郜彥彥，魏明珠，陳晨，賴運玲，熊建華，張鳳英*

（1.江西農業(yè)大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.廈門海關技術中心，福建 廈門 361013）

草魚生長迅速、肉質鮮嫩肥美、經濟實惠，是中國“四大家魚”之一，也是世界上養(yǎng)殖產量最大的水產養(yǎng)殖品種[1]。草魚肉營養(yǎng)豐富，蛋白質和水分含量高，且含有多種不飽和脂肪酸[2]，在加工貯運過程中極易受腐敗微生物的影響，發(fā)生蛋白質和脂肪氧化酸敗[3]等問題，即使在冷藏條件下，魚肉也極易腐敗變質，因此對草魚的保鮮進行研究尤為重要。傳統(tǒng)的聚乙烯（polyethylene，PE）或聚丙烯塑料食品包裝雖能在一定程度上阻隔空氣達到保鮮的目的，但無法從源頭阻止細菌滋生。通過在食品成膜基質中添加防腐劑、抗氧化劑等功能性物質賦予膜抑菌和抗氧化性能，用于延緩淡水魚的腐敗變質在國內外已有研究。楊福馨等[4]通過添加柚皮漿、植物精油到保鮮膜成膜基質中增強了對草魚魚肉的保鮮效果；梅佳林[5]研究表明添加芳樟醇的復合保鮮膜可以有效抑制三文魚源莓實假單胞菌的生長；Webber等[6]研究指出，含 0.89 μg/cm2乳鏈球菌素的復合膜能夠有效殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

紫色桿菌素（violacein，Vio）是微生物產生的一種天然藍紫色素，以兩個色氨酸分子氧化縮合而成，屬于吲哚衍生物[7]，具有多種生物活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗紫外線等，在食品、化妝品、醫(yī)藥、印染等領域有著廣泛的應用前景。隨著紫色桿菌素產量的上升，紫色桿菌素的高生物功能活性和低毒副作用的特性被眾多研究者關注，并予以開發(fā)利用，如天然食用色素[8]、防腐劑[9]、抗菌性紡織品[10]、可降解藍色油墨[11]、抗紫外線口紅[12]、治療痤瘡的軟膏[13]等。但是將紫色桿菌素作為防腐劑添加到成膜基質中制備具有抑菌和抗氧化功能的復合保鮮膜卻鮮有報道。本試驗研究紫色桿菌素的穩(wěn)定性和生物活性，并以聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）為基礎制備膜液，添加紫色桿菌素，制備聚乙烯醇/紫色桿菌素（PVA/Vio）復合保鮮膜，并測定膜的抑菌和抗氧化活性，以及其在4℃冷藏條件下對草魚的保鮮效果，以期為紫色桿菌素進一步開發(fā)利用和水產品保鮮提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚：市售，約2 kg一尾；紫色桿菌素（純度85%以上）：美國GlpBio公司。

大腸桿菌ATCC 35218、沙門氏菌ATCC BAA708、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、化膿性鏈球菌ATCC 19615：江西農業(yè)大學食品微生物學實驗室保存；單增李斯特菌ATCC 19115、蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579：上海嘉楚生物工程有限公司。

聚乙烯醇、甲基纖維素、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸：麥克林試劑有限公司；2，6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]、過硫酸鉀：美國Sigma公司；酵母粉、胰蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、LB培養(yǎng)基：上海生工生物工程股份有限公司；以上所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

Spcord200紫外可見分光光度計：德國耶拿分析儀器股份公司；GL-21M高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SpectraMax M2多功能酶標儀：美國Molecular Devices公司；BILON-08拍擊式均質機：上海比朗儀器制造有限公司；SW-CJ潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；pHS-3E pH計：上海佑科儀器儀表有限公司；SHP-160型生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫色桿菌素的穩(wěn)定性研究

