王 艷，趙 寧，李虹佳，王 悅，辛嘉英，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 哈爾濱 150076）

如今，隨著各種工藝生產(chǎn)量的提高，對(duì)農(nóng)藥的需求也日益增多[1-3]。 有機(jī)磷農(nóng)藥（OPPs）因具有高效的殺蟲(chóng)性和低廉的價(jià)格而被廣泛使用，其是一種含礦物質(zhì)元素——磷的有機(jī)化合物，將其適當(dāng)?shù)貞?yīng)用于農(nóng)作物中，可保證農(nóng)作物產(chǎn)量穩(wěn)定[4-6]。然而，當(dāng)有機(jī)磷在農(nóng)作物及果蔬中殘留過(guò)量時(shí)，人類食用后會(huì)導(dǎo)致急性中毒，還會(huì)導(dǎo)致癌癥、突變的發(fā)生，因此，有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的高效、快速檢測(cè)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[7-9]。 目前普遍采用氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11]和快速酶抑制檢測(cè)法[1]檢測(cè)有機(jī)磷，然而，這些方法所用儀器昂貴，需要專業(yè)人員操作，并且易被干擾，靈敏度低，需要較復(fù)雜的有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理，不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[12-13]。為此，研究一種成本低，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間的新型快檢技術(shù)尤為重要。電化學(xué)方法具有反應(yīng)迅速，使用便捷，檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，并因靈敏度高、選擇性好而備受關(guān)注[14-15]。 已成為組分分析的重要方法，并且廣泛應(yīng)用于環(huán)境、生物和醫(yī)藥領(lǐng)域[16]。

天然酶在溫和適宜的條件下，可以高效催化各類生物化學(xué)反應(yīng)，具有高特異性、底物專一性和高選擇性等特點(diǎn)[17-19]。 而活性易受環(huán)境影響，并且制備成本高，價(jià)格昂貴等缺陷使其應(yīng)用范圍受限，利用納米材料開(kāi)展酶的固定化研究是近些年的新興技術(shù)[20-24]，特別將金納米粒子（AuNPs）作為固定化酶的載體材料，不僅可以增加固定分子數(shù)量，而且其優(yōu)良的生物相容性，更有利于維持酶分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[25-27]。 同時(shí)，AuNPs 可使傳感器表面積呈指數(shù)增加，從而顯著增加其催化效率[28-29]。

本文采用電沉積法構(gòu)建固定化酶生物傳感器，在差分脈沖伏安(DPV)模式下開(kāi)展有機(jī)磷農(nóng)藥的特異性、超痕量反定量檢測(cè)研究（圖1）。 以氯化乙酰膽堿（ATCh）為底物分子，固定化氯化乙酰膽堿酯酶 （AChE-AuNPs） 與固定化膽堿氧化酶（COD-AuNPs）水解ATCh 為基礎(chǔ)催化反應(yīng)，基于層層組裝技術(shù)將固定化酶共修飾于金電極上，構(gòu)建固定化酶生物傳感器（AChE/COD@AuNPs-Gold Electrode），通過(guò)循環(huán)伏安法分析雙酶生物傳感器的構(gòu)建過(guò)程，利用DPV 法確定電化學(xué)檢測(cè)體系的最佳條件，考察峰電流信號(hào)下降高度與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的線性關(guān)系。 通過(guò)有機(jī)磷農(nóng)藥（OPP）特異性抑制氯化乙酰膽堿酯酶進(jìn)行水解反應(yīng)，使產(chǎn)物無(wú)法被氧化，電信號(hào)下降，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷的快速、超痕量反定量檢測(cè)。該方法可以彌補(bǔ)目前電化學(xué)方法檢測(cè)有機(jī)磷遇到的一些問(wèn)題，如： 靈敏度低，檢測(cè)限高等。 同時(shí)，也為實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷的現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)奠定了理論基礎(chǔ)。

