朱富強，郭宇鵬，潘 軍，韓巖君，吳 濤

（1 濱州市檢驗檢測中心 山東濱州 256600 2 濱州學院生物與環(huán)境工程學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術研究中心 山東濱州 256600）

除草劑對于農產品的增產、 增收發(fā)揮著重要作用。 然而，不合理施用和濫用除草劑，易使其通過滲透或地表徑流進入河口和淺海生態(tài)系統(tǒng)，造成近岸海域除草劑殘留污染[1]。 近年來，我國近岸海域表層海水中屢次檢出除草劑殘留[2-3]，有研究表明，某些三嗪類及酰胺類除草劑在海水中相比于河水中更難降解[4-5]，貝類主要棲息于近岸海域及潮間帶，生長位置較為固定，極易富集農藥殘留等污染物[6-7]，最終通過食物鏈轉移至人體內，長期食用會對人類健康造成影響。 建立貝類中多種除草劑殘留的檢測方法，對于準確評估貝類的食用安全風險，保障人體健康具有重要意義。

目前，貝類中農藥殘留的檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）[8]、 氣相色譜法（GC）[9]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法（GC-MS）[10]及氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GC-MS/MS）[11]等，其中，LCMS/MS 具有靈敏度高，抗干擾能力強，重現(xiàn)性好，無需衍生等優(yōu)點。貝類中蛋白質和脂肪含量豐富，基質復雜，對其進行測定前需進行凈化處理。凝膠滲透色譜法（GPC）[12]、QuEChERS 法[13]、固相萃取法（SPE）[14]是常用的凈化方法。 GPC 法除脂效果好，而操作繁瑣復雜，不適用于大批量樣品檢測。QuEChERS 凈化法主要利用石墨化碳黑（GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18） 及N-丙基乙二胺（PSA）等對干擾組分實現(xiàn)高效快速凈化，然而，對于理化性質各異的多組分農藥，在凈化過程中可能會導致部分農藥損失，影響定量結果的準確性。傳統(tǒng)的SPE 處理方法操作復雜，影響結果穩(wěn)定性和檢驗效率，不能滿足高通量樣品快速檢測要求。

增強型脂質去除 （Enhanced matrix removal，EMR-Lipid）是一種新型的高聚物吸附劑，可通過疏水相互作用和體積排阻作用的結合高效吸附脂類等雜質。 增強型脂質去除（Captiva EMR-Lipid）固相萃取柱是在EMR-Lipid 基礎上升級而成，以固相萃取方式，可實現(xiàn)通過式一步凈化，與傳統(tǒng)的SPE 法相比，無需活化、淋洗、洗脫等操作，更為高效快速。對于脂類含量較高的樣品，增強型脂質去除固相萃取法具有良好的凈化效果[15-16]，而該法用于水產品中除草劑等農藥殘留檢測前處理的研究鮮見報道。 本文采用增強型脂質去除固相萃取法凈化樣品，結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，高效準確測定了貝類中42 種除草劑殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純），美國Tedia 公司；甲酸（純度＞99%），美國ACS 恩科化學；萃取鹽包（內含1.0 g 無水檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸二鈉鹽水合物、4.0 g 無水硫酸鎂、1.0 g 氯化鈉）、Captiva EMRLipid 固相萃取柱 （3 mL/300 mg）、EMR-Lipid 凈化管、EMR-Lipid Polish 萃取管，美國Agilent 公司；PSA、GCB，天津博納艾杰爾科技有限公司。

標準樣品：胺苯磺隆、環(huán)丙嘧磺隆質量濃度均為100 μg/mL，BePure 公司； 苯磺隆質量濃度為100 μg/mL，農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；其余39 種標準樣品質量濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

貝類樣品，本地批發(fā)市場及網購。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS 串聯(lián)質譜儀，美國沃特世公司；Shim-pack GIST C18-AQ 色譜柱 （100 mm × 2.1 mm，1.9 μm），島津（上海）實驗器材有限公司；3-18K5 離心機，德國SIGMA 公司；CP225D 電子分析天平，德國Sartorius 公司；Milli-Q Advantage A10 超純水儀，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 各準確移取42 種農藥標準溶液100 μL，置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合標準儲備液，質量濃度為1.00 μg/mL。 臨用前以空白基質提取液進行稀釋。