將紫色桿菌素水溶液pH值調節(jié)至7，使用紫外可見分光光度計在300 nm～800 nm波長下進行掃描，使其在最佳吸收波長575 nm處的吸光值為0.4左右，即紫色桿菌素工作液。在熱穩(wěn)定性測試中，將紫色桿菌素工作液分別置于 0、20、40、60、80、100 ℃水浴中孵育2 h后，冰浴冷卻，測定其在575 nm處吸光值，以0℃時的吸光值為起始吸光值。在pH值穩(wěn)定性測試中，將紫色桿菌素工作液用HCl和NaOH調節(jié)pH值分別至1～10，30℃靜置2 h，冰浴冷卻，測定其在575 nm處吸光值，以pH7時的吸光值為起始吸光值。吸光值下降率[14]按下式計算。

吸光值下降率/%=（A0-A）/A0×100

式中：A0為紫色桿菌素的起始吸光值；A為處理后的吸光值。

1.3.2 紫色桿菌素的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度

參考Diao等[15]的方法，采用倍比稀釋法測定最小抑菌濃度（minimal inhibition concentration，MIC），在無菌96孔板中采用二倍法將紫色桿菌素用生理鹽水稀釋成 100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/L的溶液，向各孔中同時加入1×107CFU/mL的指示菌100 μL，以 100 μL 生理鹽水為陰性對照，搖勻，37 ℃培養(yǎng)24 h后對各孔進行檢查，對照管中菌呈現(xiàn)渾濁狀生長，溶液開始出現(xiàn)澄清的最低濃度確定為紫色桿菌素的MIC值，高于MIC值的進行平板菌落計數(shù)，菌落數(shù)小于5個的最低樣品濃度確定為最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.3 紫色桿菌素的抗氧化活性

1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除率測定參照Erel[16]的方法并稍作改動。配制2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液和7.0 mmol/L ABTS溶液，避光反應16 h，即ABTS母液。用去離子水稀釋ABTS母液，使其在734 nm處的吸光值為0.70左右，即ABTS工作液。分別吸取200 μL濃度為1.00、2.50、5.00、12.50、25.00 mg/L 的紫色桿菌素溶液，加入2.0 mL ABTS工作液，混勻后25℃避光反應20 min，于734 nm處測定吸光值，以抗氧化劑BHT為對照，計算樣品對ABTS+自由基的清除率。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A樣品-A對照）/A空白]×100

式中：A樣品為添加樣品的反應體系的吸光值；A對照為以去離子水替代ABTS溶液的反應體系的吸光值；A空白為以去離子水替代樣品的反應體系的吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除率測定參照Sharma等[17]的方法并稍作改動。分別吸取2.0 mL濃度為2.50、5.00、12.50、25.00 mg/L的紫色桿菌素溶液，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液中，混勻，25℃避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值，以抗氧化劑BHT為對照，計算樣品對DPPH自由基的清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A樣品-A對照）/A空白]×100

式中：A樣品為添加樣品的反應體系的吸光值；A對照為以無水乙醇替代DPPH的反應體系的吸光值；A空白為以無水乙醇替代樣品的反應體系的吸光值。

1.3.3.3 總還原能力測定

總還原能力的測定采用Pulido等[18]的鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）方法并稍作改動。FRAP工作液配制：將2.5 mL 0.01 mol/L TPTZ溶液、25.0 mL 0.3 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH3.6）與2.5 mL 0.02 mol/L FeCl3溶液混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標準曲線制作：吸取0.5 mL濃度分別為0.025、0.100、0.150、0.200、0.400、0.500、0.800 mmol/L 的 FeSO4溶液與3.0 mL FRAP工作液混勻，37℃保溫15 min后于593 nm處測定吸光值。以反應體系中FeSO4的濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為 y=3.695x+0.006，R2=0.995。

樣品總還原能力測定：分別吸取0.5mL濃度為2.50、5.00、12.50、25.00 mg/L紫色桿菌素樣品加入3.0 mL FRAP工作液，37℃反應15 min后于593 nm處測定吸光值，記為A樣品；測定以去離子水替代樣品的反應體系在593 nm處的吸光值，記為A空白；測定以去離子水替代FRAP工作液的反應體系在593 nm處的吸光值，記為 A對照；計算 A樣品-A空白-A對照，并在標準曲線上獲得相應的FeSO4濃度，評估總還原能力。

