鄧幫福，范俊俠，姚麗華，張 哲

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

1 前言

生物體在進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)需要金屬離子作為蛋白質(zhì)的輔助因子[1]。Nramp 蛋白是一種具有典型多肽分子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其跨膜結(jié)構(gòu)域是Nramp 蛋白參與生物體跨膜運(yùn)輸與金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的關(guān)鍵[2，3]。Nramp 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以特異選擇一種或多種金屬來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。目前發(fā)現(xiàn)其可以轉(zhuǎn)運(yùn)Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、As2+和Ni2+等離子。Nramp 蛋白在動(dòng)物中被廣泛研究，主要探究了Nramp 蛋白抗侵染病原微生物作用機(jī)制[4]。Nramp 蛋白也廣泛存在于植物中，它對(duì)植物轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子和維持離子平衡起著重要作用[5]。Nrmap 蛋白在微生物中也具有金屬轉(zhuǎn)運(yùn)活性[6]，釀酒酵母中有3 個(gè)編碼Nramp 家族蛋白的基因：SMF1、SMF2 和SMF3，它們?cè)卺劸平湍钢卸紖⑴c金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。

曲酸是一種主要由米曲霉合成的具有多種生物活性的有機(jī)酸，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、美容等行業(yè)[8，9]。米曲霉曲酸的合成調(diào)控與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KojT 參與轉(zhuǎn)運(yùn)曲酸到胞外[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AoKap4 與KojT 協(xié)同參與曲酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。此外，其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如AoKap1、AoKap2 和NrtA 也被發(fā)現(xiàn)參與曲酸合成[12，13，14]。米曲霉中Nramp 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AoNramp1 已被克隆[4]，但AoNramp1 作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否也會(huì)影響曲酸合成，目前尚無(wú)報(bào)道。

本研究首先利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動(dòng)子構(gòu)建了AoNramp1 過(guò)表達(dá)菌株，然后對(duì)比分析了其與野生型3.042 菌株在不同離子處理下的菌絲生長(zhǎng)情況和孢子數(shù)目形態(tài)。同時(shí)，分析了其對(duì)米曲霉曲酸合成的影響，以期為全面理解米曲霉Nramp家族基因的功能提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 菌株與培養(yǎng)基

米曲霉3.042 菌株（CICC 40092）作為野生型菌株。Czapek-Dox（CD）培養(yǎng)基（2%可溶性淀粉、0.2%NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.05% KCl、0.05%NaCl、0.002% FeSO4，pH 5.5）作為表型觀察和曲酸發(fā)酵的培養(yǎng)基。

2.2 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

以米曲霉3.042 基因組DNA 為模板，使用引物pEX2B-AoNramp1-F/R，通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得AoNarmp1片段。重組質(zhì)粒pEX2B-AoNramp1 是將該片段通過(guò)同源重組連接到線性化的pEX2B 載體[15]。該載體攜帶有米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動(dòng)子和trpC 終止子。PEG 原生質(zhì)體法可將測(cè)序后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到米曲霉3.042 的ΔpyrG 菌株中。PCR 法可驗(yàn)證AoNramp1過(guò)表達(dá)菌。

2.3 聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

米曲霉轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[16]。首先用DPY 培養(yǎng)基（2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.5% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH 5.5）培養(yǎng)米曲霉，30°C 培養(yǎng)20 h 后收集菌絲，用含有50 mM 馬來(lái)酸（pH 5.5）和0.6 M（NH4）2SO4的溶液洗滌2 次，瀝干；然后用過(guò)濾除菌的酶解溶液（50 mM 馬來(lái)酸、1%Yatalase、0.5%Lysing enzymes、0.6 M（NH4）2SO4，pH 5.5）與菌絲混合，60～70 rpm 攪拌，30°C 避光裂解3 h 后，加入等體積的轉(zhuǎn)化溶液（1.2 M sorbitol、50 mM CaCl2·2H2O、35 mM NaCl、10 mM pH=7.5 的Tris-HCl 溶液）搖晃幾次，將上述酶液通過(guò)滅菌的雙層擦鏡紙過(guò)濾，用圓底管收集過(guò)濾液，4° C 離心收集原生質(zhì)體。用轉(zhuǎn)化溶液洗滌原生質(zhì)體一次，再離心收集，放在冰上，備用。將備好的質(zhì)粒（10 μg）與該原生質(zhì)體（200 μL）混勻。冰浴30 min，然后分3 次分別加入250 μL、250 μL、850 μL PEG溶 液（60%PEG 4000、50 mM CaCl2·2H2O、10 mM pH=7.5 的Tris-HCl 溶液）混勻后避光放置20 min。隨后用適量轉(zhuǎn)化溶液終止反應(yīng)；離心收集原生質(zhì)體，倒入適量的Top MM 培養(yǎng)基（0.2%NH4Cl、0.1%（NH4）2SO4、0.05% KCl、0.05% NaCl、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.002% FeSO4·7H2O、2% glucose、0.15% methionine、l.2 M sorbitol、0.8% agar，pH 5.5）混勻，最后將上述Top MM 培養(yǎng)基平鋪在MM 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5 天。