圖1 AChE/COD@AuNPs-Gold Electrode 共固定化酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)有機(jī)磷示意圖Fig.1 Schematic representation of organophosphorus detection by AChE/COD@AuNPs-Gold Electrode co-immobilized ase sensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水乙醇，上海銀典化工有限公司；氯金酸，廣州嘉樂(lè)化工有限公司； 乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿氧化酶（COD），上海源葉生物科技有限公司；氯化乙酰膽堿（ATCh）、有機(jī)磷（乙酰甲胺磷），濟(jì)南天佑化工公司；檸檬酸鈉、三鉀溶液（鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），廈門(mén)海標(biāo)科技有限公司；分析純離子溶液（Pb2+、Cu2+、Hg2+、Cr6+、Fe3+、Zn2+）。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司； 場(chǎng)發(fā)射高分辨透射電鏡，日本JEOLJEM-2100F；Ag/AgCl 電極（3.4 mol/L KCl 溶液）、鉑絲電極、金電極、CS350M 電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

1.3.1.1 納米金的制備 采用檸檬酸鈉還原法制備納米金，利用公式得出納米金的平均粒徑為13 nm。

1.3.1.2 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的配制 取8 g 的NaCl、0.2 g 的KCl、2.24 g KH2PO4以 及1.44 g 的Na2HPO4配制濃度為0.1 moL/L 的pH 范圍為7.2～8.2 的PBS 緩沖溶液，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 三鉀溶液的配制 電解液為三鉀溶液，即將5 mmol/L 鐵氰化鉀、3 mmol/L 亞鐵氰化鉀和0.1 mol/L 氯化鉀三者充分混勻配制而成。

1.3.2 固定化酶的制備與表征

1.3.2.1 乙酰膽堿酯酶的固定化 將2 mL 質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 的乙酰膽堿酯酶液和2 mL 粒徑為13 nm 的納米金溶液置于10 mL 具塞三角瓶中充分混勻后密封，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置4 h，完成固定化乙酰膽堿酯酶的制備。

1.3.2.2 膽堿氧化酶的固定化 同1.3.2.1 節(jié)的步驟，制備固定化膽堿氧化酶。

1.3.2.3 固定化酶的表征 通過(guò)透射電鏡對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，判斷結(jié)合情況，再將兩種固定化酶按1∶1 體積比混合制備共固定化酶液。

1.3.3 雙酶?jìng)鞲衅鞯闹苽渑c表征 本試驗(yàn)以金盤(pán)電極為工作電極，銀/氯化銀為參比電極，鉑金電極為對(duì)電極，所組成的三電極體系為工作三電極體系，納米金和共固定化酶溶液，首先將拋光打磨至鏡面的裸金電極氮?dú)獯蹈桑謩e將AChEAuNPs、COD-AuNPs 和AChE/COD@AuNPs 電 沉積30 圈，選擇是否共固定化制備固定化酶生物傳感器； 采用循環(huán)伏安法對(duì)備用金電極修飾固定化酶酶液電沉積30 圈，確定是否起放大電流信號(hào)的作用； 在循環(huán)伏安法 （CV） 和差分脈沖伏安法（DPV）模式下，對(duì)比考察有無(wú)氯化乙酰膽堿時(shí)，電流的變化； 在開(kāi)路電位為0.35 V 的交流阻抗法（EIS）模式下，表征雙酶生物傳感器的構(gòu)建過(guò)程，考察不同酶修飾層數(shù)與共修飾固定化酶電沉積圈數(shù)對(duì)傳感器構(gòu)建情況的影響。 在DPV 模式下，檢測(cè)傳感器催化氯化乙酰膽堿氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)底物濃度和體系pH 值篩選，確定最佳檢測(cè)條件。

1.3.4 有機(jī)磷的定量檢測(cè) 在DPV 模式下，基于雙酶?jìng)鞲衅鞔呋然阴Ｄ憠A水解偶聯(lián)氧化反應(yīng)行為的有機(jī)磷檢測(cè)分析。 測(cè)試條件為：階躍高度0.016 v，振幅0.045 v，脈沖寬度0.06 s，取樣間隔0.02 s，待氧化電流峰出現(xiàn)后，向體系加入不同濃度的有機(jī)磷溶液。 基于有機(jī)磷可以抑制氯化乙酰膽堿酯酶的催化活性，導(dǎo)致氯化乙酰膽堿的水解產(chǎn)物膽堿不能被膽堿氧化酶氧化，兩步反應(yīng)疊加峰值會(huì)使氧化電流峰值隨著有機(jī)磷濃度的升高而迅速下降，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷的檢測(cè)，并確定最佳檢測(cè)范圍。

