程婷

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

關(guān)韜 趙曉 馬旭俊

(國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)國(guó)有林區(qū)森林資源監(jiān)測(cè)中心)(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

楊樹是重要的工業(yè)用材樹種。楊樹優(yōu)良品種的選育和通過遺傳改良來提高楊樹抗逆性和抗病性對(duì)于生產(chǎn)具有重要意義[1-2]。楊樹葉枯病主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、河南等地，可以危害毛白楊、小葉楊、小青楊、銀白楊、北京楊等多種楊樹葉片[3]。鏈格孢菌是楊樹葉枯病的病原菌。該菌主要侵害楊樹的葉片和幼嫩的枝梢,造成葉片枯黃,枝梢死亡等[4-5]。目前對(duì)該病的防治并沒有非常有效的措施，主要是化學(xué)防治，這存在環(huán)境污染、生態(tài)系統(tǒng)平衡的破壞等弊端[6-7]。因此，篩選并鑒定抗病基因，明確其在抗病過程中的功能及其抗病分子機(jī)理，不僅有利于楊樹抗葉枯病機(jī)制的研究，而且能為楊樹育種提供候選基因[8-9]。

當(dāng)植物受到病原微生物的侵害時(shí)，會(huì)通過改變細(xì)胞代謝以及激活防御基因的表達(dá)來誘發(fā)某種防御機(jī)制以抵御病原菌帶來的危害[10]。在植物對(duì)病原菌的防御過程中，SA和JA等植物激素起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。PR為病程相關(guān)基因，LOX和JAZ10等常被作為檢測(cè)JA防御應(yīng)答的標(biāo)記基因[11]。研究植物受到病原微生物侵害時(shí)關(guān)鍵應(yīng)答基因的功能以及參與的防御機(jī)制對(duì)提高植物的抗病性具有重要意義。

組蛋白去乙?；?HDAC)催化組蛋白去乙?；瑓⑴c組蛋白乙?；癄顟B(tài)的調(diào)控，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。草本植物中的研究表明，HDAC家族基因過量表達(dá)或敲除，能夠影響植物體內(nèi)組蛋白乙?；?，調(diào)節(jié)植物的抗病性[13-14]。在前期研究中，我們從毛果楊(Populustrichocarpa)中克隆了一種HD2類型的組蛋白去乙酰化酶基因PtHDT902，并將該基因?qū)?4K楊(Populusalba×Populusglandulosa)中，使該基因過量表達(dá)[15-16]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過檢測(cè)鏈格孢菌、SA和MeJA對(duì)毛果楊組蛋白去乙?；富騊tHDT902表達(dá)的影響，以及分析在接種鏈格孢菌后野生型和PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊葉片的表型，明確PtHDT902在楊樹葉枯病應(yīng)答反應(yīng)中的功能。此外，分析了PtHDT902對(duì)抗病防御相關(guān)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明PtHDT902作用的分子機(jī)制以及植物抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和植物材料

鏈格孢菌(A.alternata)購自中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CFCC)。

野生型毛果楊、野生型84K楊和PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊(轉(zhuǎn)基因植株的獲得見參考文獻(xiàn)[15]、[16])組培幼苗來自本實(shí)驗(yàn)室，均在(25±2)℃，16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)。

1.2 鏈格孢菌的培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備

用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，25 ℃，培養(yǎng)15 d。向平皿內(nèi)加入20 mL無菌水制備孢子懸浮液，在無菌漏斗中從上至下依次鋪入300、400及500目的過濾網(wǎng)進(jìn)行過濾。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子的濃度，達(dá)到2×107個(gè)/mL時(shí)，用于侵染實(shí)驗(yàn)。

1.3 病害程度分級(jí)

根據(jù)菌斑面積大小將受害程度分為3個(gè)等級(jí)：Ⅰ級(jí)是菌斑面積≤0.1 cm2，Ⅱ級(jí)是0.1 cm2<菌斑面積≤0.3 cm2，Ⅲ級(jí)是菌斑面積>0.3 cm2。

1.4 植株激素處理和鏈格孢菌接種

選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的、健壯的1月齡野生型毛果楊幼苗進(jìn)行鏈格孢菌和激素處理。在鏈格孢菌侵染試驗(yàn)中，選取植株的第2～3片葉剪下來放在濕潤(rùn)的濾紙上，每個(gè)平皿放4片葉，在主葉脈兩側(cè)各滴10 μL孢子懸浮液，對(duì)照組則滴10 μL無菌水。每個(gè)株系對(duì)照三皿，處理三皿。接種后的葉片在25 ℃，16 h光照/8 h黑暗的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為0、3、12、24和48 h。在激素處理試驗(yàn)中，將植株分別在含有200 μmol/L SA和200 μmol/L MeJA的水溶液中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為0、4、6和12 h。選取長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)狀態(tài)一致的1月齡84K楊野生型(WT)和PtHDT902轉(zhuǎn)基因株系Tr-1和Tr-2各6株進(jìn)行鏈格孢菌侵染試驗(yàn)。接種過程同毛果楊，培養(yǎng)7 d。侵染實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

