李屹錚，張帥帥，劉雪巍，張 冉，林鑫輝，張 猛，王 磊，于 淼，喬志剛，江紅霞

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)453007)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)廣泛分布于中國(guó)、日本及越南等東南亞國(guó)家淡水水域，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物。近些年來(lái)，由于日本沼蝦自然資源銳減，集約化人工養(yǎng)殖被大力發(fā)展，然而隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)增加，日本沼蝦出現(xiàn)了性早熟、個(gè)體小、商品率低等種質(zhì)退化現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展[1]。因此，研究日本沼蝦性腺發(fā)育規(guī)律，對(duì)其性腺尤其是卵巢發(fā)育進(jìn)行人工調(diào)控，是對(duì)其進(jìn)行人工繁殖和育種，改良其種質(zhì)的基礎(chǔ)。目前，眼柄摘除法是廣泛應(yīng)用的水產(chǎn)甲殼動(dòng)物卵巢促熟的常規(guī)方法[2,3]，但是眼柄摘除也會(huì)危害甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)，縮短其蛻皮周期，增加能量需求，降低卵子質(zhì)量，并使其死亡率升高[4]，因此，尋找新的人工調(diào)控甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育的方法勢(shì)在必行。而從分子水平上尋找甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育相關(guān)基因，通過(guò)調(diào)控這些基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)或抑制其卵巢發(fā)育已成為該研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。

核糖體蛋白(ribosomal protein,RP)家族是核糖體的結(jié)構(gòu)蛋白，在生物體蛋白合成中具有極其重要的作用。核糖體蛋白S3a(RPS3a)是真核細(xì)胞核糖體蛋白40S小亞基組分，在40S亞基與起始因子和mRNA結(jié)合以及80S亞基與延伸因子結(jié)合中起重要作用，參與翻譯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡[5,6]。此外，RPS3a蛋白被證實(shí)還具有調(diào)節(jié)生物體卵巢發(fā)育作用，例如，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)RPS3a基因表達(dá)被反義基因抑制時(shí)，黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)卵巢發(fā)育受到抑制，并導(dǎo)致其產(chǎn)卵失敗[7]；RPS3a基因在岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)卵巢中高表達(dá)，并在其卵子發(fā)生過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[8]；沉默RPS3a基因表達(dá)會(huì)阻止非滯育期淡色庫(kù)蚊(Culexpipiens)的卵巢發(fā)育，并使其進(jìn)入滯育狀態(tài)[9]；用墨吉對(duì)蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)重組RPS3a蛋白孵育其卵巢外植體會(huì)刺激卵巢發(fā)育相關(guān)基因-蝦卵巢圍食膜因子(SOP)和翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)基因表達(dá)[10]：另外，RPS3a也是雜交長(zhǎng)白母豬(Susscrofadomestica)卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因，它在其卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中表達(dá)下調(diào)[11]。但迄今為止，對(duì)日本沼蝦卵巢RPS3a基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

大量的研究表明，在甲殼動(dòng)物中，5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)可以通過(guò)其X-器官竇腺系統(tǒng)神經(jīng)激素合成和釋放來(lái)調(diào)控它們的卵巢發(fā)育[12-14]，但關(guān)于5-HT和DA對(duì)日本沼蝦卵巢發(fā)育作用的研究迄今為止也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究克隆得到了日本沼蝦RPS3a基因的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為MnRPS3a基因，并分析了該基因的序列特征及其在日本沼蝦不同組織和不同發(fā)育階段卵巢中的表達(dá)模式。為了進(jìn)一步研究MnRPS3a基因在日本沼蝦卵巢發(fā)育中的作用，本研究還檢測(cè)了日本沼蝦注射5-HT和DA后其卵巢中MnRPS3a和卵黃蛋白原(Vg)基因的表達(dá)變化，最后還進(jìn)行了MnRPS3a蛋白在日本沼蝦不同發(fā)育階段卵巢中的定位分析。本研究旨在為理解甲殼類(lèi)動(dòng)物RPS3a基因在其卵巢發(fā)育中的作用，從而在分子水平上尋找人工調(diào)控甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育的新方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 日本沼蝦不同組織和不同發(fā)育階段卵巢組織的采集

