鄭慧敏，李連興

（赤峰市醫(yī)院，內蒙古 赤峰 024000）

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，中國胃癌發(fā)病例數(shù)占全球胃癌發(fā)病的42.6%、死亡例數(shù)占全球死亡的45%，位于全球發(fā)病率的第5位，死亡率的第6位[1]。目前，惡性腫瘤的靶向治療被認為是未來惡性腫瘤治療中最具前景的方向，然而靶向治療的前提和關鍵是有合適的靶點[2]。因此，對胃癌細胞侵襲、轉移和血管形成機制的研究可以為尋找到預防和治療胃癌的靶點提供理論基礎，對降低胃癌患者死亡率、延長患者壽命都具有十分重要的意義。

高半胱氨酸蛋白61(cysteine rich 61，Cyr61)是生長因子CCN家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員。越來越多的證據(jù)表明腫瘤組織中Cyr61表現(xiàn)出不同程度的異常。一方面是過度表達，研究發(fā)現(xiàn)Cyr61在胃癌、乳腺癌、膠質瘤、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中呈高表達[3,4]。有趣的是在非小細胞肺癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、前列腺癌中Cyr61呈低表達狀態(tài)[5,6]。因此，本研究繼續(xù)探究Cyr61對胃癌細胞生物學行為的影響及分子機制，為Cyr61能否真正成為預防和治療胃癌的新靶點提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑細胞MGC80-3細胞系獲自中科院。RPMI-1640，DMEM培 養(yǎng) 液 購 自Corning公 司。RIPA蛋白裂解液購自碧云天公司。蛋白Marker和ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自Thermo公司。Transwell小室購自Corning公司，MTT檢測試劑盒購自上海鼎國生物技術有限公司，pEGFP-H1/Cyr61病毒購于吉凱基因公司。針對蛋白質的抗體：Cyr61兔抗體（Abcam，美國，編號ab233097，按1:1000稀釋）、GAPDH小鼠抗體（Santa cruz，美國，sc-32233，按1:2000稀釋）。凋亡試劑盒購自eBioscience公 司。DPBS，Matrigel購自Corning公 司。Calcein-AM購自Thermo公司。

1.2構建表達沉默Cyr61的短發(fā)夾RNA（shorthairpin RNA,shRNA）的真核質粒表達載體pEGFP-H1/Cyr61設計RNAi沉默Cyr61表達在Cyr61 mRNA序列上的靶位點，選擇3-5個靶位點；根據(jù)每個靶位點人工合成一對互補并編碼短發(fā)夾狀小干擾RNA（small interference RNA,siRNA）的寡核苷酸鏈，將正、反義寡核苷酸鏈等比混合，退火形成DNA雙鏈，保存在-20℃?zhèn)溆?。同時合成陰性對照；將DNA雙鏈克隆入能表達綠色熒光蛋白、抗性（新霉素）和人H1型RNA聚合酶Ⅲ啟動子的真核質粒表達載體，經酶切鑒定正確后，命名為pEGFP-H1/Cyr61。

1.3細胞培養(yǎng)及轉染使用RPMI-1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100IU/mL青霉素，并在37°C及5% CO2濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。為了構建Cyr61敲減的MGC80-3細胞系，利用陽離子脂質體轉染pEGFP-H1/Cyr61重組質粒進入MGC80-3細胞中。

1.4蛋 白 印 跡 （Western blot） 收 集 轉 染 后MGC80-3細胞，用PBS緩沖液洗滌兩次，在預冷的2×Lysis Buffer裂解，將裂解后的細胞轉移入EP管，將細胞在冰上裂解10-15min后，應用超聲破碎細胞。離心細胞15分鐘（4℃、12000g），吸取上清液，應用BCA法測蛋白濃度。將所有樣本的蛋白濃度調整為2μg/μL，-80℃保存，備用。上樣，濃縮膠80V，20min；分離膠120V，1h。電泳后，利用轉移電泳裝置電轉2.5h（4℃、恒流300mA），再將蛋白轉移到PVDF膜上。室溫下用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）封閉1h。一抗孵育：加入封閉液將抗體稀釋，然后在室溫下與封閉好的PVDF膜孵育2h，用TBST緩沖液洗膜4次，每次8min。二抗孵育：將相應二抗用封閉液稀釋，孵育1.5h（室溫），用TBST緩沖液洗膜4次，每次8min。最后用X光顯影。