處理時(shí)間結(jié)束后收集植物的葉片，經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃。用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

1.5 毛果楊PtHDT902基因的表達(dá)分析

采用pBIOZOL試劑(BioFLUX)提取上述1.4中保存的葉片總RNA，利用PrimeScript TM RT Reagent Kit(TaKaRa)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

利用qRT-PCR技術(shù)，分析SA、JA和鏈格孢菌處理不同時(shí)間時(shí)PtHDT902基因的表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系為：TBGreenPremixExTaq(TliRNaseHPlus)(2×)(TaKaRa)10 μL，PtHDT902基因的上下游引物(見表1)(10 mmol/L)各0.8 μL，模板cDNA(10～12.5 ng)2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。以18S rRNA(18S)作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。利用2-ΔΔCt方法分析，PtHDT902基因在非處理?xiàng)l件下的表達(dá)量設(shè)定為1，處理后基因的表達(dá)量是相對(duì)于非處理的相對(duì)值。PCR儀為德國(guó)耶拿qTOWER3GCycler熒光定量PCR儀。

1.6 細(xì)胞學(xué)染色

野生型和PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊的葉片在接種鏈格孢菌7 d后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色，分析葉片的抗病性。(1)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。葉片在1 g/L(pH=3.8)的DAB溶液中染色過夜，用乙醇進(jìn)行脫色去除葉綠素；(2)臺(tái)盼藍(lán)染色。葉片置于乳酚(V(苯酚)∶V(甘油)∶V(乳酸)∶V(水)=1∶1∶1∶1)和2.5 g/L的臺(tái)盼藍(lán)染色液中煮沸2 min，待葉片冷卻后，用12.5%的水合氯醛溶液進(jìn)行脫色去除葉綠素；(3)苯胺藍(lán)染色。葉片在V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1中固定并脫色去除葉綠素，然后用0.1%苯胺藍(lán)(溶于100 mmol/L K2HPO4，pH=8.5)染色。將脫色后的葉片置于10%水合氯醛溶液中保存，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 抗病防御相關(guān)基因的表達(dá)

為了明確PtHDT902在抗病防御體系中的作用，分析了野生型和PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊植株中LOX、JAZ10、PR4、PR1-1、POD、SOD、CAT-1和CAT-2基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系為2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)10 μL、上下游引物(10 mmol/L)各1 μL、模板cDNA 25 mg/L、ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。表1為引物序列。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊經(jīng)鏈格孢菌和激素處理后PtHDT902的表達(dá)

鏈格孢菌接種3 h即能誘導(dǎo)PtHDT902基因的表達(dá)，在接種12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，約是處理前表達(dá)量的8倍，之后開始下降，在48 h時(shí)接近于初始值(表2)。SA和MeJA處理均能誘導(dǎo)PtHDT902基因的表達(dá)。SA處理4 h就能誘導(dǎo)PtHDT902的表達(dá)，處理6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，約是處理前表達(dá)量的8倍，之后開始下降(表2)。MeJA處理也能誘導(dǎo)PtHDT902基因的表達(dá)，在MeJA處理4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，約是處理前表達(dá)量的4倍，之后逐漸下降(表2)。這些結(jié)果表明，PtHDT902的表達(dá)受鏈格孢菌、SA和MeJA的誘導(dǎo)。

表2 鏈格孢菌和激素處理后PtHDT902的表達(dá)

2.2 PtHDT902過量表達(dá)降低84K楊葉片對(duì)鏈格孢菌的抗性

接種鏈格孢菌7 d后，PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊植株葉片形成的菌斑面積明顯大于野生型(圖1)。根據(jù)菌斑面積大小，對(duì)野生型和PtHDT902轉(zhuǎn)基因植株葉片病害程度分級(jí)，野生型植株葉片產(chǎn)生22個(gè)Ⅰ級(jí)病斑，產(chǎn)生2個(gè)Ⅱ級(jí)病斑，而轉(zhuǎn)基因株系Tr-1和Tr-2葉片產(chǎn)生Ⅰ級(jí)病斑的個(gè)數(shù)分別為5和10個(gè)，產(chǎn)生Ⅱ級(jí)病斑的個(gè)數(shù)分別為13和14個(gè)，產(chǎn)生Ⅲ級(jí)病斑的個(gè)數(shù)為6和0個(gè)(表3)。這些結(jié)果說明，PtHDT902基因過量表達(dá)降低了84K楊對(duì)鏈格孢菌的抗性。

圖1 PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊葉片接種鏈格孢菌后的表型

表3 PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊葉片接種鏈格孢菌后受害程度分級(jí)

2.3 PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊葉片對(duì)鏈格孢菌的抗病性測(cè)定

接種鏈格孢菌7 d后，對(duì)葉片進(jìn)行DAB、臺(tái)盼藍(lán)和苯胺藍(lán)染色。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株染病葉片產(chǎn)生的棕紅色斑點(diǎn)數(shù)量較多，顏色較深，積累較多的活性氧(圖2A)，死亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加(圖2B)，菌絲的積累明顯增多(圖2C)。這些染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊植株的葉片對(duì)鏈格孢菌的防御能力降低。