2.4 表型分析

菌株孢子液接種到CD 培養(yǎng)基上，在30 °C 培養(yǎng)3 天后進(jìn)行表型分析。在CD 培養(yǎng)基中分別加入200 μM ZnSO4、200 μM FeSO4、200 μM MnSO4、200 μM CuSO4用作不同金屬離子處理米曲霉。十字交叉法用于測(cè)定菌絲生長(zhǎng)直徑。洗孢液（0.025%Tween 80、0.8%NaCl）被用于收集菌落孢子，并通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)目。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.5 RNA 的提取

收集的菌絲樣品經(jīng)液氮處理后研磨成粉末。按照真菌總RNA 提取試劑盒（Omega，R6840）說(shuō)明書(shū)提取總RNA。

2.6 表達(dá)量分析

提取的RNA 用gDNA Eraser（TaKaRa）去除基因組DNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）進(jìn)行qPCR，使用的定量試劑盒是SYBR Green PCR Kit（TaKaRa）。米曲霉Histone H1基因（AO090012000496）作為內(nèi)參基因。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

2.7 曲酸含量的測(cè)定

將100 μL 米曲霉菌株的分生孢子懸浮液（108個(gè)/mL）接種到含有40 mL 改良CD 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中；在30°C 下培養(yǎng)7 天后，收集上清液，用FeCl3顯色法[4]測(cè)定曲酸的濃度（mg/mL）；取0.5 mL 發(fā)酵液，與1 mL FeCl3-HCl 溶液（0.06 M FeCl3、0.27 M HCl）混合，然后加0.5 mL 雙蒸水混勻后，使用酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）在500 nm 處測(cè)定混合液的吸光度；用雙蒸水代替曲酸發(fā)酵液作為對(duì)照組；依據(jù)上述顯色反應(yīng)體系繪制曲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～0.4 mg/ml）；利用測(cè)定的混合液吸光度和曲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出曲酸的濃度。同時(shí)，收集培養(yǎng)7 天后菌絲體，并在65 °C 下干燥至恒重，曲酸的含量（mg/mL·g）等于曲酸的濃度除以生物量。

3 結(jié)果與討論

3.1 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉生長(zhǎng)的影響

為了研究AoNramp1 在米曲霉生長(zhǎng)中的作用，本文利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動(dòng)子構(gòu)建了2 株AoNramp1 過(guò)表達(dá)菌株：OE-1 和OE-8（圖1AC）?；虮磉_(dá)分析顯示，相對(duì)于野生型，OE-1 和OE-8 中AoNramp1 的表達(dá)提高了28 倍（圖1B）。為了探究在金屬離子處理下過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉生長(zhǎng)的影響，本文選用200 μM ZnSO4、200 μM FeSO4、200 μM MnSO4、200 μM CuSO4分別處理了野生型WT、OE-1 和OE-8 菌株。相比之下，過(guò)表達(dá)AoNramp1菌株比野生型菌株的的菌絲生長(zhǎng)直徑明顯變?。▓D1C，D）；而且過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株的濕重比野生型菌株的小（圖1E）。Zn2+處理增加野生菌株的濕重，而Zn2+對(duì)過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株的濕重?zé)o明顯促進(jìn)作用，表明AoNramp1 基因與Zn2+相關(guān)。而Cu2+對(duì)野生型菌株和過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株的濕重都有明顯抑制作用。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)AoNramp1 抑制了米曲霉菌絲生長(zhǎng)，而Zn2+促進(jìn)了米曲霉菌絲生長(zhǎng)，且AoNramp1 與Zn2+有關(guān)。

圖1 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉生長(zhǎng)的影響：（A）利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)AoNramp1 基因的示意圖；野生型（WT）與AoNramp1 過(guò)表達(dá)菌株（OE-1 和OE-8）中的AoNramp1基因表達(dá)水平（B），在不同金屬處理下的菌絲生長(zhǎng)情況（C）和生長(zhǎng)直徑（D）及菌絲濕重（E）