1.3.2 樣品前處理 提?。悍Q取均質樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入3 mL 純水，充分混合，渦旋振蕩1 min，加入10.0 mL 乙腈，充分混合，渦旋振蕩5 min，再加入萃取鹽包，充分混合，渦旋振蕩1 min 后，以6 000 r/min離心5 min 后取上清液，待凈化。

QuEChERS 凈化[17]：準確移取1 mL 上清液，置于裝有50 mg PSA 和20 mg GCB 的離心管中，渦旋振蕩1 min 后，以6 000 r/min 離心5 min，上清液經0.22 μm 尼龍針頭式過濾器過濾，待測。

EMR-Lipid 凈化： 準確移取5 mL 上清液，提取液至EMR-Lipid 凈化管中 （提前用5 mL 純水充分潤濕活化），渦旋振蕩2 min，于6 000 r/min 離心5 min，將上清液轉移至EMR-Polish 管中，劇烈振蕩1 min 進行鹽析后以6 000 r/min 離心5 min，上清液經0.22 μm 尼龍針頭式過濾器過濾，待測。

Captiva EMR-Lipid 凈化： 準確移取2.4 mL上清液與0.6 mL 純水混合，通過Captiva EMRLipid 固相萃取柱，重力作用下收集濾液，經0.22 μm 尼龍針頭式過濾器過濾，待測。

1.3.3 色譜條件 Shim-pack GIST C18-AQ 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A 相）、乙腈（B 相）。 流速：0.3 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣體積：2 μL。 梯度洗脫程序：0～1.5 min，10%B；1.5～15.0 min，10%B～95%B；15.0～17.5 min，95%B；17.5～18.0 min，95%B～10%B；18.0～20.0 min，10%B。

1.3.4 質譜條件 離子源： 電噴霧電離源（ESI）；檢測模式：多反應監(jiān)測（MRM）；掃描方式：正離子模式；毛細管電壓：2.00 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h； 脫溶劑氣溫度：500 ℃；碰撞氣流速：0.15 mL/min； 錐孔反吹氣流量：150 L/h；錐孔電壓：均為10 V。 42 種目標化合物的質譜分析參數(shù)及保留時間見表1。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 質譜條件的選擇 以流動注射方式，在電噴霧電離模式下，比較正負離子模式下的42 種目標物標準溶液（100 ng/L）質譜信號，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下的各目標物正離子信號普遍比負離子模式強，故選用正離子模式。 分別對質量濃度為100 μg/L 的各目標化合物單標準溶液進行一級質譜掃描，確定分子離子，然后以分子離子為母離子，進行二級質譜掃描，篩選碎片離子，選取響應值高、干擾少的2 個子離子作為特征子離子，其中以響應值高的子離子作為定量離子。 在多反應監(jiān)測模式下，確定最優(yōu)質譜參數(shù)，使各目標化合物質譜響應信號達到最佳。 各目標化合物質譜參數(shù)見表1。

表1 42 種目標化合物的質譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 42 analytes

2.1.2 色譜條件的選擇 選擇Shim-pack GIST C18-AQ 分析柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）進行色譜分離，由于酸性環(huán)境下有利于正離子電離，故以0.1%甲酸水溶液為流動相A 相，并考察甲醇、0.1%甲酸甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈作為流動相B相時，對質譜信號及分離的影響。 結果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇時，42 種目標化合物峰響應值整體較低，且特丁通峰型分叉；采用0.1%甲酸甲醇時，峰響應值略有提高，特丁通峰型正常。 采用乙腈時，與甲醇及0.1%甲酸甲醇相比，峰保留時間略有提前，而峰響應值更高，各目標化合物峰型尖銳；采用0.1%甲酸乙腈時，峰響應值、峰保留時間及峰型較乙腈差別較小，故最終采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。 圖1 為空白菲律賓蛤仔基質溶液中加標42 種目標化合物的總離子流色譜圖。