本實(shí)驗(yàn)中所用日本沼蝦購(gòu)自新鄉(xiāng)市水產(chǎn)品市場(chǎng)，體長(zhǎng)為(4.5±0.5) cm，體重為(3.5±1.0) g，暫養(yǎng)于河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖水溫25～30 ℃，每天早晚各投喂商品飼料1次，1周換水1次。挑選卵巢發(fā)育處于Ⅰ期的健康雌蝦，冰浴麻醉，采集其不同組織(眼柄、胃、卵巢、肝胰腺、鰓和肌肉)。挑選卵巢發(fā)育處于不同發(fā)育階段的健康雌蝦，冰浴麻醉，采集其不同發(fā)育階段(Ⅰ-Ⅵ期)的卵巢組織(Ⅰ期：卵原細(xì)胞增殖期；Ⅱ期：卵黃發(fā)生前期；Ⅲ期：初級(jí)卵黃發(fā)生期；Ⅳ期：次級(jí)卵黃發(fā)生期；Ⅴ期：成熟期；Ⅵ期：衰退期)樣品。每種實(shí)驗(yàn)樣品均采集5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品獲取后立即放入液氮中保存，以備后續(xù)RNA提取。

1.1.2 5-HT和DA刺激實(shí)驗(yàn)中日本沼蝦卵巢組織的采集

將大小均一、卵巢發(fā)育處于Ⅲ期的健康日本沼蝦(4.5±0.5 cm,3.5±1.0 g)分為3組，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別肌肉注射5-HT(Sigma，美國(guó))和DA(Sigma，美國(guó))，注射量為50 μg/g體重，對(duì)照組注射相同體積的PBS，分別在注射后的0、12、24、48、72和96 h，每組隨機(jī)選取5尾蝦，取其卵巢組織樣品，立即放入液氮中保存，以備后續(xù)RNA提取。

1.2 總RNA提取

按照total RNA kit Ⅱ(Omega Bio-Tek，美國(guó))說(shuō)明，分別提取日本沼蝦不同組織、不同發(fā)育階段的卵巢組織、以及注射5-HT和DA后不同時(shí)間點(diǎn)的卵巢組織樣品總RNA。RNA的完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度及純度用NanoDrop 2000超微分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))檢測(cè)。

1.3 cDNA合成

使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa，大連)，以日本沼蝦卵巢組織總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，-20 ℃保存，以備MnRPS3a核心片段的克隆。另取卵巢總RNA，使用SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa，大連)試劑盒，分別合成5′和3′RACE-ready cDNA，以備MnRPS3a5′和3′兩端片段的克隆。遵循Prime Script@RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒的說(shuō)明對(duì)日本沼蝦各樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成的cDNA以備實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

1.4 MnRPS3a基因cDNA克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(NCBI SRA登錄號(hào)：SRP063589)得到的MnRPS3a基因片段，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)MnRPS3a中間核心片段引物(表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得MnRPS3a核心片段，經(jīng)純化、克隆后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)獲得的核心片段序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)用于5′和3′端擴(kuò)增。5′和3′端RACE-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按SMARTer RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，大連)試劑盒說(shuō)明設(shè)置。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的5′和3′端序列與中間核心片段序列拼接后得到MnRPS3a全長(zhǎng)cDNA序列。

1.5 MnRPS3a生物信息學(xué)分析

使用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)確定基因的開(kāi)放閱讀框；使用在線(xiàn)網(wǎng)站http://www.expasy.org/tools/推測(cè)翻譯的蛋白質(zhì)分子式、分子量及等電點(diǎn)，并分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線(xiàn)網(wǎng)站http://www.dabi.temple.edu/disphos/和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/分別預(yù)測(cè)蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn)；利用PSORTII(http://psort.nibb.ac.jp/)預(yù)測(cè)核定位信號(hào)；使用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析各物種RPS3a氨基酸序列相似性；利用Clustal X2進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)；利用MEGA 5.0以鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 基因表達(dá)分析

