朱曜良，田 丁，吳志新,2，陳孝煊,2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心，武漢 430070)

1868年，LANGERHANS[1]在人的皮膚中發(fā)現(xiàn)了一種常駐的樹枝狀形態(tài)的細(xì)胞并將其命名為朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells，LCs)，朗格漢斯細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)的一類樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DCs)。LCs特異性分布于哺乳動物的皮膚和其它黏膜組織中，在機(jī)體抗病原感染過程中作為專職抗原提呈細(xì)胞，攝取、加工處理并遞呈抗原給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫反應(yīng)[2]。LCs的直接前體細(xì)胞是一種高表達(dá)髓系分化抗原Gr-1分子的單核細(xì)胞，且集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor-1 receptor，CSF-1R)、生長轉(zhuǎn)化因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等一系列可溶性細(xì)胞因子在LCs的遷移、發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-5]。LCs的表面標(biāo)志物主要由主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)，CD1a，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和Langerin/CD207組成[6]。LCs對抗原的攝取加工需要表達(dá)Langerin/CD207，一種參與伯貝克顆粒(Birbeck granule)形成的C型凝集素[7]。CD207是Ⅱ型跨膜糖蛋白，為LCs特征性膜表面分子標(biāo)記，因此CD207的表達(dá)也被廣泛應(yīng)用于朗格漢斯細(xì)胞的鑒定[8]。

關(guān)于哺乳動物L(fēng)Cs的研究已較為深入，而在硬骨魚類中，鮮有關(guān)于LCs的研究報道。近年來，由于缺乏魚類特異性CD207抗體，人源CD207多克隆抗體被普遍應(yīng)用于硬骨魚類LCs的鑒定。LOVY等[9]在孢子蟲感染的大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)的鰓中發(fā)現(xiàn)了LCs。隨后，在安大略鱒(Salmosalar)、虹鱒(O.mykiss)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinusfontinalis)以及多種輻鰭亞綱(Actinopterygii)魚類的頭腎及脾臟中也發(fā)現(xiàn)了LCs[10-13]。最近，WANG等[14-15]利用透射電鏡和人源CD207多克隆抗體在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)脾臟、頭腎和草魚脾臟中分別觀察到了LCs及其特征性標(biāo)志物-伯貝克顆粒(Birbeckgranule)，證明了黃顙魚和草魚體內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞的存在。

本實驗室在前期的工作中制備了草魚CD207多克隆抗體，可以特異性識別組織和細(xì)胞水平的內(nèi)源性CD207蛋白[16]。目前草魚體內(nèi)LCs的分布及其特征性基因CD207的功能尚未闡明，本研究利用草魚CD207多克隆抗體對LCs在草魚相關(guān)免疫組織的分布情況進(jìn)行鑒定，結(jié)合qPCR技術(shù)對CD207在感染中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，從而探討LCs在草魚抗病原免疫過程中的功能，為后續(xù)深入研究草魚LCs及其它樹突狀細(xì)胞亞群的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用魚

實驗草魚(Ctenopharyngodonidella)于2021年9月購自湖北省黃岡市團(tuán)風(fēng)縣百容水產(chǎn)良種有限公司。選取每尾體質(zhì)量(200～300)g的健康草魚，在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)3周(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖教學(xué)實驗中心)，水溫(26±2)℃。期間按體質(zhì)量的4%投喂商業(yè)飼料(湖北海大集團(tuán))，飼料營養(yǎng)成分主要包括32%粗蛋白，13%粗灰分，1.6%賴氨酸，4%粗脂肪。每日更換1/3的水并清潔殘余的飼料殘渣。

1.1.2 實驗試劑

LPS(E.coli055:B5，L6529)、PolyI:C(P9582)、Percoll分離液購自Sigma公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor 555標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自武漢愛博泰克公司，DAPI染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)astPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)草魚CD207的胞外區(qū)片段作為抗原免疫新西蘭大白兔(Oryctolaguscuniculus)，制備草魚CD207多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)其效價為1∶128 000，可識別組織和細(xì)胞水平分別對應(yīng)的內(nèi)源性蛋白，特異性較高[16]。

AIM液：含有47.5 mL L-15培養(yǎng)基，2.5 mL雙抗，2.5 μg/mL兩性霉素B和25 μg/mL慶大霉素，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞原代培養(yǎng)基：含有44.5 mL L-15培養(yǎng)基，0.5 mL雙抗，5 mL胎牛血清(FBS)，2.5 μg/mL兩性霉素B和25 μg/mL慶大霉素，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 引物列表