圖1 菲律賓蛤仔樣品中添加42 種目標化合物（添加水平為5 μg/kg）的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of the 42 analytes in Ruditapes philippinarum sample（5 μg/kg for each analyte）

2.2 前處理條件的選擇

乙腈是農藥殘留分析中常用提取液[18-19]，對于動物源性樣品的提取，相比較丙酮、正己烷等提取液，乙腈具有良好的沉降蛋白效果，且萃取出的脂類雜質較少[20]，并有利于后續(xù)樣品凈化。 在空白菲律賓蛤仔中添加質量濃度為5 μg/kg 的目標化合物，考察乙腈、0.1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈的提取效率，結果表明，采用乙腈、0.1%乙酸乙腈及1%乙酸乙腈時，提取效率差異較小，均可滿足要求，綜合考慮成本及環(huán)保，選用乙腈作為提取溶劑。

貝類等動物源性樣品中含有大量脂肪及磷脂類、蛋白質等干擾基質，會對檢測結果及儀器性能帶來影響，需要對樣品提取液進行凈化。在空白菲律賓蛤仔基質樣品加標量為5 μg/kg 時，考察了QuEChERS、EMR-Lipid 分散固相萃取、Captiva EMR-Lipid 固相萃取3 種凈化方式的效果，結果表明，按照文獻[17]所報道的QuEChERS 法，采用PSA 及GCB 作為凈化材料，所得凈化液澄清透明（見圖2），這是因為GCB 對色素具有良好的吸附效果，然而15 種磺酰脲類除草劑平均回收率小于20%（見圖3），主要原因可能是由于PSA 含堿性基團，磺酰脲類除草劑顯弱酸性，兩者發(fā)生吸附[21]，導致回收率降低。 采用EMR-Lipid 分散固相萃取、Captiva EMR-Lipid 固相萃取凈化時，效果比較理想，42 種目標化合物平均回收率均在90%～110%之間，見圖3。 與EMR-Lipid 凈化方法相比，因Captiva EMR-Lipid 凈化方法更為便捷高效，且通過對比凈化后所得樣品，發(fā)現(xiàn)經Captiva EMR-Lipid 凈化，樣品溶液更為澄清透明 （見圖2），故選用Captiva EMR-Lipid 固相萃取凈化方式。

圖2 經不同凈化方式處理后菲律賓蛤仔提取液照片F(xiàn)ig.2 Graphs of the Ruditapes philippinarum extracts cleaned up by different purification methods

圖3 3 種凈化方法的回收率比較Fig.3 Comparison among recoveries of 3 purification methods

2.3 進樣體積的選擇

凈化后所得濾液的溶劑為80%乙腈，其洗脫強度強于初始流動相的洗脫強度，易導致溶劑效應，致使柱效降低，峰型變差。 稀釋樣品或減少進樣量可降低溶劑效應的影響，為簡化操作步驟，避免稀釋對方法檢出限的影響，本文采用減小進樣量的方法降低溶劑效應的影響，經試驗發(fā)現(xiàn)，當進樣量為5 μL 時，50%以上目標化合物峰型較差，當進樣量為2 μL 時，各目標化合物峰型均正常，故最終將進樣量確定為2 μL。

2.4 基質效應的考察

在電噴霧電離模式下，基質成分和目標化合物在離子化時，會相互競爭，產生基質效應。 基質效應會對定性、定量結果造成影響。基質效應計算公式為：基質效應（ME）=（空白基質配制校準曲線斜率/空白溶劑配制校準曲線斜率-1）×100%[22]。當|ME|＜20%時，表明為弱基質效應；當20%≤|ME|≤50%時，表明為中等程度基質效應；當|ME|＞50%時，表明為強基質效應。 考察了目標化合物在菲律賓蛤仔中的基質效應，結果見圖4。結果表明，未凈化時有5 種目標化合物為強基質效應，占比11.9%，14 種目標化合物為中等程度基質效應，占比33.3%；經Captiva EMR-Lipid 凈化后，僅有5 種目標化合物（苯噻酰草胺、胺苯磺隆、醚磺隆、玉嘧磺隆、磺?；锹。┍憩F(xiàn)為中等程度基質效應（占比11.9%），其余37 種目標化合物均表現(xiàn)為弱基質效應，這表明Captiva EMR-Lipid 凈化效果顯著，有效降低了基質影響。本文采用空白基質匹配外標校正進行定量分析，可進一步降低基質效應影響。

