林良才，白茹，高瀅，慕濟(jì)鍺，盧君，李長(zhǎng)文，張翠英*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 2(貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)股份有限公司，貴州 仁懷，564501)

傳統(tǒng)白酒發(fā)酵是順其自然之道的開(kāi)放式發(fā)酵，是多菌種的協(xié)同生態(tài)發(fā)酵過(guò)程。發(fā)酵體系中菌群的組成和代謝活性不僅決定了基酒的產(chǎn)量，還與基酒的品質(zhì)息息相關(guān)。然而，獨(dú)特的開(kāi)放式發(fā)酵過(guò)程極易受到外界環(huán)境的影響，從而改變菌群結(jié)構(gòu)，尤其是打破核心功能菌群之間的平衡，進(jìn)而出現(xiàn)原料轉(zhuǎn)化率低、風(fēng)味生成不足、有害副產(chǎn)物伴生等問(wèn)題，如夏季較高的環(huán)境溫度極易造成乳酸、乙酸等有機(jī)酸的過(guò)度積累，導(dǎo)致糟醅酸度過(guò)高(pH<4)，體系中功能酵母菌群的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，迫使企業(yè)“壓排”，甚至停產(chǎn)。特別是在醬香型白酒釀造過(guò)程中，因其多輪次的特殊工藝，夏季發(fā)酵的輪次糟醅酸度過(guò)高的問(wèn)題尤為突出，嚴(yán)重影響出酒率和產(chǎn)品風(fēng)味。如何提高釀造微生態(tài)中功能菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和抗干擾性已成為企業(yè)穩(wěn)定、高效、安全生產(chǎn)亟需解決的行業(yè)共性技術(shù)問(wèn)題。

酵母是白酒釀造過(guò)程中的核心功能微生物，是最為重要的乙醇生產(chǎn)菌株，也與風(fēng)味物質(zhì)的合成密切聯(lián)系，其抗逆性能和發(fā)酵性能不僅直接影響整個(gè)釀造微生態(tài)中菌群的演替變化，還與基酒產(chǎn)量和品質(zhì)息息相關(guān)。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)被廣泛地視為白酒釀造過(guò)程中的主要發(fā)酵動(dòng)力，是基酒中乙醇的主要來(lái)源，而發(fā)酵體系中非釀酒酵母因產(chǎn)醇能力相對(duì)較弱，往往被認(rèn)為與風(fēng)味物質(zhì)的合成密切相關(guān)，如異常威克漢酵母屬和念珠酵母屬在醬香白酒第5輪次發(fā)酵過(guò)程中與乙酯含量呈正相關(guān)[1]，粟酒裂殖酵母與包括丁醇、戊酸在內(nèi)的136種風(fēng)味物質(zhì)的合成相關(guān)[2]，畢赤酵母屬和念珠酵母屬在小曲清香白酒釀造過(guò)程中參與高級(jí)醇的合成[3]。然而，隨著對(duì)傳統(tǒng)白酒釀造體系科學(xué)認(rèn)識(shí)的逐步深入，非釀酒酵母的功能已不僅僅局限于生香方面的貢獻(xiàn)，它們是釀造核心功能微生物組中不可或缺的組成部分，尤其是這些非釀酒酵母對(duì)白酒發(fā)酵環(huán)境中的高溫、高酸、高滲等壓力脅迫具有較好的耐受性[4]，對(duì)于穩(wěn)定發(fā)酵體系中菌群的組成和代謝活性具有不可替代的重要作用。因此，高耐性核心功能酵母菌株是應(yīng)對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程酸壓力脅迫下發(fā)酵力不足、保持釀造微生態(tài)平衡的有效工具。

庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)又稱東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)，不僅具有較好的耐酸、耐高溫性能，而且在多重壓力脅迫下仍能保持優(yōu)良的發(fā)酵特性[5-6]，是重要的釀造核心功能微生物，是醬香、濃香、芝麻香、清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的主要功能酵母[2-3,7-8]，其代謝物苯乙醇可以顯著抑制發(fā)酵體系中其他真菌的生長(zhǎng)，對(duì)釀造微生態(tài)中菌群演替具有調(diào)控作用[9]。P.kudriavzevii還具有較強(qiáng)的尿素降解能力，可以較好地降低醬香型白酒發(fā)酵體系中氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)的前體物質(zhì)——尿素，從而降低EC含量，確保基酒的安全性[10]。此外，P.kudriavzevii可以降低發(fā)酵體系中乳酸的含量，調(diào)節(jié)釀造微環(huán)境的酸度，從而促進(jìn)釀酒酵母的生長(zhǎng)[11]。盡管P.kudriavzevii在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮極為重要的作用，但將其人工應(yīng)用于白酒發(fā)酵過(guò)程的研究卻鮮有報(bào)道。因此，篩選具有良好耐受性能及發(fā)酵性能的庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母，并開(kāi)發(fā)基于強(qiáng)化菌劑的發(fā)酵調(diào)控技術(shù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)白酒釀造可控、高效、穩(wěn)定生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用溫度、酸度雙重脅迫策略從醬香型白酒酒醅中特異性篩選、分離庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母11株，對(duì)其耐高溫、耐酸、耐乙醇性能進(jìn)行檢測(cè)，并利用模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵性能及風(fēng)味物質(zhì)的生成進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，最終確定以XDNZ_PK05菌株進(jìn)行原位發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其應(yīng)用于醬香型白酒釀造過(guò)程中的作用，為傳統(tǒng)白酒人工可控發(fā)酵調(diào)控技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了新依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米，市售；酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖(分析純)、NaCl，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；瓊脂粉、瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司；乳酸、乙酸、乙醇，阿拉丁生化科技有限公司；dNTP、LATaqDNA聚合酶，日本TaKaRa公司；WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，pH自然，115 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基額外添加20 g/L瓊脂粉。

玉米水解液：稱取玉米醪1 kg，向其中加入3 L 60～70 ℃的自來(lái)水，靜置20 min，進(jìn)行玉米醪的糊化，使玉米醪充分膨脹，然后加入600 μL的液化酶(α-淀粉酶2×104U/mL)，于85～90 ℃液化1.5 h，期間可進(jìn)行攪拌以提高液化效率，液化結(jié)束后，迅速冷卻降溫至60 ℃，加入2 mL糖化酶(1×105U/mL)糖化20 h，期間攪拌。待糖化結(jié)束后，將糖化液用3層濾布過(guò)濾，得到滲出液即為玉米水解液，在105 ℃下高壓滅菌20 min，室溫保存使用。

一級(jí)種子培養(yǎng)基：將玉米水解液的糖度調(diào)整到8°Brix，加入0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的酵母浸粉，按需求分裝滅菌備用。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：將玉米水解液的糖度調(diào)整到12°Brix，加入0.5%的酵母浸粉，按需求分裝滅菌備用。

營(yíng)養(yǎng)鹽：分別稱取15 g MgSO4，7.5 g KH2PO4，8.1 g尿素，依次加入燒杯中，加入80 mL蒸餾水，充分溶解，定容至100 mL。

濃醪發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取60 g玉米醪置于250 mL三角瓶，加入135 mL 60～70 ℃熱水并攪拌均勻，放置20 min。向其中加入30 μL的液化酶(α-淀粉酶2×104U/mL)并攪拌均勻，90 ℃水浴90 min，液化。迅速冷卻至60 ℃，加入90 μL糖化酶(1×105U/mL)并攪拌均勻，60 ℃水浴20 min，糖化。迅速冷卻至40 ℃，加入1.2 mL酸性蛋白酶(2×104U/mL)并攪拌均勻，40 ℃水浴20 min。迅速冷卻至30 ℃，加入1 mL營(yíng)養(yǎng)鹽溶液，即為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；7890A氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；YXQ-LS-30SH高壓蒸汽滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械廠；全自動(dòng)凝膠成像儀，美國(guó)SYNGENE公司；PCT-200型PCR基因擴(kuò)增儀，德國(guó)Eppendorf公司；PowerPacTM型電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；小型蒸酒設(shè)備，河南永康機(jī)械制造有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 高耐受性酵母的篩選