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取CD207(GenBank:GBKA01017435.1)、β-actin(GenBank:M25013)基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計CD207、β-actin的特異性引物。引物序列見表1，引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物堿基序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers

1.2 免疫熒光

(1)取材固定：分別取草魚頭腎、鰓、皮膚、腸道的新鮮組織塊，避免牽拉、挫傷與擠壓，組織體積不超過1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入4%多聚甲醛固定液固定24 h。將組織從固定液中取出，在通風(fēng)櫥中用手術(shù)刀修平整，放入脫水盒內(nèi)。

(2)脫水、透明、浸蠟：采用從低濃度到高濃度逐級升高的梯度乙醇對組織塊進(jìn)行脫水，然后浸入二甲苯中將組織塊透明，脫水透明后的組織塊在熔化的石蠟包埋劑中浸蠟。

(3)包埋、切片、脫蠟至水：將完成浸蠟的組織塊放入包埋框內(nèi)包埋，于-20 ℃凍臺冷卻，將預(yù)冷的蠟塊固定在石蠟切片機(jī)上切4 μm厚度切片，將切片在攤片機(jī)的溫水(45 ℃)上攤平，放置65 ℃烤片機(jī)上烤1 h，再放置烘箱內(nèi)烘烤2 h，之后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水，最后蒸餾水洗。

(4)抗原修復(fù)、畫圈、血清封閉：切片置于盛滿乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)緩沖液(pH 8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加牛血清白蛋白(BSA)孵育30 min。

(5)加兔抗草魚CD207一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加1∶200(體積比)稀釋的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。

(6)加Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加1∶200(體積比)稀釋的二抗，避光室溫孵育50 min。

(7)DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。

(8)自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。

(9)封片：玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

(10)鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像或熒光顯微鏡下拍照。(DAPI紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍(lán)光；Alexa Fluor 555激發(fā)波長510～560，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光；DAPI染細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光)。

1.3 草魚頭腎白細(xì)胞的分離和處理

在無菌條件下取出草魚頭腎，AIM液中浸泡，用無菌注射器橡膠塞輕輕按壓通過200目(70 μm)細(xì)胞篩。向15 mL離心管中依次加入51% Percoll分離液、34% Percoll分離液、過細(xì)胞篩的單細(xì)胞懸液，800g室溫離心20 min后，吸取界面層之間的“白膜層”細(xì)胞，無菌PBS洗滌兩次，加入細(xì)胞原代培養(yǎng)基重懸并調(diào)整密度為1×106cells/mL備用。

參考WANG等[17]和SU等[18]的方法，實驗組白細(xì)胞分別加入終濃度為100 μg/mL的LPS和終濃度為50 μg/mL的PolyI:C，對照組白細(xì)胞加入等量無菌PBS溶液，處理12 h，每組設(shè)置三個重復(fù)。

1.4 草魚CD207基因的表達(dá)分析

采用相對定量的方法對草魚CD207基因經(jīng)不同抗原處理后的表達(dá)量進(jìn)行測定。分別離心收集步驟1.3處理所得細(xì)胞，草魚頭腎白細(xì)胞總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄，以及熒光定量PCR(qPCR)分別參照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR qPCR Master Mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt方法計算各組相對表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參基因，并進(jìn)行顯著性差異分析。“*”表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

1.5 草魚CD207蛋白的表達(dá)分析

將步驟1.3處理后所得細(xì)胞樣品分別與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)在金屬浴中100 ℃處理10 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡檢測，采用半干法，將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，首先加入5% 脫脂奶粉封閉2 h，然后用相應(yīng)抗體(CD207多抗和β-actin內(nèi)參抗體)與PVDF膜室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜15 min，重復(fù)4次；最后用HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗室溫孵育50 min；TBST緩沖液洗膜10 min，重復(fù)3次后將ECL化學(xué)發(fā)光液覆蓋在膜上，置于化學(xué)發(fā)光成像儀中成像。ImageJ軟件(National Institutes of Health)進(jìn)行灰度分析，并進(jìn)行顯著性差異分析。“*”表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P<0.05時為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，Adobe Illustrator 2020修圖。采用SPSS 24.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 朗格漢斯細(xì)胞在草魚相關(guān)免疫組織分布情況