1.3.5 有機(jī)磷檢測(cè)的抗干擾能力及傳感器重復(fù)性與穩(wěn)定性 在氯化乙酰膽堿為底物的檢測(cè)體系中，采用時(shí)間-電流曲線法（I-T 曲線法）捕捉電流信號(hào)變化情況，每隔25 s 向檢測(cè)體系中加入30 μL 有機(jī)磷溶液 （100 nmol/L），隨后依次加入30 μL 重金屬離子 （Pb2+，Cu2+，Hg2+，Cr6+，F(xiàn)e3+，Zn2+，10 μmol/L）。雙酶生物傳感器置于4 ℃冰箱中保存7 d 后，對(duì)濃度為100 nmol/L 的有機(jī)磷溶液進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶構(gòu)建機(jī)制研究

納米金顆粒（AuNPs）與氯化乙酰膽堿酯酶功能化納米金（AChE-AuNPs）和膽堿氧化酶功能化納米金（COD-AuNPs）的分散性明顯不同，而顆粒狀態(tài)無(wú)明顯差別（圖2）。 AuNPs（a）中AuNPs 顆粒分散均勻且粒徑均一，而AChE-AuNPs （b）和COD-AuNPs（c）中AuNPs 表面因修飾了酶分子，抑制了AuNPs 粒子之間的團(tuán)聚，因而AuNPs 粒徑?jīng)]有增大，然而酶以AuNPs 為骨架會(huì)加大AuNPs顆粒間距，因此AuNPs 顆粒分性增強(qiáng)，進(jìn)而說(shuō)明酶分子成功固定于納米金表面。

圖2 AuNPs（a）、AChE-AuNPs（b）、COD-AuNPs（c）的透射電鏡Fig.2 TEM images of AuNPs （a），AChE-AuNPs （b），COD-AuNPs （c）

2.2 雙酶生物傳感器構(gòu)建過(guò)程分析

在以氯化乙酰膽堿為底物的檢測(cè)體系中，當(dāng)裸金電極表面只修飾AChE-AuNPs 時(shí)，在0.23 V電位處氧化峰值為5.31×10-5A； 只修飾了CODAuNPs 時(shí)，也在0.23 V 電位處氧化峰值為2.62×10-5A；將兩種固定化酶按體積比1∶1 共修飾同一條件下，在相同電位處，電信號(hào)的響應(yīng)值峰值約為8.03×10-5A，因此共修飾所構(gòu)建出的固定化酶生物傳感器電信號(hào)響應(yīng)程度較好，并且電信號(hào)峰值在0.23 V 附近疊加傳遞。

在電解液溶液中，當(dāng)酶分子被修飾到電極表面后，電流信號(hào)會(huì)減弱（圖3）電阻不斷增加（圖4），且電流信號(hào)的減弱程度和電阻增加的程度均與修飾層數(shù)成正比。 在氯化乙酰膽堿為底物的檢測(cè)體系中，酶修飾層數(shù)不能超過(guò)2 層（圖5 和圖6），當(dāng)增加到3 層時(shí)，氧化反應(yīng)峰信號(hào)便顯著減弱。這說(shuō)明酶的修飾量并不是越多越好，過(guò)多的酶分子會(huì)互相掩蓋催化活性中心，且阻礙底物和產(chǎn)物在活性中心上的傳質(zhì)交換，進(jìn)而減少了氧化還原反應(yīng)的發(fā)生，使得信號(hào)減弱。

圖3 ATCh 中循環(huán)伏安法構(gòu)建方法的選擇Fig.3 Selection of CV construction method in ATCh

圖4 三鉀溶液中循環(huán)伏安法固定化酶生物傳感器修飾層數(shù)優(yōu)化Fig.4 Optimization of modified layers of circulating voltammetry imase biosensor in tripotassium solution

圖5 三鉀溶液中交流阻抗法固定化酶生物傳感器修飾層數(shù)優(yōu)化Fig.5 Optimization of fixase biosensor modified layer in tripotassium solution

圖6 ATCh 中DPV 法檢測(cè)酶層數(shù)的選擇Fig.6 Selection of enzyme layers detected by DPV method in ATCh

