孫 彬，陶佳麗

（山西工程技術(shù)學(xué)院，山西 陽泉 045000）

引言

鳥糞石[Mg（NH4）PO4·6H2O]是一種常見的磷酸鹽礦物，屬于斜方晶系，存在于天然的鳥糞中。鳥糞石是一種富含氮、磷元素的天然肥料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。隨著天然鳥糞石的大量開采，現(xiàn)存的天然鳥糞石儲量急劇下降；而現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對氮、磷肥料的需求與日俱增[1-2]。因此，實現(xiàn)鳥糞石的工業(yè)化生產(chǎn)十分必要。與常見的化學(xué)合成法相比，利用生物礦化得到鳥糞石晶體的方法，兼具經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，逐漸引起了研究人員的重視。

河床底部存在大量污泥，厭氧區(qū)范圍大且富含有機(jī)質(zhì)，生存著大量的硫酸鹽還原菌[3]，目前關(guān)于河床底部沉積物中的厭氧菌誘導(dǎo)鳥糞石礦物的研究較少。本文對河床底部污泥中的一株硫酸鹽還原菌進(jìn)行分離、鑒定，利用其成功誘導(dǎo)得到鳥糞石，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和研究價值。

1 實驗方法

1.1 菌種來源

本實驗所用樣品取自河流底部的污泥。污泥中有強(qiáng)烈的H2S 氣體的氣味，表明污泥中含有豐富的硫酸鹽還原菌。取深處污泥作為樣品。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基

每1 L 富集培養(yǎng)基溶液所含成分如下：K2HPO40.5 g，NH4Cl 1 g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母浸粉1g，60%的乳酸鈉溶液6 mL，Na2SO40.5 g，F(xiàn)e（NH4）2-（SO4）20.5 g，抗壞血酸0.5 g，L-Cys 半胱氨酸0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH=6～8，121 ℃滅菌20 min。

Fe（NH4）2（SO4）2和抗壞血酸在高溫環(huán)境性質(zhì)會發(fā)生改變，所以先將其配制成溶液，0.22 μm 濾膜除菌。Fe（NH4）2（SO4）2中的Fe2+能與溶液中的S2-反應(yīng)生成黑色的FeS，可作為硫酸鹽還原菌富集成功的標(biāo)志[4]。

1.2.2 純化培養(yǎng)基

液體純化培養(yǎng)基所含成分如下：酵母浸粉3 g，KCl 0.25 g，蒸餾水1000 mL。將其添加2%的瓊脂即為固體純化培養(yǎng)基。

1.3 菌株的富集與純化

在200 mL 富集培養(yǎng)基中加入20 g 污泥樣品進(jìn)行培養(yǎng)，并用液體石蠟封閉瓶內(nèi)液面，創(chuàng)造相對厭氧的環(huán)境。置于30 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基的顏色變成黑色時，表明此時培養(yǎng)基中存在大量的硫酸鹽還原菌（圖1）[5]。

圖1 菌株富集培養(yǎng)

經(jīng)過富集后的細(xì)菌培養(yǎng)液中存在多種細(xì)菌，需要固體培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落篩選，挑選單個菌落接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，反復(fù)進(jìn)行多次，使菌種得到分離和純化。將純化后得到的單一菌株進(jìn)行16S rDNA 分析鑒定。用透射電子顯微鏡觀察菌株的形態(tài)學(xué)特征，并對菌株進(jìn)行革蘭氏、芽孢、接觸酶、甲基紅、V-P、硫化氫、運(yùn)動性、三糖鐵、脂酶、脲酶、蛋白酶、纖維素酶、明膠酶耐鹽性等生理生化測試。

1.4 誘導(dǎo)礦化研究

誘導(dǎo)礦化所用培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基成分變量為Mg、Ca。設(shè)置n（Mg）/n（Ca）比梯度0、2、4、6（表1）。設(shè)置實驗組和對照組。實驗組接菌量為1%，對照組中以等量蒸餾水替代菌量，30℃靜置培養(yǎng)。

表1 誘導(dǎo)礦化梯度濃度Mg/Ca 比含量

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rDNA 分析

得到了長度為1 438 bp 的16S rDNA 序列，使用NCBI 在線blast 對該菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株與腸桿菌屬和非脫羧勒克菌屬的同源性均在97%以上。通過基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示該菌株與Leclercia adecarboxylata 親緣關(guān)系最近（圖2），因此可以確認(rèn)該菌株為非脫羧勒克菌（Leclercia adecarboxylata）。

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌體形貌特征

通過高分辨率投射電鏡觀察，菌株的基本特征為：菌體為短桿狀，長約1 000 nm，寬約500 nm，生殖方式為二分裂（見圖3）。

圖3 菌株單細(xì)胞形態(tài)及生殖分裂方式透射電鏡圖

2.3 菌株的生理生化鑒定

如表2 所示，結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏陰性桿菌，不形成芽孢，有動力，不耐鹽。接觸酶，淀粉酶為陽性；MR 為弱陽性；脂酶，脲酶，蛋白酶，纖維素酶均為陰性；可利用乳糖發(fā)酵；不能利用含硫氨基酸產(chǎn)硫化氫，但可利用含硫化合物。

表2 該菌株與同種非脫羧勒克菌的鑒別結(jié)果比較

2.4 誘導(dǎo)礦化結(jié)果

誘導(dǎo)礦化18 d 后，在顯微鏡下觀察實驗組的沉淀。從圖4-1、4-2 可知，Mg/Ca 比為0 和2 的情況下，沒有礦物形成；從圖4-3、圖4-4 可知，n（Mg）/n（Ca）比為4 和6 的情況下，有規(guī)則礦物形成。對照組中沒有礦物沉淀。這些結(jié)果說明細(xì)菌對礦物的沉淀有促進(jìn)作用，同時n（Mg）/n（Ca）比同樣對礦物的形成有重要影響。

圖4 實驗組礦物的顯微鏡圖像（a、b、c、d 分別為n（Mg）/n（Ca）比0、2、4、6 的培養(yǎng)基礦物）

XRD 結(jié)果（第18 頁圖5）可以看出，n（Mg）/n（Ca）比為0 和2 的實驗組均未形成晶形礦物，而n（Mg）/n（Ca）比為4 和6 的實驗組均出現(xiàn)明顯特征峰。通過晶體比對，n（Mg）/n（Ca）比為4 和6 的實驗組所形成的礦物均為鳥糞石。與鳥糞石標(biāo)準(zhǔn)PDF 卡片（晶格參數(shù)為a=6.945，b=11.208，c=6.135）的峰強(qiáng)和峰位相比較，峰強(qiáng)十分相近，半峰寬略大，而且本實驗所得鳥糞石晶體XRD 衍射峰位相對標(biāo)準(zhǔn)峰位左移，也就是說，生物誘導(dǎo)的鳥糞石與自然形成的鳥糞石相比，原子排列結(jié)構(gòu)相同，但結(jié)晶程度略低，晶胞尺寸較大，晶形發(fā)生畸變。這表明細(xì)菌對晶核形成及晶體生長過程具有一定的影響。

圖5 菌株誘導(dǎo)礦物的XRD 譜圖

3 結(jié)論

生物礦化合成鳥糞石是一種兼具經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益的方法。從河床底部沉積物中篩選得到一株硫酸鹽還原菌，該菌株經(jīng)分子生物學(xué)與生理生化鑒定為脫羧勒克菌。利用該細(xì)菌成功誘導(dǎo)得到鳥糞石晶體，為鳥糞石的工業(yè)化生產(chǎn)提供一種有效方案。