將10 g醬香型白酒酒醅和90 mL無(wú)菌生理鹽水置于250 mL無(wú)菌三角瓶中充分混合，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩1 h，吸取1 mL菌懸液至YPD培養(yǎng)基中，35 ℃靜止培養(yǎng)48 h，稀釋涂布于含有40 g/L乳酸的YPD平板上，35 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落進(jìn)行純化，并保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 高耐受性酵母菌株的鑒定

(1)形態(tài)觀察

將純化后的菌株劃線接種至WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后觀察并記錄菌落形態(tài)，同時(shí)在顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。

(2)生理生化測(cè)定

參照楊舒雯等[12]的方法，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)(主要測(cè)定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉)、碳源同化試驗(yàn)(主要測(cè)定果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖)、氮源同化實(shí)驗(yàn)[主要測(cè)定KNO3、(NH4)2SO4、尿素]

(3)菌株分子生物學(xué)鑒定

利用真菌26S rDNA基因通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)、NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系(20 μL)：LATaq聚合酶0.125 μL，10×LA PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix 1 μL，模板1 μL，引物NL1 1 μL，引物NL4 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證，純化回收后由天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

將所獲得的PCR序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲取同源性較高的物種26S rDNA序列，利用MEGA 7.0中Neighbor-joining方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.3 菌株耐性能評(píng)估

本實(shí)驗(yàn)采用點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)菌株的耐受性，將測(cè)試菌株挑取至3 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12～16 h，將菌液OD600調(diào)整至0.5，吸取2 μL菌液分別滴加至含有不同質(zhì)量濃度乳酸(50、60、70 g/L)、乙酸(3、4、5、6 g/L)或乙醇(90、100、110 g/L)的YPD平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d，每隔12 h觀察菌株生長(zhǎng)情況。類似的，利用點(diǎn)板法檢測(cè)菌株的耐高溫特性(37、42、45 ℃)。

1.4.4 發(fā)酵性能檢測(cè)

從平板挑取單菌落接種于含有5 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基的試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；將上述菌液全部接種至裝有54 mL二級(jí)種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，30 ℃靜置培養(yǎng)16 h；以10%(體積分?jǐn)?shù))接種量將二級(jí)種子發(fā)酵液接種至玉米濃醪發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，通過(guò)CO2排放量來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)程，每隔12 h稱重1次，當(dāng)12 h失重≤0.1 g時(shí)，表明發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。

1.4.5 原位發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

從平板挑取單菌落接種于200 mL YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，將酵母菌劑以106CFU/g的接種量加入50 kg六輪次攤涼拌曲后的酒醅中，混合后將其平均裝入5個(gè)純棉紗布袋中，放置在不同位置，待堆積發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行理化檢測(cè)，然后將樣品進(jìn)行翻拌，模擬移堆操作，然后再分裝至紗布袋中，在窖池原位環(huán)境中繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，取酒醅進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.6 乙醇及風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

濃醪發(fā)酵代謝物檢測(cè)：發(fā)酵結(jié)束后，取100 mL濃醪發(fā)酵液與100 mL蒸餾水混合均勻，蒸餾并收集100 mL餾出液，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾，分別利用液相法和氣相法測(cè)定乙醇含量和風(fēng)味物質(zhì)含量。

原位發(fā)酵酒醅代謝物檢測(cè)：取50 g酒醅與200 mL蒸餾水混合均勻，蒸餾并收集100 mL餾出液，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾，分別利用液相法和氣相法測(cè)定乙醇含量和風(fēng)味物質(zhì)含量。