在以氯化乙酰膽堿為底物的檢測(cè)體系中，采用循環(huán)伏安法電沉積電化學(xué)行為構(gòu)建固定化酶生物傳感器，30～45 圈的變化范圍。 由圖7 可知，當(dāng)圈數(shù)為35 圈時(shí)，電沉積構(gòu)建的固定化酶生物傳感器催化底物的電流信號(hào)最佳，可達(dá)到1.06×10-5A，隨著電沉積圈數(shù)的增加，如圖8 所示，傳感器檢測(cè)性能不增反降，可能是因?yàn)殡S著構(gòu)建圈數(shù)的增加，固定化酶生物傳感器中酶的催化位點(diǎn)被互相遮蓋，形成空間位阻，酶的催化活性與電信號(hào)不能更好的被傳感器捕獲，因此選擇電沉積圈數(shù)為35 圈最佳。

圖7 ATCh 中DPV 法檢測(cè)電沉積圈數(shù)的選擇Fig.7 Selection of DPV method for detecting the number of electrodeposition turns in ATCh

圖8 ATCh 中DPV 法檢測(cè)電沉積圈數(shù)的選擇折線圖Fig.8 Selected line chart of DPV method in ATCh for detecting the number of electrodeposition turns

2.3 DPV 法對(duì)有機(jī)磷檢測(cè)體系的優(yōu)化

2.3.1 固定化酶?jìng)鞲衅鞔呋孜餄舛鹊拇_定 如圖9 所示，在0.1～0.4 V 電位區(qū)間，當(dāng)電壓為0.26 V 時(shí)，氧化峰電流達(dá)到最大值。 且當(dāng)氯化乙酰膽堿濃度為2 mmol/L 時(shí)，最大電流強(qiáng)度達(dá)到1.35×10-5A（圖10）。 氯化乙酰膽堿濃度不宜太高，多余的底物會(huì)導(dǎo)致酶的催化活性中心過(guò)飽和而引發(fā)信號(hào)衰減，即宏觀表現(xiàn)為電流信號(hào)減弱。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)低時(shí)，單位質(zhì)量的酶可催化反應(yīng)底物沒(méi)有達(dá)到飽和，酶的催化效率沒(méi)有達(dá)到最高，因此電化學(xué)體系中的介電系數(shù)無(wú)法達(dá)到最高。 如圖10 所示，當(dāng)氯化乙酰膽堿濃度為2 mmol/L 時(shí)，電化學(xué)體系的介電系數(shù)達(dá)到最大。所以，檢測(cè)體系中氯化乙酰膽堿的最佳濃度為2 mmol/L。

圖9 DPV 法檢測(cè)固定化酶?jìng)鞲衅鞔呋煌瑵舛華TChFig.9 DPV method to detect different concentrations of ATCh catalyzed by immobilized enzyme sensor

圖10 DPV 法檢測(cè)固定化酶?jìng)鞲衅鞔呋煌瑵舛華TCh 折線圖Fig.10 DPV method for detecting different concentrations of ATCh catalyzed by immobilized enzyme sensor

2.3.2 pH 值對(duì)雙酶生物傳感器催化氯化乙酰膽堿的影響 如圖11 所示，當(dāng)體系pH 值在7.8～8.2范圍內(nèi)時(shí)，電位在0.26 V 時(shí)氧化峰電流達(dá)到最大值。 如圖12 所示，不同pH 值體系下，得到的電流響應(yīng)信號(hào)值也不同，這主要是由于體系pH 值對(duì)傳感器上酶的催化活性會(huì)產(chǎn)生影響。 當(dāng)pH 值為7.8時(shí)，電信號(hào)強(qiáng)度最大為1.98×10-5A，這主要是由于pH 值會(huì)改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶的活性氨基酸以及殘基部分或全部失活，進(jìn)而影響酶的催化活性，因此該檢測(cè)體系的最佳pH 值為7.8。

圖11 DPV 法檢測(cè)固定化酶?jìng)鞲衅鞑煌琾H 催化ATChFig.11 DPV method to detect ATCh catalyzed by immobilized enzyme sensor at different pH

圖12 DPV 法檢測(cè)固定化酶?jìng)鞲衅鞔呋煌瑵舛華TCh 折線圖Fig.12 Line chart of different concentrations of ATCh catalyzed by immobilized enzyme sensor by DPV method

