何浩麟，張延峰，陶 琴，雷 歡，李 雷，方海紅

（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330013）

1 前言

白細(xì)胞減少癥（leukopenia）是腫瘤放、化療過程中出現(xiàn)的常見不良反應(yīng)，主要特征為外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)低于4.0 × 109/L[1]。白細(xì)胞減少會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，易誘發(fā)感染，嚴(yán)重的白細(xì)胞減少癥會(huì)導(dǎo)致敗血癥、膿毒血癥的出現(xiàn)，甚至危及生命[2]。中醫(yī)學(xué)無白細(xì)胞減少癥之病名，據(jù)其證可歸屬于中醫(yī)學(xué)“虛損”、“虛勞”等范疇，病機(jī)為脾腎兩虛、氣血不足，臨床常以健脾益腎、補(bǔ)益氣血等方藥加以治療[3，4]。

補(bǔ)中益氣丸為中醫(yī)經(jīng)典名方，由黃芪、黨參、白術(shù)、甘草、柴胡、升麻、當(dāng)歸和陳皮等多味中藥配伍而成的丸劑。方劑君藥為黃芪，具有補(bǔ)元?dú)?、氣行的作用[5]；臣藥黨參、白術(shù)和甘草具有補(bǔ)中益氣、健胃補(bǔ)脾的功效；當(dāng)歸活血而補(bǔ)血，化瘀而不傷正；陳皮理氣和胃、補(bǔ)而不滯，升麻和柴胡聯(lián)用升陽舉陷為佐藥，多藥聯(lián)用共奏補(bǔ)中益氣、升陽舉陷之功，臨床常用于脾胃虛弱、中氣下陷所致的體倦乏力、腹瀉、脫肛等癥[6，7]。臨床研究表明補(bǔ)中益氣湯可有效改善治療化療致白細(xì)胞減少癥[8]，并有補(bǔ)中益氣丸與六味地黃丸聯(lián)合治療白細(xì)胞減少癥的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[9]，但其治療白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)科學(xué)，從生物網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)層次的整體角度解析藥物與治療疾病間的分子關(guān)聯(lián)，揭示藥物的系統(tǒng)性作用及機(jī)制，指導(dǎo)新藥的研究與開發(fā)[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略與中醫(yī)藥對(duì)疾病整體的認(rèn)識(shí)相符合。構(gòu)建“中藥-多成分-多靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，有利于篩選中藥活性成分及闡明中藥的作用機(jī)制[11，12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方的作用機(jī)制研究和探索，為復(fù)方配伍機(jī)制和探究思路提供幫助[13，14]。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)分析了補(bǔ)中益氣丸治療白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制，為其治療白細(xì)胞減少癥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 補(bǔ)中益氣丸主要活性成分與作用靶點(diǎn)的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP，www.tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索黃芪、白術(shù)、甘草、黨參、陳皮、當(dāng)歸、柴胡以及升麻，并加以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)挖掘補(bǔ)中益氣丸中符合條件的活性成分以及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。通過中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）檢索，以QED 大于0.67 及評(píng)分為Good 和Moderate為篩選標(biāo)準(zhǔn)挖掘補(bǔ)中益氣丸中符合條件的主要活性成分以及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)[15，16]。最終，將收集到的靶點(diǎn)合并去重整理獲得補(bǔ)中益氣丸的作用靶點(diǎn)。

2.2 補(bǔ)中益氣丸的藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述數(shù)據(jù)庫收集所得到的藥物主要活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape3.9.1 中，構(gòu)建復(fù)方藥物-活性成分-靶點(diǎn)三者的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，最后整合繪制得到藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.3 白細(xì)胞減少癥疾病靶點(diǎn)的獲取

以“l(fā)eukopenia”作為關(guān)鍵詞，分別在人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://www.omim.org/）、DisGeNet（http://www.disgenet.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫檢索，篩選并收集有關(guān)白細(xì)胞減少病癥的相關(guān)靶點(diǎn)基因。另外，根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行分析，得到環(huán)磷酰胺致白細(xì)胞減少癥小鼠的差異基因，將數(shù)據(jù)庫檢索及測序獲得的基因整合獲得白細(xì)胞減少癥的疾病靶點(diǎn)。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶標(biāo)篩選