通過免疫熒光技術(shù)，在草魚的頭腎(圖1a)，鰓的鰓小片(圖1c)，皮膚的表皮及真皮(圖1e)和腸道固有層(圖1h)中均發(fā)現(xiàn)CD207陽性細(xì)胞(紅色)的存在。免疫熒光顯示LCs具有腎形或橢圓形的細(xì)胞核，頭腎中LCs的胞體呈不規(guī)則形狀突起，而鰓、皮膚、腸道中LCs的胞體則呈橢圓形。此外，LCs的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有CD207蛋白的分布。

2.2 LPS、PolyI:C分別處理對CD207基因表達(dá)的影響

qPCR的結(jié)果顯示，在處理12 h后，LPS(圖2a)、PolyI:C(圖2b)均能夠誘導(dǎo)草魚CD207基因相對表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)。

2.3 LPS、PolyI:C分別處理對CD207蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果顯示，LPS(圖3a)、PolyI:C(圖3b)均能夠誘導(dǎo)CD207蛋白表達(dá)量增多。ImageJ進(jìn)行灰度分析，顯示CD207蛋白相對表達(dá)量均發(fā)生顯著上調(diào)，β-actin為內(nèi)參蛋白。

圖1 草魚頭腎、鰓、皮膚和腸道中的CD207陽性細(xì)胞Fig.1 CD207 positive cells in head kidney，gill，skin and intestine of C.idellaa～b：頭腎；c～d：鰓；e～g：皮膚；h～i：腸道；I：鰓小片；Ⅱ：表皮；Ⅲ：真皮；Ⅳ：固有層；Ⅴ：腸腔。圖中箭頭所示為CD207陽性細(xì)胞。

圖2 實時熒光定量PCR檢測LPS、PolyI:C對草魚CD207基因相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of LPS and PolyI:C on the relative mRNA expression of CD207 gene in C.idella detected by qPCR“*”為差異顯著(P<0.05)。下同。

圖3 LPS、PolyI:C對草魚CD207蛋白相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of LPS and PolyI:C on relative expression of CD207 protein in C.idella

3 討論

3.1 草魚朗格漢斯細(xì)胞在相關(guān)免疫組織的分布情況

樹突狀細(xì)胞在連接微生物病原體入侵機(jī)體所產(chǎn)生的先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵性橋梁作用，且樹突狀細(xì)胞各個亞群的形態(tài)、表面表型分子、組織分布和生物學(xué)功能也不盡相同[19]。LCs作為主要分布于黏膜免疫組織的樹突狀細(xì)胞亞群，已成為病原體通過黏膜入侵機(jī)體和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的研究熱點(diǎn)[20]。頭腎作為硬骨魚類所獨(dú)有的重要免疫器官，其中分布有大量的白細(xì)胞(包括單核細(xì)胞)[21]，而LCs也由單核細(xì)胞分化而來，免疫熒光顯示LCs在草魚的頭腎中分布，這提示頭腎可能是LCs的發(fā)生場所之一。

皮膚、鰓和腸道組成了硬骨魚類黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosal associated lymph tissue，MALT)。這些組織富含黏膜層，與外部水環(huán)境直接接觸，構(gòu)成了魚體免疫系統(tǒng)的第一道免疫防線[22]。魚類皮膚中包含大量的黏液細(xì)胞和各類免疫細(xì)胞，與多種免疫相關(guān)因子形成了抵御病原微生物感染的“額外器官”[23]。免疫熒光定位LCs在存在于草魚皮膚的表皮和真皮中，表明LCs是魚類皮膚免疫系統(tǒng)的組成部分，也為后續(xù)深入解析魚類皮膚免疫的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)資料。和皮膚黏膜類似，魚類的鰓也是與水環(huán)境相互作用密切的黏膜器官。鰓中分布的各類免疫細(xì)胞，可以在病原體入侵機(jī)體時參與抗原攝入和激活免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]。免疫熒光顯示LCs分布于草魚鰓的鰓小片中，提示草魚患鰓部疾病時，LCs能夠識別呈遞抗原，參與草魚機(jī)體的免疫監(jiān)視。硬骨魚類缺乏腸道相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphoid tissues，GALT)，如派爾集合淋巴結(jié)(Peyer patch)等，但是腸道固有層和上皮中含有大量的免疫細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等[25]。免疫熒光顯示LCs分布于草魚腸道固有層，這說明當(dāng)顆粒狀或大分子抗原入侵草魚腸道時，來自腸腔的抗原經(jīng)由腸上皮層包裹處理，后傳遞到腸道固有層，通過LCs的識別、加工和呈遞給淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。