圖4 菲律賓蛤仔基質溶液中目標化合物的基質效應強度等級分布比率Fig.4 Ratio distribution of different matrix effect strength levels of analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

2.5 線性關系、檢出限及定量限

以空白菲律賓蛤仔樣品提取溶液配制42 種目標化合物系列標準溶液，采用所建立的方法進行測定，以定量離子峰面積（Y）對應質量濃度（X）進行線性回歸。 以信噪比S/N=3 確定方法的檢出限，以S/N=10 確定方法的定量限。 結果見表2，在0.2～20 μg/L 范圍內，42 種目標化合物線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均大于0.992。 42 種目標化合物的方法檢出限為0.2～0.4 μg/kg，方法定量限為0.5～1.0 μg/kg。

表2 42 種目標化合物在空白菲律賓蛤仔基質中線性關系、方法檢出限、定量限Table 2 Correlation equations，limits of detection （LODs） and limits of quantification （LOQs） of 42 analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

（續(xù)表2）

2.6 回收率與精密度

應用所建立的方法，以空白菲律賓蛤仔樣品為驗證基質，分別添加1 倍LOQ、2 倍LOQ、10 倍LOQ 的目標化合物混合標準溶液，每個加標水平重復6 次，計算加標回收率及相對標準偏差。回收率及相對標準偏差結果見表3，42 種目標化合物在實際空白菲律賓蛤仔樣品中的3 個加標水平的平均回收率為61.0%～110.3%，相對標準偏差為0.1%～17.4%。

表3 42 種目標化合物在空白菲律賓蛤仔基質中加標回收率及相對標準偏差Table 3 Average spiked recoveries，and relative standard deviations （RSDs） of 42 analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

（續(xù)表3）

2.7 實際樣品的測定

采用本方法對2021年6月份購自本地批發(fā)市場及網購的23 批次樣品（菲律賓蛤仔5 批次、文蛤4 批次、櫛孔扇貝4 批次、四角蛤蜊3 批次、長牡蠣3 批次、毛蚶2 批次和紫貽貝2 批次）進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，1 批次菲律賓蛤仔、3 批次文蛤、2批次長牡蠣中檢出除草劑殘留，櫛孔扇貝、四角蛤蜊、毛蚶及紫貽貝中均未檢出除草劑殘留。陽性樣品檢出結果見表4。 長牡蠣和文蛤中除草劑檢出率較高，且存在多種除草劑復合污染的情況，這與文獻[23]報道相符。

表4 樣品分析結果Table 4 Analytical results of samples

現(xiàn)行國家標準《食品中農藥最大殘留限量》[24]尚未規(guī)定貝類中三嗪類、 酰胺類及磺酰脲類等除草劑殘留限量值。日本《食品中殘留農業(yè)化學品肯定列表制度》[25]中規(guī)定的“一律標準”限量值為0.01 mg/kg，由表4 得知，一批次文蛤中西草凈及撲草凈檢出結果（19.2 μg/kg 和20.0 μg/kg）均已超過此限量要求，1 批次文蛤中撲草凈檢出結果（9.2 μg/kg）接近此限量要求，貝類中除草劑殘留風險需引起重視。

3 結論

本文建立了以增強型脂質去除固相萃取柱對樣品進行凈化，以超高效液相色譜串聯(lián)質譜法同時快速測定貝類中14 種三嗪類、13 種酰胺類及15 種磺酰脲類除草劑殘留的分析方法。 研究結果表明，方法的提取凈化效率快，效果好，靈敏度和準確度高，平均回收率為61.0%～110.3%，相對標準偏差為0.1%～17.4%。 可滿足貝類中42 種三嗪類、酰胺類及磺酰脲類除草劑殘留定性、定量分析要求，這為貝類中農藥殘留安全風險監(jiān)控提供了新的可行途徑。