將整理且合并后的補(bǔ)中益氣丸所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因，以及白細(xì)胞減少疾病相關(guān)的靶基因?qū)氲絍enny2.1.0（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中，獲得中藥復(fù)方-疾病的交集靶點(diǎn)韋恩圖；在STRING（http://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的交集靶點(diǎn)進(jìn)行映射，構(gòu)建新的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖[12]。活性成分及作用靶點(diǎn)用“節(jié)”和“點(diǎn)”表達(dá)，節(jié)點(diǎn)間的相互作用關(guān)系用“邊”表達(dá)。通過Cytoscape3.9.1 對(duì)補(bǔ)中益氣丸-白細(xì)胞減少癥交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，以“degree”、“Closeness Centrality”及“Betweenness Centrality”作為篩選的指標(biāo)[17，18]，找到排名較靠前的基因，并與韋恩圖所找到交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行匯總，可以得到補(bǔ)中益氣丸治療白細(xì)胞減少癥的核心靶標(biāo)基因。

2.5 核心靶標(biāo)的GO 與KEGG 富集分析

運(yùn)用注釋及集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID,https://david.Ncifcrf.gov/）對(duì)上述篩選的核心靶標(biāo)基因進(jìn)行分析。物種設(shè)定為“Homo sapiens”，基因修正為“official gene symbol”，進(jìn)行基因本體（GO）生物功能與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析[19]。最終得到補(bǔ)中益氣丸干預(yù)白細(xì)胞減少癥的KEGG 信號(hào)通路和GO 富集分析數(shù)據(jù)。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

從補(bǔ)中益氣丸中選出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較多化合物與關(guān)鍵核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。經(jīng)PubChem 得到補(bǔ)中益氣丸關(guān)鍵活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，再經(jīng)Chem3D進(jìn)行能量最小化得到其mol2 格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫得到核心靶點(diǎn)代號(hào)，經(jīng)PYMOL 去除核心靶蛋白的水分子及配體。使用Auto Dock Tools1.5.6 對(duì)靶蛋白加氫加電荷后將蛋白質(zhì)和化合物轉(zhuǎn)為受體和配體，并將其轉(zhuǎn)換成pdbqt 格式后可進(jìn)行分子對(duì)接操作。當(dāng)結(jié)合能小于-5 kcal/mol 則說明兩者具有良好結(jié)合性。最后通過PYMOL 將對(duì)接的化合物與靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接可視化分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 補(bǔ)中益氣丸活性成分與靶點(diǎn)的篩選

本文通過TCMSP 與ETCM 數(shù)據(jù)庫的查詢與篩選得到黃芪18 個(gè)成分、白術(shù)10 個(gè)成分、甘草111 個(gè)成分、黨參30 個(gè)成分、陳皮17 個(gè)成分、當(dāng)歸25 個(gè)成分、柴胡28 個(gè)成分及升麻12 個(gè)成分。通過刪除重復(fù)項(xiàng)與匯總后得到補(bǔ)中益氣丸成分共221 個(gè)，其中部分活性成分基本信息見表1。

表1 補(bǔ)中益氣丸部分活性成分的基本信息

3.2 補(bǔ)中益氣丸藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape3.9.1 構(gòu)建上述獲得的藥物成分的藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中包含了8個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，221 個(gè)活性化合物，632 個(gè)靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)和5127 條邊。通過Cytoscape3.9.1 軟件中的Analyze Networks 分析功能得到度值排名前三的化合物分別是槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和壬酸（Nonanoic Acid）。

3.3 白細(xì)胞減少癥靶點(diǎn)基因的獲取

通過OMIM、DisGeNet 以及Drugbank 數(shù)據(jù)庫篩選并且收集有關(guān)白細(xì)胞減少疾病的靶點(diǎn)基因共1868 個(gè)；轉(zhuǎn)錄組測序獲得白細(xì)胞減少癥小鼠與正常小鼠差異基因664 個(gè)，整合后得到白細(xì)胞減少癥靶點(diǎn)基因共2465 個(gè)。

3.4 核心靶標(biāo)的篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Venny2.1.0 在線作圖工具，得到補(bǔ)中益氣丸藥物-白細(xì)胞減少癥疾病的交集靶點(diǎn)共94 個(gè)（圖1），應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，使用Cytoscape3.9.1 進(jìn)行可視化處理，得到重要核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)（圖2）。根據(jù)“degree”數(shù)值大小進(jìn)行篩選，最終，篩選出的前十位的核心靶點(diǎn)，分別為AKT1、MMP9、IL1β、STAT3、PTGS2、MYC、CCL2、IL10、CREB1、FOS 等靶標(biāo)基因。

圖1 補(bǔ)中益氣丸、白細(xì)胞減少癥與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的白細(xì)胞減少癥致小鼠差異基因交集靶點(diǎn)韋恩圖A：補(bǔ)中益氣丸對(duì)應(yīng)靶標(biāo)基因 B：疾病對(duì)應(yīng)靶標(biāo)基因