MnRPS3a基因在日本沼蝦不同組織和不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達(dá)，以及注射5-HT和DA后不同時(shí)間點(diǎn)卵巢組織中的MnRPS3a和Vg基因表達(dá)均利用qRT-PCR法進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用LightCycler 96(Roche，瑞士)進(jìn)行基因qRT-PCR分析，反應(yīng)體系(10 μL)為：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TliRNaseH Plus)(2×) 5 μL、正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 3.2 μL。qRT-PCR條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。以β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR過(guò)程中所用的各引物序列見(jiàn)表1。基因的相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示，使用SPSS 20.0軟件和Duncan法進(jìn)行顯著性分析和多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

表1 日本沼蝦MnRPS3a引物序列Tab.1 Primer sequences of MnRPS3a gene

1.7 MnRPS3a蛋白在日本沼蝦卵巢組織中的定位

解剖獲取成蝦Ⅰ-Ⅴ期卵巢組織，PBS洗滌后，在4%的多聚甲醛中固定24 h，使用梯度酒精脫水和二甲苯逐級(jí)透明后用石蠟包埋，制作成4 μm厚的石蠟切片。對(duì)一部分切片進(jìn)行HE染色，用以觀(guān)察不同時(shí)期卵巢的發(fā)育階段。未經(jīng)HE染色的切片利用免疫熒光(IF)技術(shù)進(jìn)行MnRPS3a蛋白在日本沼蝦卵巢組織中的定位分析，將切片常規(guī)脫蠟后置于EDTA抗原修復(fù)液中，高火加熱8 min至沸騰，室溫冷卻8 min后，中高火再加熱8 min，再自然冷卻至室溫；滴加山羊血清封閉液(原液用PBS按1∶9稀釋)，37 ℃孵育30 min。滴加1∶100稀釋的兔多克隆抗體一抗(Cat:GTX124922，Proteintech，美國(guó))，4 ℃過(guò)夜。然后37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗 5 min×3次；滴加DyLight 488熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(Cat:A23220，Abbkine，美國(guó))，稀釋比例為1∶100，37 ℃ 孵育45 min。PBS洗5 min×3次；滴加DAPI染色液，室溫孵育3 min。PBS清洗，抗熒光淬滅封片劑封片后，用熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 MnRPS3a基因cDNA全長(zhǎng)和氨基酸序列分析

MnRPS3a基因cDNA序列(圖1)全長(zhǎng)902 bp，5′端非編碼區(qū)53 bp，3′端非編碼區(qū)48 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF區(qū))801 bp，編碼266個(gè)氨基酸(AA)。MnRPS3a氨基酸序列含有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)糖基化位點(diǎn)，在其C端有一個(gè)核定位信號(hào)“KKGLNKAGKKGSKKK”。推測(cè)MnRPS3a蛋白分子質(zhì)量為30.06 kDa，理論等電點(diǎn)為9.78。該基因序列已提交至GenBank，獲得序列號(hào)為：MK575884。

圖1 MnRPS3a基因全長(zhǎng)cDNA序列及其所編碼的氨基酸(AA)序列Fig.1 cDNA sequence and amino acid sequence of RPS3a gene of M.nipponense下劃線(xiàn)指示ORF區(qū)的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，灰色背景部分為poly A加尾信號(hào)(AATAAA)，黑色三角(▲)指示預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)，“*”指示預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)，虛線(xiàn)指示核定位信號(hào)。