1.3.4 PVA/Vio膜的制備

參考楊萍萍等[19]的方法并稍作改動，將3 g PVA和1 g甲基纖維素溶于100 mL去離子水中，并在90℃水浴攪拌1 h，隨后向該溶液中加入1 g甘油，90℃水浴加熱攪拌均勻，即得PVA基礎膜液，在基礎膜液中加入1 mL紫色桿菌素，使其終濃度為15.00 mg/L，超聲去泡，將膜液倒至平整的玻璃板上流延均勻，置于60℃烘箱12 h成膜，揭膜后保存，即得PVA/Vio膜，未添加紫色桿菌素的為PVA膜。

1.3.5 PVA/Vio膜的抑菌和抗氧化活性

參考鄭燕等[20]的方法，將75 mg膜樣品過夜溶解于6 mL離子水中，按照1.3.3的方法測定PVA膜和PVA/Vio膜的抗氧化活性。采用楊萍萍等[19]的PVA復合膜抑菌圈試驗測定膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。具體方法：用打孔器制作直徑為9 mm的膜片，紫外殺菌后備用?；罨蟮木航浵♂專s103CFU/mL）后均勻涂布至LB培養(yǎng)基上，夾取PVA和PVA/Vio膜片置于培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑。

1.3.6 PVA/Vio膜對草魚的保鮮評價

將鮮活草魚致死后去頭、尾、鱗和內臟，剔除魚骨并均勻切割成每塊100 g，用PVA膜和PVA/Vio膜全包裹魚肉，放置于無菌袋中，空白（CK）組為普通的PE保鮮膜包裹，置于（4±2）℃冰箱，分別于 0、2、4、6、8、10 d取樣測定相關指標。

1.3.6.1 菌落總數(shù)的測定

按照GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)的測定》測定，將魚肉樣品用量修改為10.0 g，按照水產品培養(yǎng)要求在（30±1）℃條件下培養(yǎng)（72±3）h后進行菌落計數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

1.3.6.2 硫代巴比妥酸反應物 （thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的測定

按照白嬋等[21]的方法測定TBARS值。稱取5.0 g魚肉樣品加入25 mL質量濃度為7.5%的三氯乙酸，均質1 min，雙層濾紙過濾，取5 mL上清液加入5 mL 0.02 mol/L的2-硫代巴比妥酸溶液，100℃水浴30 min后，冷卻至室溫。取5 mL溶液，加入5 mL氯仿?lián)u勻靜置分層，然后取上清液測定532、600 nm處吸光值，TBARS值以1 kg魚肉樣品中所含丙二醛質量（mg）表示。TBARS值計算公式如下。

TBARS值/（mg/kg）=（A532-A600）×9.24/w

式中：A532、A600為樣品在 532、600 nm 處的吸光值；w為魚肉樣品質量，g；9.24為常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

所有試驗均進行3次平行，通過SPSS Statistics 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并計算自由基清除能力的IC50值，使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紫色桿菌素穩(wěn)定性研究

2.1.1 熱穩(wěn)定性

溫度對紫色桿菌素穩(wěn)定性的影響見圖1。

圖1 溫度對紫色桿菌素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on the stability of violacein

由圖1可知，溫度升高對紫色桿菌素的影響并不明顯，在溫度≤80℃時紫色桿菌素吸光值變化不顯著，下降率不足5%，但是當溫度為100℃時，吸光值下降了12%，說明紫色桿菌素在0℃～80℃條件下性質穩(wěn)定。因此，在加工利用過程中，應盡量避免100℃高溫處理對紫色桿菌素穩(wěn)定性帶來的不利影響。

2.1.2 pH值穩(wěn)定性

pH值對紫色桿菌素穩(wěn)定性的影響見圖2。

圖2 pH值對紫色桿菌素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH value on the stability of violacein

由圖2可知，pH值為1～9時，紫色桿菌素吸光值變化不顯著；pH值為10時，吸光值略有下降，但是下降率不足5%，說明酸堿環(huán)境對紫色桿菌素的影響較小。這可能是由于紫色桿菌素結構較簡單，在酸堿條件下不易發(fā)生不可逆的轉變。因此，在利用紫色桿菌素開發(fā)產品時，pH值的條件可以適當放寬。