液相檢測(cè)條件：色譜柱為GH0830078H(300 mm×7.8 mm)；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器(refractive index detector, RID)；流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4溶液，流速0.6 mL/min；檢測(cè)器溫度45 ℃，柱溫65 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

氣相檢測(cè)條件：火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector, FID)，毛細(xì)管色譜柱HP-INNOWAX(50 m×320 μm×1.0 μm)，載氣為純度99.99%的高純N2，分流比1∶10。進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度200 ℃，進(jìn)樣量1 μL。采用程序升溫，50 ℃保持8 min，升溫速率5 ℃/min，升溫至180 ℃，保持15 min，每個(gè)樣品處理時(shí)間43 min。

1.4.7 殘淀粉的測(cè)定

采用斐林試劑法[13]測(cè)定樣品中的殘余淀粉含量。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用軟件GraphPad Prism 8.0.1繪制圖表，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，其中差異顯著性通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行，置信度為95%(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高耐性菌株的分離篩選

庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵中重要的參與者，是酒類釀造過(guò)程中重要的功能酵母[14]，為了篩選獲得高耐性的菌株，以醬香型白酒酒醅出發(fā)，根據(jù)庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母的耐受特性，采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法在35 ℃和40 g/L乳酸的雙壓力脅迫下特異性分離、篩選獲得11株酵母菌株。

a-在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征;b-顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征(10×100)圖1 菌株XDNZ_PK05的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of strain XDNZ_PK05

對(duì)11株菌進(jìn)行形態(tài)鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)所有菌落形態(tài)一致，在此僅展示XDNZ_PK05的結(jié)果，如圖1所示。在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基觀察其形態(tài)特征，菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，表面粗糙，凸起，表面及邊緣呈菌絲狀，四周平整；顯微鏡下觀察，大多為長(zhǎng)橢圓形的單細(xì)胞，生殖方式為出芽繁殖，是典型的酵母特征。

生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，11株菌的結(jié)果是一致的，可發(fā)酵的糖類為葡萄糖和蔗糖，不可發(fā)酵的糖類為蔗糖和淀粉；碳源同化試驗(yàn)顯示菌株可以利用果糖和半乳糖，不能利用木糖和阿拉伯糖；氮源同化試驗(yàn)顯示菌株均不能利用尿素、(NH4)2SO4、KNO3。

表1 菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of strains

26S rDNA序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示，XDNZ_PK01和XDNZ_PK02與其余9株菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這暗示著這2株菌的生長(zhǎng)或是發(fā)酵性能與其他菌株可能存在較大的差別。值得注意的是，菌株XDNZ_PK05與P.kudriavzeviiY1-9聚于一支，而P.kudriavzeviiY1-9與前期從貴州茅臺(tái)酒醅中篩選獲得的高耐乳酸酵母菌株P(guān).kudriavzeviiMT-Y01具有較高的親緣關(guān)系，這意味著菌株XDNZ_PK05可能具有與MT-Y01類似的發(fā)酵特性。

圖2 11株酵母菌株基于26S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 11 yeast strains based on 26S rDNA gene sequences

綜合菌落形態(tài)、生理生化試驗(yàn)以及26S rDNA序列比對(duì)，確定這11個(gè)菌株均為庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母，分別命名為XDNZ_PK01～XDNZ_PK11。

2.2 菌株的耐受性評(píng)價(jià)

溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝具有重要的影響。白酒釀造外界環(huán)境溫度和微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的生物熱是影響發(fā)酵體系溫度最主要的2個(gè)因素，尤其是生物熱更是推動(dòng)微生物群系演替的推動(dòng)力[15]，而酵母的生長(zhǎng)代謝是生物熱的主要來(lái)源之一。如果釀造體系中酵母耐熱性能較差，隨著發(fā)酵體系溫度的升高，酵母生長(zhǎng)代謝將受到顯著抑制，使得生物熱無(wú)法得到繼續(xù)積累，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵進(jìn)程。以醬香型白酒堆積發(fā)酵階段為例，堆子頂溫>50 ℃才能達(dá)到工藝要求。由此可見(jiàn)，耐高溫是白酒功能酵母的重要屬性。菌株XDNZ_PK01～XDNZ_PK11在42 ℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好，其中XDNZ_PK04和XDNZ_PK05可以在45 ℃生長(zhǎng)(圖3)，這也與目前報(bào)道的庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母可耐受的最高溫度一致[16]。