2.2 MnRPS3a氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將MnRPS3a氨基酸序列與其它物種RPS3a氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果顯示，MnRPS3a與其它比對(duì)物種RPS3a序列相似性介于63%～86%之間，并與墨吉對(duì)蝦RPS3a氨基酸序列相似性最高，達(dá)到85.71%。利用Clustal X2軟件將MnRPS3a氨基酸序列與其它無(wú)脊椎動(dòng)物RPS3a氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果(圖2)顯示，各無(wú)脊椎動(dòng)物RPS3a氨基酸序列的C端均具有一個(gè)核定位信號(hào)。利用Expasy在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)了MnRPS3a蛋白的三維結(jié)構(gòu)，該蛋白含有34.21% α-螺旋，18.42% β-折疊和47.37%無(wú)規(guī)則卷曲(圖3)，比對(duì)的其他無(wú)脊椎動(dòng)物同樣具有這些α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)(圖2)。利用MEGA5.0軟件構(gòu)建各物種RPS3a蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)，顯示日本沼蝦RPS3a與同屬于甲殼動(dòng)物的墨吉對(duì)蝦RPS3a在進(jìn)化樹(shù)中聚為一支，親緣關(guān)系最近。

圖2 MnRPS3a與其它無(wú)脊椎動(dòng)物RPS3a氨基酸序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple comparison of RPS3a amino acid sequences between M.nipponense and other invertebrates使用Clustal X2進(jìn)行多重序列比對(duì)，橙色框內(nèi)為核定位信號(hào)，紅色框內(nèi)為α-螺旋區(qū)，藍(lán)色框內(nèi)為β-折疊區(qū)，各無(wú)脊椎動(dòng)物RPS3a NCBI登錄號(hào)見(jiàn)圖4。

圖3 MnRPS3a蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of tertiary structure of MnRPS3a protein

圖4 各物種RPS3a系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 NJ phylogenetic tree based on RPS3a amino acid sequences of various organisms

2.3 MnRPS3a基因的組織表達(dá)

MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢日本沼蝦不同組織中的表達(dá)水平見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，MnRPS3a基因在所測(cè)組織中均有表達(dá)，其在肌肉中表達(dá)量最高，并且顯著高于其它各組織，其在胃中的表達(dá)量最低，但其在卵巢組織中的表達(dá)量與眼柄、肝胰腺和鰓相比并無(wú)顯著差異。

2.4 MnRPS3a基因在不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達(dá)

MnRPS3a基因在日本沼蝦不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達(dá)結(jié)果(圖6)顯示，該基因表達(dá)量隨著卵巢的發(fā)育呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。該基因在Ⅰ期卵巢中的表達(dá)量最高，且顯著高于其它各期卵巢，其次是Ⅱ和Ⅲ期卵巢，Ⅱ期和Ⅲ期卵巢中的表達(dá)量顯著高于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期卵巢，Ⅵ期卵巢中MnRPS3a基因表達(dá)量最低。

圖5 MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢的日本沼蝦不同組織中的表達(dá)特征Fig.5 MnRPS3a gene expression in different tissues of M.nipponense with stage Ⅰ ovary E：眼柄；S：胃；H：肝胰腺；O：卵巢；G：鰓；M：肌肉；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.5 5-HT和DA刺激對(duì)卵巢組織中MnRPS3a與Vg基因表達(dá)的影響

如圖7A所示，注射5-HT 24 h后，MnRPS3a表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增加，注射5-HT 48、72和96 h后，MnRPS3a表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著增加。整體來(lái)看，注射5-HT后，卵巢中MnRPS3a表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì)；注射DA 48 h后，MnRPS3a在日本沼蝦卵巢中的表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著降低(P<0.01)，注射DA 72和96 h后，MnRPS3a表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低。5-HT和DA注射后Vg基因表達(dá)變化見(jiàn)圖7B。注射5-HT 48 h后，Vg基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增加，注射5-HT 72和96 h后，Vg基因表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著增加。整體來(lái)看，注射5-HT后，卵巢中Vg基因表達(dá)量與MnRPS3a表達(dá)量一致，也呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)；注射DA 72和96 h后，Vg基因表達(dá)量與對(duì)照組相比分別顯著和極顯著降低。