2.2 紫色桿菌素的抑菌活性

紫色桿菌素的抑菌活性如表1所示。

表1 紫色桿菌素的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of violacein

由表1可知，紫色桿菌素對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為 3.13、6.25、12.50、6.25 mg/L，最低殺菌濃度分別為 12.50、12.50、25.00、25.00 mg/L，對革蘭氏陰性菌（沙門氏菌、大腸桿菌）沒有抑菌活性。試驗結果與Cazoto等[22]和Dodou等[23]的研究結果相一致，紫色桿菌素對革蘭氏陽性菌抑菌效果良好，對革蘭氏陰性菌影響較小。另外，Sasidharan等[24]的研究還發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素也可以有效地抑制致病真菌以及酵母的增殖，如擴展青霉、黃曲霉、白色念珠菌、紅色毛蘚菌、尖鐮孢菌、立枯絲核菌。

2.3 紫色桿菌素的體外抗氧化活性

2.3.1 ABTS+自由基清除能力

ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑，經氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基，當遇到具有抗氧化活性的物質時，ABTS+自由基會被還原，溶液顏色變淺[25]。紫色桿菌素和對照BHT對ABTS+自由基的清除作用測定結果見圖3。

圖3 紫色桿菌素和BHT對ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical scavenging activities of violacein and butylated hydroxytoluene

由圖3可知，當濃度大于5.00 mg/L時，紫色桿菌素和BHT的ABTS+自由基清除率均大于95%，兩者的抗氧化能力相當，進行線性擬合可得紫色桿菌素清除ABTS+自由基的IC50為1.64 mg/L，由此可見紫色桿菌素具有極強的ABTS+自由基清除能力。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的順磁化合物，其結構中含有1個孤對電子，若自由基清除劑存在時，DPPH自由基接受一個電子，配對形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，使其顏色由深紫色褪至黃色，目前已被廣泛應用于物質的抗氧化特性評價中[25]。紫色桿菌素和BHT對DPPH自由基的清除作用測定結果見圖4。

圖4 紫色桿菌素和BHT對DPPH自由基的清除作用Fig.4 DPPH radical scavenging activity of violacein and butylated hydroxytoluene

如圖4所示，隨著濃度的增大兩種抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力均成上升趨勢，且紫色桿菌素的DPPH自由基清除能力高于BHT。紫色桿菌素濃度為12.50 mg/L時DPPH自由基清除率為46.35%，是BHT的DPPH自由基清除率的2.44倍，紫色桿菌素清除DPPH自由基的IC50為14.72 mg/L，由此可見紫色桿菌素具有極強的DPPH自由基清除能力。

2.3.3 總還原能力

FRAP法測定總還原能力的原理是Fe3+被具有抗氧化活性的物質還原成Fe2+，與TPTZ形成藍色復合物，從而使吸光值發(fā)生變化[25]。紫色桿菌素和陽性對照BHT的總還原能力測定結果見圖5。

圖5 紫色桿菌素和BHT的總還原能力Fig.5 Total reduction ability of violacein and butylated hydroxytoluene

由圖5可知，紫色桿菌素和BHT總還原能力隨著濃度的增大而增強，且紫色桿菌素的總還原能力優(yōu)于BHT。當濃度為12.50 mg/L時，紫色桿菌素的總還原能力（88.49 μmol/L）是 BHT（56.47 μmol/L）的 1.57 倍，說明紫色桿菌素具有良好的總還原能力。

2.4 PVA/Vio膜抑菌和抗氧化活性

微生物的生長以及脂質氧化是引起食物腐敗變質的重要原因，在食品包裝材料中添加防腐劑和抗氧化劑有望成為抑制食品中細菌過度繁殖和脂質氧化的重要手段之一[26]。添加15.00 mg/L紫色桿菌素的PVA/Vio膜的抑菌和抗氧化活性見表2。

表2 PVA膜和PVA/Vio膜的抑菌和抗氧化活性Table 2 Antibacterial and antioxidant activities of the PVA film and PVA/Vio film