開展魚類黏膜免疫中的抗原攝取、遞呈和后續(xù)免疫反應(yīng)的研究，完善黏膜免疫的應(yīng)答機(jī)制，可以改善漁用疫苗的實驗效果[26]。本實驗鑒定了LCs在草魚相關(guān)免疫組織的分布情況，豐富了草魚樹突狀細(xì)胞亞群的研究內(nèi)容，同時為黏膜疫苗的研發(fā)以及水產(chǎn)疫苗浸泡免疫的研究和推廣等提供基礎(chǔ)理論資料。

3.2 草魚朗格漢斯細(xì)胞特征性基因CD207的功能分析

LCs在系統(tǒng)早期的細(xì)菌感染起到關(guān)鍵作用[27]，CD207能識別病原體表面碳水化合物結(jié)構(gòu)(如甘露糖、巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺)，將抗原肽與MHC分子結(jié)合形成抗原肽-MHC復(fù)合體，從而呈遞抗原參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答[28]。VANDER等[29]發(fā)現(xiàn)人LCs能通過CD207攝取麻疹病毒(measles virus，MV)抗原并呈遞給特異性CD4+T細(xì)胞以維持人體穩(wěn)態(tài)。VANDEN等[30]也證明CD207促進(jìn)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)轉(zhuǎn)移并刺激LCs及部分樹突狀細(xì)胞亞群成熟，從而誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的增殖活化。這表明LCs可以通過表達(dá)其特征性分子標(biāo)記物CD207，在攝取、加工處理、呈遞抗原進(jìn)而引發(fā)特異性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，抗細(xì)菌、病毒感染方面都有不可忽視的作用。

原代培養(yǎng)細(xì)胞仍然保留部分甚至全部同在體細(xì)胞一樣的生理功能特性，細(xì)胞仍然保持高度的分化性以及功能性，因此原代培養(yǎng)細(xì)胞被認(rèn)為可以取代動物活體開展部分生命科學(xué)研究[31]。而且免疫刺激硬骨魚的細(xì)胞模型后，各種免疫基因表達(dá)水平的快速反應(yīng)也已被多方證實[32]。在培養(yǎng)魚類原代細(xì)胞過程中，使用L-15原代細(xì)胞培養(yǎng)基(含10% FBS)同時維持培養(yǎng)基pH為7.0～7.4，并放置于28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，從而保持細(xì)胞在離體條件下的生理功能完整性，也避免了因細(xì)胞生長代謝受到抑制而引起的胞內(nèi)mRNA的降解[33]。

免疫熒光顯示LCs在草魚頭腎中分布，為排除正常體內(nèi)自體調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)可能產(chǎn)生的整體因素影響，本實驗對草魚頭腎白細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，為天然免疫基因CD207的功能分析提供了可行工具。利用LPS、PolyI：C分別處理草魚頭腎白細(xì)胞，結(jié)果顯示CD207的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均有顯著性上調(diào)(P<0.05)。這表明在細(xì)菌或病毒入侵機(jī)體時，草魚LCs可以通過上調(diào)CD207的表達(dá)，識別并呈遞外源性抗原，參與到草魚的適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中，提示草魚LCs的特征性基因CD207表現(xiàn)出與哺乳動物CD207分子同系物相似的免疫功能。對草魚CD207分子的研究，將有助于我們更好地了解LCs在硬骨魚類免疫系統(tǒng)中的作用，為養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性、病毒性疾病的防控提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上，本實驗利用免疫熒光鑒定出LCs在草魚的頭腎，皮膚的表皮和真皮，腸道固有層和鰓的鰓小片中分布。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法和qPCR對LPS、PolyI:C處理后草魚頭腎白細(xì)胞中的CD207表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CD207的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均有顯著性上調(diào)。結(jié)果表明，LCs分布于草魚相關(guān)免疫組織中，特別是黏膜相關(guān)淋巴組織，可以通過表達(dá)CD207參與到草魚抗細(xì)菌、病毒等外源性抗原的免疫反應(yīng)中去。