圖3 45 ℃高溫脅迫條件下菌株生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of strains under high temperature stress at 45 ℃

酸和醇是白酒釀造體系中微生態(tài)調(diào)控風(fēng)向標(biāo)，發(fā)酵初期酸度的提高有利于控制雜菌的過(guò)度繁殖，中后期的醇濃度提高有助于抑制產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)，2個(gè)因素共同控制，從而確保產(chǎn)品的“量”和“質(zhì)”。因此，發(fā)酵體系中的功能酵母應(yīng)具有較好的耐酸、耐乙醇特性，從而確保發(fā)酵體系內(nèi)菌群的平衡。

在白酒釀造過(guò)程中，乙酸和乳酸是發(fā)酵體系中酸度的主要貢獻(xiàn)者[17]，因此考察了篩選獲得菌株在不同乳酸、乙酸濃度下的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果如圖4-a所示，XDNZ_PK01～XDNZ_PK11均可在5 g/L乙酸條件下正常生長(zhǎng)。而對(duì)于乳酸壓力脅迫而言，這些菌株表現(xiàn)出了不同的耐受能力，XDNZ_PK03～XDNZ_PK11都可以在70 g/L乳酸條件下生長(zhǎng)，其中XDNZ_PK03、XDNZ_PK06、XDNZ_PK08以及XDNZ_PK11對(duì)乳酸的耐受能力顯著高于其他菌株(圖4-b)。

酵母是發(fā)酵體系中乙醇最主要的生產(chǎn)菌株，然而隨著體系中乙醇的不斷積累，高濃度乙醇會(huì)對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制，從而影響基酒產(chǎn)量。因此，高乙醇耐受性是白酒功能酵母所必備的性能。將11株菌株分別置于含有14%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d。如圖4-c所示，除菌株XDNZ_PK08和XDNZ_PK11之外，其他菌株均可以正常生長(zhǎng)。由此可知，這些菌株通過(guò)在釀造環(huán)境中長(zhǎng)期的馴化，已進(jìn)化獲得了更好的乙醇耐受特性。

a-5 g/L乙酸;b-70 g/L乳酸;c-14%乙醇圖4 菌株在不同脅迫條件下生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of strains under different stresses

2.3 菌株發(fā)酵性能和代謝特征評(píng)價(jià)

除了耐受性質(zhì)之外，酵母菌株的代謝特性也是影響基酒質(zhì)量的重要因素。利用玉米濃醪模擬白酒發(fā)酵，對(duì)這11株菌的發(fā)酵性能和風(fēng)味物質(zhì)的合成情況進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并以實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母AY12作為對(duì)照菌株。工業(yè)釀酒酵母AY12具有優(yōu)良的發(fā)酵及產(chǎn)酒性能[18]。如圖5所示，菌株XDNZ_PK01～XDNZ_PK11的發(fā)酵速度顯著低于釀酒酵母AY12，除了菌株XDNZ_PK09之外，其他菌株的乙醇產(chǎn)量也顯著低于AY12，且發(fā)酵失重與乙醇產(chǎn)量之間呈現(xiàn)很好的相關(guān)性。

a-失重變化;b-乙醇產(chǎn)量;c-失重與乙醇產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)分析圖5 菌株在玉米濃醪發(fā)酵條件下代謝特性分析Fig.5 Analysis of metabolic characteristics of strains under corn concentrated mash fermentation注：圖b顯著性分析均是以AY12為對(duì)照進(jìn)行分析：ns代表無(wú)顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1(下同)

