分數(shù)的測定：準確稱取樺褐孔菌粉末100 mg，加3 mL異丙醇，60 ℃浸提2 h，超聲波提取15 min[20-21]。吸取提取后的樺褐孔菌總?cè)飘惐继崛∥锶芤?.1 mL于具塞試管中，70 ℃水浴揮去溶劑，在550 nm下測定吸光值，以不加樣品溶液作空白對照，用標準曲線回歸方程計算其質(zhì)量濃度，并乘以其體積，即為總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)。

1.3 三萜代謝途徑(MVA)相關酶活力測定

應用雙抗體夾心法測定樣本中法尼基焦磷酸合酶、角鯊烯合成酶。首先用純化的真菌法尼基焦磷酸合酶、角鯊烯合成酶捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入法尼基焦磷酸合酶、角鯊烯合成酶，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的真菌法尼基焦磷酸合酶、角鯊烯合成酶呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線回歸方程計算質(zhì)量濃度，并乘以其稀釋倍數(shù)，即為樣品中真菌法尼基焦磷酸合酶、角鯊烯合成酶活性。

2 結果與分析

2.1 維生素B對樺褐孔菌生長及三萜化合物積累的影響

由表1可知，與對照組相比VB1質(zhì)量濃度為5 mg/L時生物量與對照組無明顯差異，三萜類物質(zhì)產(chǎn)量最大(35.95 mg/g)；質(zhì)量濃度為10 mg/L時樺褐孔菌生物量達到最大值(3.35 g/L)同時對三萜化合物的合成產(chǎn)生了促進作用；質(zhì)量濃度為15和20 mg/L的VB1對樺褐孔菌不僅具有抑生作用同時也抑制了其三萜的合成，且隨著質(zhì)量濃度的增大抑制效果越明顯。最終確定當VB1的質(zhì)量濃度為5 mg/L時最適于樺褐孔菌的發(fā)酵(圖2)。

圖2 法尼基焦磷酸合酶和角鯊烯合酶標準曲線

表1 不同質(zhì)量濃度VB1時樺褐孔菌生物量和三萜質(zhì)量分數(shù)

由表2可以發(fā)現(xiàn)，VB3質(zhì)量濃度為5、20 mg/L時樺褐孔菌生物量略高于對照組但其三萜的合成受到了抑制。在質(zhì)量濃度為10和15 mg/L的VB3對樺褐孔菌的生長具有顯著促進作用的同時也促進了三萜的合成，對生物量及三萜質(zhì)量分數(shù)的綜合考慮認為當VB3的質(zhì)量濃度為15 mg/L時最適于樺褐孔菌的發(fā)酵。

表2 不同質(zhì)量濃度VB3時樺褐孔菌生物量和三萜質(zhì)量分數(shù)

由表3可見，與對照組相比VB6質(zhì)量濃度從5 mg/L增加至15 mg/L時生物量達到最大(3.38 g/L)。質(zhì)量濃度為20 mg/L時VB6對樺褐孔菌的生長具有抑制作用。質(zhì)量濃度為5、10、15和20 mg/L的VB6對樺褐孔菌三萜的合成都具有一定的促進作用，其中，質(zhì)量濃度5 mg/L時，對樺褐孔菌三萜的合成達到最大值(39.81 mg/g)。因此認為當VB6的質(zhì)量濃度為5 mg/L時最適于樺褐孔菌的發(fā)酵。

表3 不同質(zhì)量濃度VB6時樺褐孔菌生物量和三萜質(zhì)量分數(shù)

由表4發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為5、10、15和20 mg/L的VB12對樺褐孔菌均具有促生作用，其中10 mg/L的VB12對樺褐孔菌的生物量具有最顯著的促生作用(2.72 g/L)。在含有質(zhì)量濃度為5、10、15和20 mg/L的VB12的發(fā)酵液中樺褐孔菌三萜質(zhì)量分數(shù)分別是對照組的1.74、2.03、2.43、2.64倍，綜合考慮認為質(zhì)量濃度為20 mg/L的VB12對樺褐孔菌三萜合成的促進作用最為顯著。

表4 不同質(zhì)量濃度VB12時樺褐孔菌生物量和三萜質(zhì)量分數(shù)