1.5 MTT實驗 將處于對數(shù)生長期的人胃癌細胞MGC80-3及轉染pEGFP-H1/Cyr61細胞組胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，并計數(shù)；均勻鋪板，細胞完全沉淀后，用顯微鏡觀察各實驗組及對照組的細胞密度；第二天培養(yǎng)終止前4h，在孔中加入20μL5mg/mL的MTT，無需更換溶液；4h后完全吸出培養(yǎng)液并加入100μL DMSO溶解甲基贊顆粒；振蕩2~5min后酶標儀490/570nm檢測OD值。

1.6細胞劃痕實驗 將處于對數(shù)生長期的對照組和轉染pEGFP-H1/Cyr61細胞組，經胰蛋白酶消化后重新懸浮于細胞懸浮液中并計數(shù)；根據(jù)細胞大小確定鋪板密度（50000cell/well），以第二日細胞數(shù)匯合度達到90%以上為準。37℃、5% CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為100μL/孔（每組3復孔）；第二天，用劃痕測試儀對準96孔板的中心，輕輕向上推，形成劃痕；使用PBS緩沖液輕輕漂洗2~3次，再加入含培養(yǎng)基（含1%FBS的血清）后掃板；37℃、5% CO2培養(yǎng)，選擇合適的時間，根據(jù)愈合程度用Celigo掃板；最后用Celigo分析0h、8h、24h遷移面積。

1.7 Transwell實驗 將Transwell小室放置在24孔板中，上室加入100μL無血清培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中1h；制備無血清細胞懸浮液（105/孔）；移除上室中的培養(yǎng)基，并加入100μL細胞懸液，下室中加入600μL 30% FBS培養(yǎng)基；37℃，培養(yǎng)8h；將小室倒扣于吸水紙上，去除培養(yǎng)基，用棉拭子去除小室內的非轉移細胞，放置小室在4%多聚甲醛固定液中0.5h；固定后取出小室，吸干小室表面的固定液，將1-2滴染色液滴到膜的下表面染色轉移細胞1-3min，再將小室浸泡沖洗后晾干。每個transwell小室均隨機選取視野進行顯微鏡拍照；應用200×的照片計數(shù)，統(tǒng)計分析并比較實驗組與對照組細胞轉移能力的差異：計算各組轉移細胞數(shù)。

1.8血管生成實驗 細胞感染后，鋪2×105個細胞于6孔板中，待貼壁后用DPBS洗滌2次，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后收集上清液。將Matrigel 4℃過夜融化，-20℃預冷實驗用的孔板及槍頭。Matrigel充分融化后，在預冷后的96孔板中每孔加入70μL Matrigel，凝固30min（37℃）備用。消化HMEC-1細胞，用無血清培養(yǎng)基洗2-3次，盡可能去除血清，加入預先收集的目的細胞培養(yǎng)上清液，將細胞重懸為3×104細胞/100μL，鋪入96孔板。37℃培養(yǎng)2-4h后，棄去舊液，每孔加入50μL Calcein-AM濃 度 為0.2μM的 培 養(yǎng) 基37℃孵 育5～10min。熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞已被染色后，置于CQ1儀中掃板，獲得圖片及數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 qPCR檢測MGC-803細胞中Cyr61的表達量

結果顯示，基因Cyr61在MGC-803細胞中的表達豐度為高。如圖1。

圖1 qPCR檢測MGC-803細胞中Cyr61的表達量

2.2慢病毒感染人胃癌細胞MGC80-3

人胃癌細胞MGC80-3分別感染對照病毒NC和敲減Cyr61病毒KD，可明顯觀察到熒光。如圖2。

圖2 對照病毒NC和敲減Cyr61病毒KD感染后熒光圖

2.3 qPCR檢測Cyr61的表達量

MGC-803細胞中，相對于NC，KD1組Cyr61基因的敲減效率為27.1%；KD2組CYR61基因的敲減效率為45.8%。如圖3。

圖3 qPCR檢測敲減Cyr61病毒后MGC-803細胞中Cyr61的表達量

2.4 Western blot檢測Cyr61蛋白的表達量

Western blot實驗檢測敲減Cyr61病毒KD1和KD2組條帶亮度顯著低于對照組NC。感染后細胞組Cyr61蛋白被顯著抑制。如圖4。

圖4 Western blot檢測敲減Cyr61后MGC-803細胞中Cyr61的表達量

2.5敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3增殖能力的影響

應用MTT實驗方法檢測敲減Cyr61對人胃癌細胞增殖能力的影響。結果顯示，相比對照組和敲減Cyr61組細胞的增殖能力無明顯變化，如圖5。

圖5 敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3增殖能力的影響

2.6敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3遷移能力的影響

劃痕實驗檢測敲減Cyr61基因后對人胃癌細胞遷移能力的影響。結果顯示，對照組遷移率為34.17%，敲減Cyr61細胞組遷移率為40.16%。P＞0.05,無統(tǒng)計學意義，即敲減Cyr61后對胃癌細胞遷移能力無影響。如圖6。