同時(shí)，利用氣相色譜法對(duì)這些菌株發(fā)酵所產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母作為生香酵母可以顯著提高乙酸乙酯的含量，是釀酒酵母AY12乙酸乙酯產(chǎn)量的3.51～31.01倍，其中XDNZ_PK02的乙酸乙酯產(chǎn)量最高，達(dá)到了(796.92±1.84) mg/L。值得關(guān)注的是，菌株XDNZ_PK03和XDNZ_PK06的乳酸乙酯產(chǎn)量分別為(36.2±0.51)和(34.6±1.15) mg/L，顯著高于釀酒酵母AY12和其他庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母的乳酸乙酯產(chǎn)量。此外，菌株XDNZ_PK01～XDNZ_PK11的高級(jí)醇產(chǎn)量顯著降低，僅為釀酒酵母AY12的45.43%～75.92%。由此推測(cè)，將庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母作為強(qiáng)化菌劑應(yīng)用于傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過(guò)程可以起到提酯降高級(jí)醇的效果。

根據(jù)菌株耐受性、發(fā)酵能力和風(fēng)味化合物合成能力分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株XDNZ_PK03和XDNZ_PK06雖然具有較好的耐高溫和耐酸性能，但其乙醇產(chǎn)量過(guò)低，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。而菌株XDNZ_PK09的乙醇產(chǎn)量達(dá)到(139.7±0.98) g/L，顯著高于其他菌株，且與釀酒酵母AY12產(chǎn)醇能力相當(dāng)，但其延滯期較長(zhǎng)，因此也不符合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的要求。進(jìn)一步分析顯示，與釀酒酵母AY12相比，菌株XDNZ_PK02、XDNZ_PK05合成的總酯分別提升了27.21倍和20.40倍，總高級(jí)醇分別降低了31.65%和36.37%。此外，XDNZ_PK05菌株可以在45 ℃條件下生長(zhǎng)，耐熱性能優(yōu)于XDNZ_PK02。

表2 不同菌株在玉米濃醪發(fā)酵條件下風(fēng)味化合物的產(chǎn)量 單位：mg/L

2.4 強(qiáng)化菌劑原位發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上菌株耐受性能分析和玉米濃醪模擬發(fā)酵的結(jié)果，選擇菌株XDNZ_PK05作為強(qiáng)化菌株進(jìn)行原位生產(chǎn)發(fā)酵驗(yàn)證。菌株XDNZ_PK05培養(yǎng)液按照106CFU/g的接種量應(yīng)用于第7輪次發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，堆積階段和窖池階段原位發(fā)酵的位置如圖6所示。

a-堆積階段;b-窖池階段圖6 原位堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵樣品位置示意圖Fig.6 Location diagram of samples during the in-situ stacking fermentation and pit fermentation

由表3可知，添加了XDNZ_PK05可以顯著提高原料的利用，堆積末殘淀粉從對(duì)照組的(14.4±0.18)%降低到了(12.10±0.04)%，利用率提高了15.97%，出窖時(shí)殘淀粉從(12.10±0.04)%降低到了(9.59±0.05)%，淀粉利用率提高了20.74%。盡管菌劑強(qiáng)化組的堆積發(fā)酵階段淀粉消耗增多，但酒醅中乙醇含量并未發(fā)生顯著變化，強(qiáng)化組窖池發(fā)酵結(jié)束后酒醅中的乙醇含量顯著提高了15.26%，從對(duì)照組的(6.42±0.17) g/L提升到了(7.40±0.10) g/L，這與基酒中乙醇產(chǎn)量提高的比率相似。對(duì)照組基酒中乙醇含量為(293.71±13.37) g/L，強(qiáng)化組基酒乙醇含量為(332.46±11.73) g/L，提高了13.19%。