由表2可知，PVA/Vio膜的抑菌活性和抗氧化活性顯著優(yōu)于PVA膜，ABTS+自由基和DPPH自由基清除率分別達到72.04%和31.97%，總還原能力為44.20μmol/L，對金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著。試驗中制備的PVA/Vio膜和譚瑞心等[27]制備的牛至精油羧甲基纖維素膜的抗氧化和抑菌活性結果相似，這說明紫色桿菌素的添加增強了PVA膜的抑菌和抗氧化活性。

2.5 PVA/Vio膜包裹草魚TBARS值的變化

在水產品貯藏過程中，TBARS值表示脂質氧化形成次級產物的程度，可作為水產品脂肪氧化程度的評價指標[21]。一般當魚肉TBARS值超過1.0 mg/kg時，脂質氧化程度加劇，產生的丙二醛和胺類物質增多，嚴重影響水產品感官品質和肉質，不建議食用[3]。4℃冷藏條件下不同膜包裹草魚TBARS值的變化見圖6。

圖6 4℃冷藏條件下草魚TBARS值的變化Fig.6 The variation in TBARS value of grass carp stored at 4℃

從圖6可以看出，隨著冷藏時間的延長，3組魚肉的TBARS值均呈上升趨勢，但PVA/Vio膜包裹的魚肉TBARS值始終低于CK組（普通PE保鮮膜）和PVA組。冷藏第4天時，CK組和PVA組TBARS值分別達到1.12 mg/kg和1.06 mg/kg，超過建議食用限量值；而PVA/Vio膜包裹的魚肉冷藏第8天，其TBARS值為1.15 mg/kg，超過建議食用限量值。說明PVA/Vio膜處理能有效減緩魚肉中的脂肪氧化速率，有利于草魚的冷藏保鮮。

2.6 PVA/Vio膜包裹對冷藏草魚菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)是判定魚類等水產品品質優(yōu)劣和腐敗程度的一個非常重要的指標，通常當菌落總數(shù)值超過6 lg（CFU/g）時，魚肉腐敗嚴重，無法食用[28]。4 ℃冷藏條件下不同膜包裹草魚菌落總數(shù)的變化見圖7。

圖7 4℃冷藏條件下草魚菌落總數(shù)的變化Fig.7 The variation in total viable count of grass carp stored at 4℃

從圖7可以看出，草魚在4℃冷藏條件下的初始菌落總數(shù)值為3.95 lg（CFU/g），與文獻中報道的草魚初始菌落總數(shù)較為一致[28]，說明草魚在貯藏初期品質良好。隨著貯藏時間的延長，不同膜包裹的魚肉菌落總數(shù)均有所升高，但是PVA/Vio組的菌落總數(shù)值均低于CK組和PVA組。CK組和PVA組的草魚菌落總數(shù)值在4℃下貯藏4 d后接近新鮮魚片的菌落總數(shù)可接受限度值6 lg（CFU/g），而PVA/Vio組在貯藏8 d后接近6 lg（CFU/g），延長了4 d的貨架期?？梢娞砑幼仙珬U菌素的復合保鮮膜對草魚冷藏過程中微生物的生長繁殖起到較好的抑制作用，有利于草魚的冷藏保鮮。

3 結論

紫色桿菌素是一種具有抑菌和抗氧化活性的天然色素，在pH1～10、0℃～80℃條件下性質穩(wěn)定，具有很好的抑制革蘭氏陽性菌和抗氧化的作用，對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為 3.13、6.25、12.50、6.25 mg/L，清除ABTS+自由基和DPPH自由基的IC50分別為1.64 mg/L和14.72 mg/L，濃度為12.50 mg/L時總還原力為88.49 μmol/L。以PVA為基礎膜液，加入15.00 mg/L的紫色桿菌素制成的PVA/Vio膜具有較好的抑菌和抗氧化活性。PVA/Vio膜包裹的草魚在4℃冷藏條件下的菌落總數(shù)和TBARS值均大幅低于PVA膜和普通的PE保鮮膜，延緩了草魚的腐敗變質，保鮮效果明顯。