A為DAB染色；B為臺(tái)盼藍(lán)染色；C為苯胺藍(lán)染色，放大4倍。

2.4 PtHDT902對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

在所研究的基因中，PR1-1、PR4、LOX和JAZ10的表達(dá)受PtHDT902的調(diào)控。與野生型植株相比，PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊植株葉片接種鏈格孢菌后，病程相關(guān)抗性基因PR1-1和PR4的表達(dá)均顯著降低；JA合成相關(guān)基因LOX的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而JA合成途徑的抑制因子JAZ10在轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)水平上調(diào)(圖3)。我們還分析了活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)活性氧清除相關(guān)基因SOD、POD和CAT的表達(dá)無明顯變化(圖3)。這些結(jié)果表明，PtHDT902可能通過調(diào)控JA的合成來調(diào)控JA信號(hào)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控植株對(duì)鏈格孢菌的響應(yīng)，而不是通過調(diào)節(jié)活性氧的清除來調(diào)節(jié)楊樹對(duì)鏈格孢菌的響應(yīng)。

圖3 脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

木本植物HD2類型的組蛋白去乙?；冈谏锩{迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能還不清楚。我們分析了植物激素JA和SA以及鏈格孢菌侵染對(duì)毛果楊PtHDT902基因表達(dá)的影響。JA和SA都能誘導(dǎo)PtHDT902的表達(dá)，這一結(jié)果與大麥和水稻HD2基因的表達(dá)模式相近[17-18]。鏈格孢菌也能夠誘導(dǎo)PtHDT902基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PtHDT902參與鏈格孢菌引起的生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。本研究分析了PtHDT902轉(zhuǎn)基因84K楊對(duì)鏈格孢菌的抗病性。PtHDT902過量表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鏈格孢菌的抗性，病程相關(guān)抗性基因PR1-1和PR4的表達(dá)水平也降低。本研究推測(cè)，當(dāng)PtHDT902被鏈格孢菌誘導(dǎo)表達(dá)后，能夠通過組蛋白去乙?；饔靡种埔恍┛共』虻谋磉_(dá)，導(dǎo)致植株抗病性的減弱。毛果楊PtHDT902似乎是楊樹葉枯病抗性的負(fù)調(diào)控因子，而PtHDT902的作用機(jī)制還有待深入研究。植物對(duì)病原菌侵染的抵御是一個(gè)復(fù)雜的過程，激素在抵御病原菌侵害中具有重要的作用[19-25]。研究中，SA和MeJA處理均能誘導(dǎo)毛果楊葉片中PtHDT902基因的表達(dá)。此外，鏈格孢菌侵染也能誘導(dǎo)毛果楊葉片中PtHDT902基因的表達(dá)。在野生型84K楊和PtHDT902轉(zhuǎn)基因植株葉片接種鏈格孢菌7 d后，JA合成相關(guān)基因LOX在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量低于野生型，而JA合成的抑制因子JAZ10在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)明顯上升。這些研究結(jié)果表明，PtHDT902參與SA和JA信號(hào)途徑來調(diào)控毛果楊對(duì)病害的防御反應(yīng)。PtHDT902可能控制SA和JA信號(hào)途徑中一些基因的表達(dá)，使植物對(duì)病害做出適度的反應(yīng)，控制防御反應(yīng)處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶?/p>

目前，有關(guān)HDAC在植物生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能研究得不多，而且相關(guān)研究也主要集中在草本植物[26-28]。HD2基因的表達(dá)水平似乎與抗病性負(fù)相關(guān)。例如，水稻中HD2類型的組蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在水稻中的過量表達(dá)降低了組蛋白H4乙?；?，降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)和水稻白葉枯病(Xanthomonasoryzaepvoryzae)的抗性，而敲除OsHDT701則提高了植株對(duì)病原菌的抗性，提高了模式識(shí)別受體(PRR)所在位點(diǎn)組蛋白H4乙?；?，以及PRR基因和抗病相關(guān)基因的表達(dá)水平[29]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，小麥HD2類型的組蛋白去乙?；富騎aHDT701是小麥白粉病(Blumeriagraminisfsp. tritici)抗性的負(fù)調(diào)控因子。TaHDT701與WD40-重復(fù)蛋白TakeHOS15共同作用招募TaHDA6到抗病相關(guān)基因TaPR1、TaPR2、TaPR5和TaWRKY45的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而抑制這些基因的表達(dá)。敲除TaHDT701、TaHDA6和TakeHOS15基因提高了小麥對(duì)白粉病的抗性[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，PtHDT902基因在84K楊中的過量表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鏈格孢菌的抗病性，并降低其體內(nèi)病程相關(guān)基因和JA合成基因的表達(dá)。本研究也表明，HD2基因的表達(dá)水平和抗病性負(fù)相關(guān)。HD2在植物生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。