表3 酒醅中淀粉和乙醇含量Table 3 The starch and ethanol contents in Jiupei

這些結(jié)果證實(shí)了耐酸菌劑的使用可以顯著提升高酸脅迫條件下原料利用率，解決發(fā)酵力不足、產(chǎn)能下降的實(shí)際生產(chǎn)問(wèn)題。盡管目前鮮有關(guān)于利用庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母作為強(qiáng)化菌劑進(jìn)行人工發(fā)酵調(diào)節(jié)的相關(guān)研究，但已有報(bào)道耐酸非釀酒酵母用于應(yīng)對(duì)異常天氣導(dǎo)致的糟醅酸度過(guò)高的問(wèn)題，如貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)有限公司利用耐酸粟酒裂殖酵母作為強(qiáng)化菌劑，并開(kāi)發(fā)與之適配的調(diào)控技術(shù)，可以顯著提高基酒產(chǎn)量13.47%～25.97%[19]。由此可以推斷，高耐非釀酒酵母的篩選及相應(yīng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，是解決發(fā)酵力不足、高酸掉排這些實(shí)際生產(chǎn)問(wèn)題的有效策略。

風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果如表4所示，對(duì)照組基酒中正丙醇含量為(1 334.29±80.17) mg/L，而強(qiáng)化組中含量?jī)H為(620.75±50.56) mg/L，顯著降低了53.48%，這意味庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母的應(yīng)用可以有效降低基酒中高級(jí)醇的含量，有利于改善飲后舒適度，提升產(chǎn)品質(zhì)量。

與之相類似的，在小曲清香型白酒釀造過(guò)程中，釀酒酵母是高級(jí)醇的主要生產(chǎn)菌株，而畢赤酵母對(duì)降低高級(jí)醇有著積極貢獻(xiàn)[20]。在白云邊酒釀造過(guò)程中庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母的應(yīng)用可以降低正丙醇含量27.4%[21]。然而，在葡萄酒釀造過(guò)程中，采用釀酒酵母和庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母順序發(fā)酵工藝顯著提升高級(jí)醇產(chǎn)量20%左右[22]。由此可見(jiàn)，庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母對(duì)高級(jí)醇的調(diào)控與發(fā)酵工藝息息相關(guān)。

此外，先前的玉米濃醪模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母可以顯著提高發(fā)酵體系中乙酸乙酯的產(chǎn)量(表2)。然而，強(qiáng)化組基酒中酯含量并沒(méi)有顯著變化。除此之外，其他風(fēng)味指標(biāo)無(wú)顯著性變化，不會(huì)對(duì)基酒品質(zhì)造成不良影響。

表4 酒樣中風(fēng)味物質(zhì)含量 單位：mg/L

3 結(jié)論

傳統(tǒng)白酒開(kāi)放式的發(fā)酵方式在賦予酒體獨(dú)特風(fēng)味的同時(shí)也給生產(chǎn)的穩(wěn)定性和安全性帶來(lái)了潛在的隱患。釀造環(huán)境的異常波動(dòng)會(huì)給釀造體系功能微生物帶來(lái)額外的脅迫壓力，從而導(dǎo)致菌群失調(diào)，造成“減產(chǎn)降質(zhì)”的問(wèn)題。本研究以開(kāi)發(fā)耐酸脅迫人工可控發(fā)酵技術(shù)為目標(biāo)，從醬香型白酒酒醅中篩選獲得了具有不同代謝特征和耐受能力的庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母11株，優(yōu)選出XDNZ_PK05菌株作為強(qiáng)化菌劑，進(jìn)行了原位發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示高耐性酵母XDNZ_PK05的使用可以克服高酸壓力，提高糧食利用率，提升乙醇產(chǎn)量13.19%，有效降低高級(jí)醇含量50%以上，且不改變其他風(fēng)味指標(biāo)。本研究篩選獲得的高耐性酵母和形成的發(fā)酵調(diào)控技術(shù)為醬香型白酒可控發(fā)酵調(diào)控技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了良好的素材，也為創(chuàng)建基于合成功能微生物組的現(xiàn)代釀造調(diào)控技術(shù)提供了重要的理論支撐，對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)釀造行業(yè)的技術(shù)升級(jí)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。