圖6 MnRPS3a基因在日本沼蝦不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)特征Fig.6.MnRPS3a gene expression in different ovarian development stages of M.nipponenseⅠ：Ⅰ期卵巢；Ⅱ：Ⅱ期卵巢；Ⅲ：Ⅲ期卵巢；Ⅳ：Ⅳ期卵巢；Ⅴ：Ⅴ期卵巢；Ⅵ：Ⅵ期卵巢。

圖7 注射5-HT和DA后MnRPS3a(A)和Vg(B)基因在日本沼蝦卵巢中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of MnRPS3a(A) and Vg(B) genes in ovary after M.nipponense were injected with 5-HT and DA“*”表示顯著性差異(P<0.05)，“**”表示極顯著性差異(P<0.01)。

2.6 MnRPS3a蛋白在日本沼蝦卵巢組織中的定位

HE染色及IF檢測(cè)結(jié)果(圖8)顯示，日本沼蝦Ⅰ期卵巢中大部分為卵原細(xì)胞，少部分為卵黃生成前期卵母細(xì)胞(圖8-a)，Ⅱ期卵巢中主要為卵黃生成前期卵母細(xì)胞(圖8-b)，Ⅰ期和Ⅱ期卵巢的卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均無(wú)MnRPS3a蛋白合成信號(hào)，而它們周?chē)臑V泡細(xì)胞中顯示出MnRPS3a蛋白的高活性合成信號(hào)(圖8-f，8-g)；Ⅲ期卵巢中主要為卵黃生成期卵母細(xì)胞，卵黃顆粒位于卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的外圍(圖8-c)，而在卵黃顆粒生成的部位即卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的外圍顯示出MnRPS3a蛋白的高活性合成信號(hào)(圖8-h)；Ⅳ期卵巢中主要為卵黃生成后期卵母細(xì)胞，卵黃顆粒幾乎遍布整個(gè)卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖8-d)，MnRPS3a蛋白的合成信號(hào)也遍布Ⅳ期卵巢卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，但合成信號(hào)較弱(圖8-i)；Ⅴ期卵巢中主要為成熟期的卵母細(xì)胞，卵黃顆粒也幾乎布滿(mǎn)整個(gè)卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖8-e)，但整個(gè)細(xì)胞中都沒(méi)有檢測(cè)到MnRPS3a蛋白的合成信號(hào)(圖8-j)。

圖8 卵巢組織切片觀(guān)察及Ⅰ-Ⅴ期卵巢中MnRPS3a蛋白定位的IF檢測(cè)Fig.8 Observation of ovarian tissue sections and IF detection of MnRPS3a protein localization in ovaries at stage Ⅰ-Ⅴ

3 討論

了解與性腺發(fā)育相關(guān)基因的功能與作用對(duì)于控制日本沼蝦的生殖發(fā)育至關(guān)重要。一些報(bào)道表明核糖體蛋白基因在生物體的卵巢發(fā)育中具有重要作用，例如小鼠(Musmusculus)卵母細(xì)胞中Rps26基因敲除會(huì)導(dǎo)致卵泡從竇前卵泡到竇卵泡的發(fā)育遲緩，最后導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡和卵巢早衰[15]；褐稻虱(Nilaparvatalugens)RPL5基因被RNA干擾后阻滯了其卵巢發(fā)育，并減少了其產(chǎn)卵量[16]；用墨吉對(duì)蝦重組RPL10a蛋白孵育其卵巢外植體會(huì)刺激卵巢成熟相關(guān)基因表達(dá)[17]，且墨吉對(duì)蝦活體注射重組RPL10a蛋白后會(huì)促進(jìn)其卵黃生成和早期卵巢發(fā)育[18]；RPL24基因在日本沼蝦卵巢早期發(fā)育階段高表達(dá)，該基因表達(dá)被RNAi沉默后其卵巢發(fā)育被延遲，產(chǎn)卵率下降[19]，克氏原螯蝦RPS24基因在其Ⅰ期卵巢中的表達(dá)量最高，其次是Ⅱ期和Ⅳ期卵巢，可能與其卵原細(xì)胞分化和卵母細(xì)胞成熟分裂的啟動(dòng)有關(guān)[20]。為進(jìn)一步研究核糖體蛋白家族基因?qū)θ毡菊游r卵巢發(fā)育的作用，本研究從日本沼蝦卵巢中克隆得到了MnRPS3a基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步的探究。