圖6 敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3遷移能力的影響

Transwell實驗檢測敲減Cyr61對人胃癌細胞遷移能力影響。結果顯示，對照組遷移細胞數(shù)為121個，敲減Cyr61細胞組遷移細胞數(shù)為109個。P＞0.05,無統(tǒng)計學意義，即沉默CYR61后對胃癌細胞遷移能力無影響。如圖7。

圖7 敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3遷移能力的影響

2.7敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3侵襲能力的影響

Transwell實驗檢測敲減Cyr61對人胃癌細胞侵襲能力影響。結果顯示，對照組侵襲細胞數(shù)為121個，敲減Cyr61細胞組侵襲細胞數(shù)為109個。P＞0.05,無統(tǒng)計學意義，即沉默CYR61后對胃癌細胞侵襲能力無影響。如圖8。

圖8 敲減Cyr61對人胃癌細胞MGC80-3侵襲能力的影響

2.8敲減Cyr61對人胃癌細胞凋亡的影響

相比對照組NC，敲減Cyr61的KD組凋亡數(shù)無明顯變化。P＜0.05，但是凋亡率小于5%，認為并沒有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。如圖9。

圖9 敲減Cyr61對人胃癌細胞凋亡的影響

2.9敲減Cyr61對人胃癌細胞周期的影響

相比對照組NC，敲減Cyr61的KD組處于G1期的細胞經過T-Test分析顯示P＜0.05，處于S期和G2/M期的細胞經過T-Test分析P＞0.05。如圖10。

圖10 敲減Cyr61對人胃癌細胞周期的影響

2.10敲減Cyr61對血管形成的影響

相對對照組NC，敲減Cyr61的KD組血管形成能力明顯增加。如圖11。

圖11 敲減Cyr61對血管生成的影響

3 討論

Cyr61是生長因子CCN家族中的成員。在包括胃癌在內的多種腫瘤中異常表達。已有研究表明，Cyr61促進胃癌，結腸癌[7]乳腺癌[8]等的進展。然而，也有報道稱，Cyr61可抑制非小細胞肺癌、子宮內膜癌等的進展[5]。在關于胃癌的報道中發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤胃黏膜樣品相比，胃癌樣品中Cyr61的表達顯著上調。Cyr61的高表達與侵襲、淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分化差、TNM分期晚期和5年生存率降低有關[9]，而本研究的結果顯示Cyr61不能促進胃癌細胞的增殖，遷移和侵襲，但也有實驗研究表明，Cyr61在胃癌細胞增殖中起微不足道的作用[10]，這與本研究結果相符。還有多項研究表明Cyr61可以促進胃癌細胞的侵襲轉移[11,12]，本研究結果未顯示出類似結果。可能是受不同胃癌細胞系的影響，也可能因為本身Cyr61在不同腫瘤中的表達量及對不同腫瘤的生物學功能的影響都存在差異。因此，其對胃癌進展的影響還需進一步研究。

深入研究機制發(fā)現(xiàn)可能與腫瘤細胞類型中Cyr61引起不同通路的改變，以及腫瘤細胞對Cyr61誘導的凋亡及衰老是否敏感、或對血管生成因子是否限制相關[13]。Cyr61可通過與細胞外基質中的整合素以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合，以及與細胞外基質中黏附的大量生長因子如血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子直接結合，對正常生理和病理過程中的細胞黏附、增殖、移動、分化和新生血管形成起重要作用[14]。本研究通過檢測Cyr61對胃癌細胞凋亡，細胞周期影響，也與其對胃癌生物學功能結果一致，均無影響。進一步探究對血管生成影響的結果顯示，敲減Cyr61后血管形成能力明顯增加。這似乎與現(xiàn)有報道不相符。其原因可能是Cyr61對腫瘤的影響受多種因素的控制，是不同通路相互作用的結果。所以，更多的功能及機制有待進一步研究。