2.2 維生素B對樺褐孔菌三萜代謝相關酶活性的影響

從表5可以看出，VB1在質(zhì)量濃度為5 mg/L時法尼基焦磷酸合酶的活性低于對照組，隨著質(zhì)量濃度的增大酶活性也隨之提高，當質(zhì)量濃度為15 mg/L時法尼基焦磷酸合酶的活性達到最大(32.95 μg/L)；VB1質(zhì)量濃度為10、15、20 mg/L時其角鯊烯合酶的活性高于對照組，15 mg/L活性達到最高(70.66 μg/L)，VB1質(zhì)量濃度為5 mg/L時，角鯊烯合酶的活性低于對照組。

表5 不同質(zhì)量濃度VB1時樺褐孔菌三萜代謝途徑關鍵酶活性

由表6可見，VB3在質(zhì)量濃度為15 mg/L時酶活性低于對照組，VB3質(zhì)量濃度為20 mg/L時法尼基焦磷酸合酶的活性最高(36.54 μg/L)；在5、10、15、20 mg/L質(zhì)量濃度下的VB3中，培養(yǎng)10 d的樺褐孔菌角鯊烯合酶的活性均低于對照組，在5與20 mg/L的角鯊烯合酶的活性要高于10、15 mg/L的質(zhì)量濃度下的角鯊烯合酶的活性，且質(zhì)量濃度為10 mg/L時角鯊烯合酶的活性最低(60.78 μg/L)。

表6 不同質(zhì)量濃度VB3時樺褐孔菌三萜代謝途徑關鍵酶活性

由表7發(fā)現(xiàn)，當VB6質(zhì)量濃度為10 mg/L時法尼基焦磷酸合酶的活性高于對照組，VB6質(zhì)量濃度為5、15、20 mg/L時法尼基焦磷酸合酶活性與對照組并無明顯差異；當VB6質(zhì)量濃度為5 mg/L時角鯊烯合酶的活性高于對照組，且達到78.99 μg/L，之后隨著VB6質(zhì)量濃度的增加角鯊烯合酶的活性有所下降。

表7 不同質(zhì)量濃度VB6時樺褐孔菌三萜代謝途徑關鍵酶活性

由表8發(fā)現(xiàn)，試驗組不同質(zhì)量濃度的VB12的法尼基焦磷酸合酶的活性均低于對照組，其中質(zhì)量濃度為5 mg/L時酶活性達到最低(20.32 μg/L)；而添加VB12的各處理組角鯊烯合酶的活性均要低于對照組，當質(zhì)量濃度為15 mg/L時，其活性最低(56.74 μg/L)。

表8 不同質(zhì)量濃度VB12時樺褐孔菌三萜代謝途徑關鍵酶活性

3 討論與結論

由于樺褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)生長緩慢、活性物質(zhì)產(chǎn)量低，人工培養(yǎng)效果不理想，樺褐孔菌工廠化生產(chǎn)難以實現(xiàn)，因此需要對樺褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進行不斷優(yōu)化。本研究以4種不同的維生素B作為外源因子，以生物量、菌絲內(nèi)總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)及三萜合成關鍵酶活性作為指標，探討VB1、VB3、VB6、VB12對樺褐孔菌液體發(fā)酵的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同的維生素B在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對樺褐孔菌菌絲具有一定的促生作用，同時對樺褐孔菌內(nèi)三萜化合物的積累具有一定的促進作用。其中VB1、VB3、VB6、VB12分別在質(zhì)量濃度為5、15、5、20 mg/L時對樺褐孔菌的生物量及三萜化合物積累達到最佳；在對樺褐孔菌三萜合成關鍵酶活性的測定中我們發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第10天時4種B族維生素對角鯊烯合酶、法尼基焦磷酸合酶的活性具有一定的促進作用但與對照組差異并不顯著。

綜上，本研究結果表明，維生素B在一定質(zhì)量濃度下促進了樺褐孔菌菌絲的生長，初步驗證了維生素B對樺褐孔菌三萜代謝關鍵酶活性具有促進作用，進而提高了三萜化合物的產(chǎn)率。這為人工獲得穩(wěn)定高產(chǎn)菌絲量及活性物質(zhì)的樺褐孔菌提供了理論參考。維生素是食用菌生長發(fā)育過程中必不可少的作用因子，通常以輔酶或輔基的形式參與到食用菌相關代謝過程[14]。目前，維生素在樺褐孔菌三萜類物質(zhì)的合成作用方式及作用機制尚不明確，仍需進一步研究，從而在分子層面提高樺褐孔菌活性物質(zhì)的合成積累。