3.1 MnRPS3a基因序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究中，MnRPS3a基因以及其他無(wú)脊椎動(dòng)物RPS3a基因所編碼的氨基酸序列的C端均具有一個(gè)核定位信號(hào)。以往的研究表明墨吉對(duì)蝦RPL10a[17]和日本沼蝦RPL24[19]氨基酸序列中也具有核定位信號(hào)，說(shuō)明這些核糖體蛋白均是在細(xì)胞質(zhì)中合成，然后在核定位信號(hào)的指引下進(jìn)入細(xì)胞核的核仁處與rRNA一起進(jìn)行組裝，裝配形成的核糖體再?gòu)募?xì)胞核的核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，這與它們作為一種核糖體的結(jié)構(gòu)蛋白而參與蛋白質(zhì)生物合成的基本作用是一致的。將MnRPS3a與其他生物RPS3a氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)它與同為十足目甲殼動(dòng)物墨吉對(duì)蝦RPS3a氨基酸序列相似性最高，親緣關(guān)系也最近，并在進(jìn)化樹(shù)上與無(wú)脊椎動(dòng)物RPS3a聚于一支，這些研究結(jié)果都與日本沼蝦的分類(lèi)地位相一致。

3.2 MnRPS3a基因表達(dá)分析

核糖體蛋白基因轉(zhuǎn)錄在機(jī)體的各組織中廣泛分布。在無(wú)脊椎動(dòng)物的研究中，褐稻虱RPL5基因[16]和日本沼蝦RPL24基因[19]在所檢測(cè)的各種組織中均有表達(dá)，但均在卵巢組織中表達(dá)量最高。本研究中，MnRPS3a基因也在所檢測(cè)的日本沼蝦的8個(gè)組織中均有分布，這與以上研究結(jié)果一致，說(shuō)明這些核糖體蛋白基因?yàn)榉墙M織特異性基因。但在本研究中，MnRPS3a基因在日本沼蝦肌肉組織中的表達(dá)量最高，然后是肝胰腺，再次為卵巢，這又與以上研究結(jié)果不一致，說(shuō)明不同的核糖體蛋白在不同物種的組織分布具有一定的差異性。在不同發(fā)育階段的卵巢組織中，MnRPS3a在Ⅰ期卵巢中的表達(dá)量最高，并隨著卵巢發(fā)育其表達(dá)量逐漸降低，說(shuō)明該基因在日本沼蝦早期卵巢發(fā)育階段起較大作用。研究表明墨吉對(duì)蝦RPS3a[10]、日本沼蝦RPL24[19]和克氏原螯蝦(Procambrusclarkii)RPS24基因[20]均在卵巢發(fā)育的早期階段高表達(dá)，在卵巢發(fā)育晚期階段表達(dá)量較低。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，推測(cè)MnRPS3a蛋白可能與墨吉對(duì)蝦RPS3a、日本沼蝦RPL24和克氏原螯蝦RPS24蛋白一樣，是一種早期卵巢發(fā)育的刺激因子。