2.4 有機(jī)磷的檢測(cè)范圍及檢出限

以+0.26 V 處氧化峰電流為指標(biāo)，考察不同質(zhì)量濃度有機(jī)磷對(duì)該雙酶生物傳感器催化氯化乙酰膽堿水解及其產(chǎn)物膽堿氧化反應(yīng)活性的抑制作用，實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷的反定量檢測(cè)。如圖13 所示，通過(guò)對(duì)不同質(zhì)量濃度有機(jī)磷與其加入前、 后電流強(qiáng)度的變化差值之間的線性擬合得到線性回歸方程為y=0.0468x+1.2124（R2=0.9985），即有機(jī)磷在1×10-9～100×10-9mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與電流信號(hào)差值之間具有良好的線性關(guān)系，且其最低檢出限為1.15×10-11mg/L。

圖13 固定化酶生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷線性關(guān)系Fig.13 Organophosphorus linearity detected by immobilized ase biosensors

2.5 有機(jī)磷檢測(cè)體系抗干擾性能研究

在以氯化乙酰膽堿為反應(yīng)底物的PBS（pH 7.8）體系中，利用I-T 曲線法對(duì)以每隔25 s 加入10 μL 的3×10-10mg/L 有機(jī)磷溶液進(jìn)行100 倍濃度常見(jiàn)重金屬離子抗干擾性能評(píng)估。 如圖14 所示，無(wú)論是否加入高于有機(jī)磷濃度100 倍的各種重金屬離子，電流均呈相同趨勢(shì)的階梯狀有序下降，且雙酶生物傳感器感應(yīng)電流強(qiáng)度無(wú)變化，說(shuō)明在此檢測(cè)范圍內(nèi)傳感器可以排除常見(jiàn)伴隨性重金屬離子的干擾，對(duì)有機(jī)磷實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別。

圖14 抗干擾能力I/T 曲線Fig.14 Anti-interference ability I/T curve

2.6 酶生物傳感器的穩(wěn)定性

當(dāng)所構(gòu)建的AChE/COD@AuNPs 雙酶生物傳感器在檢測(cè)體系中 （氯化乙酰膽堿+PBS 緩沖溶液）對(duì)有機(jī)磷進(jìn)行連續(xù)性多次重復(fù)檢測(cè)時(shí)，其電流響應(yīng)值幾乎沒(méi)有變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.97%。說(shuō)明該雙酶生物傳感器具有優(yōu)良的檢測(cè)穩(wěn)定性，如圖15 所示，該傳感器在4 ℃冰箱中放置7 d 后，對(duì)有機(jī)磷響應(yīng)的峰電流可達(dá)到97.95%。

圖15 固定化酶生物傳感器穩(wěn)定性時(shí)間-電流響應(yīng)圖Fig.15 Time-current response diagram of stability of immobilized enzyme biosensor

3 結(jié)論

利用電沉積法通過(guò)層層組裝納米金、 共固定化乙酰膽堿酯酶與乙酰膽堿氧化酶構(gòu)建雙酶生物傳感器，修飾層數(shù)為2 層的傳感器催化性能穩(wěn)定；當(dāng)在底物氯化乙酰膽堿的濃度為2 mmol/L、pH 值為7.8 的檢測(cè)體系下，該傳感器具有良好的電流信號(hào)響應(yīng)值； 有機(jī)磷質(zhì)量濃度在1×10-9～100×10-9mg/L 范圍內(nèi)，與電流強(qiáng)度線性擬合程度最好，線性方程為y=0.0468x+1.2124（R2=0.9985），最低檢出限為1.15×10-11mg/L（S/N=3）。 且在此檢測(cè)體系下，該雙酶生物傳感器可以有效抵抗Pb2+、Cu2+、Hg2+、Cr6+、Fe3+、Zn2+等常見(jiàn)重金屬離子的干擾；構(gòu)建的新型AChE/COD@AuNPs 雙酶生物傳感器在差分脈沖伏安工作模式下，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行快速檢測(cè)具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，檢測(cè)時(shí)間僅需7.5 s，該新型傳感器的研制及應(yīng)用為食品中痕量有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)提供新思路。