3.2 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉孢子生長(zhǎng)的影響

在與上文同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，本文研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株的孢子數(shù)顯著少于野生型菌株（圖2A，B），但不同金屬離子對(duì)孢子形成的影響是不一樣的。Cu2+會(huì)抑制米曲霉孢子的形成，而Zn2+、Fe2+、Mn2+則能促進(jìn)米曲霉孢子的形成，其中Mn2+顯著促進(jìn)野生型菌株產(chǎn)孢子，而Fe2+顯著促進(jìn)過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株產(chǎn)孢子（圖2A，B），這說(shuō)明過(guò)表達(dá)AoNramp1 影響Fe2+、Mn2+對(duì)米曲霉孢子形成。孢子大小測(cè)試結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株顯著大于野生型菌株的孢子直徑（圖2C）。

圖2 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉孢子形成的影響：不同金屬處理后的野生型菌株（WT）與AoNramp1 過(guò)表達(dá)菌株（OE-1 和OE-8）的孢子顯微形貌（A）、孢子數(shù)量（B）、孢子直徑（C）

3.3 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉菌球生長(zhǎng)的影響

在與上文同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，本文研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AoNramp1 菌株的菌球直徑顯著大于野生型菌株（圖3 A，B），其中Fe2+、Cu2+對(duì)過(guò)表達(dá)AoNramp1菌株的菌球直徑增大效果較為顯著。菌球的干重分析結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)AoNramp1 與野生型菌株無(wú)顯著性差異（圖3C）。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)AoNramp1增加了米曲霉在液體培養(yǎng)基中的菌球直徑，且Fe2+、Cu2+的促進(jìn)效果最為明顯，但沒(méi)有影響米曲霉的生物量。

3.4 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉曲酸合成的影響

為了研究AoNramp1 對(duì)米曲霉曲酸合成的影響，本文將WT、OE-1 和OE-8 的孢子液接種在液體CD 曲酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C 培養(yǎng)7 天。曲酸能夠與Fe3+發(fā)生顯色反應(yīng)生成紅色復(fù)合物，從而定性分析菌株的曲酸合成情況。研究結(jié)果顯示AoNramp1過(guò)表達(dá)菌株比野生型菌株的顯色明顯較淺（圖4A），這表明過(guò)表達(dá)AoNramp1 抑制了曲酸的合成。AoNramp1 過(guò)表達(dá)菌株比野生型菌株的曲酸合成量顯著減少（圖4B）。曲酸合成相關(guān)基因kojA、kojR、kojT的表達(dá)分析表明，相對(duì)于野生型，過(guò)表達(dá)AoNramp1菌株中的基因表達(dá)量都顯著下調(diào)（圖4C-E）。這些結(jié)果表明，AoNramp1 可能是通過(guò)抑制曲酸合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制米曲霉曲酸的合成。這種抑制作用可能來(lái)自Zn2+的影響[17-19]。

圖4 過(guò)表達(dá)AoNramp1 對(duì)米曲霉曲酸合成的影響：野生型菌株（WT）與AoNramp1過(guò)表達(dá)菌株（OE-1 和OE-8）所產(chǎn)的曲酸顯色反應(yīng)（A），曲酸含量（B）；野生型與AoNramp1過(guò)表達(dá)菌株中曲酸合成相關(guān)基因kojA（C）、kojR（D）和kojT（E）的表達(dá)水平

4 結(jié)論

總之，本文研究表明過(guò)表達(dá)AoNramp1 會(huì)抑制米曲霉菌絲的生長(zhǎng)，而Zn2+會(huì)促進(jìn)米曲霉菌絲的生長(zhǎng)，且AoNramp1 與Zn2+有關(guān)；過(guò)表達(dá)AoNramp1 使得米曲霉孢子數(shù)減少、孢子直徑增大，且Cu2+作用最為明顯；過(guò)表達(dá)AoNramp1 增加了米曲霉在液體培養(yǎng)基中的菌球直徑，且Fe2+、Cu2+的促進(jìn)效果最為明顯，但不影響米曲霉的生物量；AoNramp1 可能是通過(guò)抑制曲酸合成相關(guān)基因kojA、kojR、kojT 的表達(dá)來(lái)抑制米曲霉曲酸的合成。本研究為理解Nramp 蛋白在米曲霉生長(zhǎng)和曲酸合成中的作用提供了一定的參考。