圖2 核心靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 GO 功能注釋與KEGG 通路富集分析

本文將收集得到的94 個(gè)潛在靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能注釋以及KEGG 通路富集分析。根據(jù)P 值大小將GO 功能注釋的生物過程（bological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的各前10 條整理為功能富集條形圖（圖3）。結(jié)果顯示，生物過程（BP）主要涉及細(xì)胞對(duì)碳水化合物刺激的反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)控、正向調(diào)控漿細(xì)胞的分化及細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-17 的反應(yīng)等過程；細(xì)胞組成（CC）包括核膜腔、電壓門控鈉通道復(fù)合物、特定顆粒管腔、基質(zhì)膜以及三級(jí)顆粒管腔等；分子功能（MF）主要涉及花生四烯酸12-脂氧合酶活性、G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、CCR5 趨化因子受體結(jié)合及磷脂酶抑制劑活性等功能。補(bǔ)中益氣丸可能通過上述功能來減緩白細(xì)胞減少癥并起到部分升高白細(xì)胞的效果；將潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集共獲得344 條通路（P＜0.05），顯示補(bǔ)中益氣丸治療白細(xì)胞減少癥主要涉及PI3K-Akt 以及多種白介素的信號(hào)通路、免疫細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路，如IL-4、IL-13、IL-17、IL-18信號(hào)通路以及Th17、TNF 信號(hào)通路和JAK-STAT 信號(hào)通路（圖4）。

圖3 GO 生物功能富集分析圖

圖4 KEGG 通路富集分析圖

3.6 分子對(duì)接的驗(yàn)證

將核心靶點(diǎn)與補(bǔ)中益氣丸的主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。通常認(rèn)為結(jié)合能小于－5 kcal/mol 時(shí)結(jié)合性能良好，且結(jié)合能越低結(jié)合性能越好。從對(duì)接結(jié)果得知，活性成分槲皮素（Quercetin）和山奈酚（Kaempferol）與Akt1 結(jié)合度良好，結(jié)合能分別為－6.61 kcal/mol、－7.17 kcal/mol?；钚猿煞稚侥畏樱↘aempferol）與IL-1β 結(jié)合度良好，結(jié)合能為－5.23 kcal/mol。運(yùn)用Pymol 對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析（圖5）。

圖5 分子對(duì)接驗(yàn)證圖

由上述KEGG 通路富集分析表明補(bǔ)中益氣丸的主要活性成分的潛在靶標(biāo)與PI3K-Akt、炎癥以及免疫等相關(guān)信號(hào)途徑相關(guān)。分子對(duì)接驗(yàn)證也表明補(bǔ)中益氣丸中關(guān)鍵活性成分槲皮素和山奈酚與Akt1、IL-1β 等核心靶點(diǎn)結(jié)合度良好。已知蛋白激酶（Akt）是一種原癌基因，為PI3K/AKT/mTOR 等多種信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，在調(diào)控細(xì)胞功能包括增殖、轉(zhuǎn)錄和代謝時(shí)發(fā)揮著重要作用[20]。研究表明PI3K/Akt/mTOR 對(duì)維持造血干細(xì)胞的自我更新具有重要作用，PI3K/Akt 的過度激活使骨髓造血干細(xì)胞脫離靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入細(xì)胞周期增殖，并離開造血微環(huán)境[21]。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺干預(yù)后，Akt1、PI3K 及pAkt 蛋白表達(dá)水平顯著降低，小鼠的造血功能顯著下降，白細(xì)胞數(shù)目減少，黃芪皂苷可激活PI3K 水平恢復(fù)小鼠骨髓抑制，增強(qiáng)免疫功能[22]。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是白細(xì)胞介素家族的一類細(xì)胞因子，參與體內(nèi)炎癥、免疫及組織修復(fù)。有研究表明，當(dāng)體內(nèi)IL-1β 水平異常時(shí)，代表體內(nèi)的免疫功能出現(xiàn)異常[23]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子，包括IL-1α、IL-1β 及TNF[24]。環(huán)磷酰胺引發(fā)小鼠脊髓損傷出現(xiàn)白細(xì)胞減少癥，小鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子例如IL-1β 來維持體內(nèi)穩(wěn)定免疫功能[25]。

4 結(jié)論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和前期測序結(jié)果初步探究了補(bǔ)中益氣丸改善白細(xì)胞減少癥的作用和機(jī)制，并利用分子對(duì)接方法對(duì)補(bǔ)中益氣丸的主要成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。顯示補(bǔ)中益氣丸的活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)研究較為充分，也表明補(bǔ)中益氣丸通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同治療白細(xì)胞減少癥的作用。但本研究僅對(duì)補(bǔ)中益氣丸治療白細(xì)胞減少癥進(jìn)行了初步的預(yù)測和分析，尚待進(jìn)一步對(duì)補(bǔ)中益氣丸的治療白細(xì)胞減少癥的機(jī)制進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。