3.3 MnRPS3a基因的功能分析

研究表明，5-HT和DA對(duì)甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育具有重要的作用。例如，5-HT會(huì)促進(jìn)淡水蟹Travancorianaschirnerae、BarytelphusaGuerini和克氏原螯蝦的卵巢發(fā)育，而DA則會(huì)抑制它們的卵巢發(fā)育[12-14]。甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育過(guò)程伴隨著卵黃的不斷生成，卵黃不僅是卵子的重要結(jié)構(gòu)成分，還是甲殼動(dòng)物胚胎發(fā)育的重要能量和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。甲殼動(dòng)物卵黃的主要成分為卵黃蛋白(Vn)，其前體為卵黃蛋白原(Vg)。甲殼動(dòng)物Vg合成的位置存在爭(zhēng)議，一種認(rèn)為Vg是由卵巢以外的器官(肝胰腺和脂肪體等)合成，然后通過(guò)卵黃蛋白原受體(Vgr)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用從血淋巴帶入卵母細(xì)胞[21,22]，還有一種認(rèn)為Vg是在卵巢內(nèi)產(chǎn)生的[23,24]。然而，也有研究表明，日本沼蝦[2]和克氏原螯蝦[25]等的肝胰腺和卵巢都是Vg的合成部位。本研究中，日本沼蝦注射5-HT后24～96 h的卵巢中MnRPS3a表達(dá)量和注射5-HT后48～96 h的Vg基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高；而在注射DA后48～96 h的卵巢中MnRPS3a的表達(dá)量和注射DA后72～96 h的Vg基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低。由于隨著5-HT和DA注射后卵巢中MnRPS3a基因表達(dá)升高和降低，Vg基因的表達(dá)量也升高和降低，推測(cè)MnRPS3a可能通過(guò)調(diào)控Vg的合成而參與日本沼蝦卵黃的生成作用，從而在其卵巢發(fā)育過(guò)程中起重要作用。

本研究IF檢測(cè)結(jié)果也表明MnRPS3a蛋白可能參與卵黃顆粒的形成。研究表明，濾泡細(xì)胞參與無(wú)脊椎動(dòng)物卵巢發(fā)育過(guò)程中多種蛋白的合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至卵母細(xì)胞[26-28]。本研究中Ⅰ和Ⅱ期卵巢組織濾泡細(xì)胞中有很強(qiáng)的MnRPS3a蛋白合成信號(hào)，這可能是由于Ⅰ和Ⅱ期卵巢組織分別主要由卵原細(xì)胞和卵黃生成前期卵母細(xì)胞組成，卵黃顆粒尚未生成，這時(shí)在濾泡細(xì)胞中大量合成MnRPS3a蛋白，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)入卵母細(xì)胞，從而為隨后卵母細(xì)胞中卵黃顆粒蛋白的形成需要大量的核糖體做準(zhǔn)備；對(duì)泥蚶(Tegillarcagranosa)[29]和糙海參(Holothuriascabra)[30]的卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究表明，卵黃生成期的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線(xiàn)粒體、核糖體等多種細(xì)胞器參與卵黃的合成，且核糖體密集分布在胞質(zhì)中。而MnRPS3a蛋白合成信號(hào)定位于Ⅲ期卵巢卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的外周和Ⅳ期卵巢卵母細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，即定位于這兩期卵巢中的卵母細(xì)胞的卵黃顆粒的生成部位，由此推測(cè)MnRPS3a蛋白可能用于合成大量的核糖體從而參與卵黃顆粒蛋白的生成；Ⅴ期卵巢中卵母細(xì)胞已完全成熟，不再需要卵黃顆粒的生成，同時(shí)MnRPS3a蛋白的合成信號(hào)也消失。本研究中，MnRPS3a蛋白的合成信號(hào)基本上是隨著卵巢從Ⅰ期到Ⅴ期的發(fā)育由強(qiáng)逐漸變?nèi)?，這與MnRPS3a基因在日本沼蝦不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)特征基本一致。但日本沼蝦MnRPS3a蛋白與卵巢中卵黃的生成有關(guān)的推測(cè)還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究克隆得到了日本沼蝦MnRPS3a基因的全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)其表達(dá)分析和蛋白的定位分析，推測(cè)MnRPS3a基因可能直接或間接參與日本沼蝦卵巢中卵黃的生成從而對(duì)其卵巢發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，并在其早期卵巢發(fā)育階段起重要的作用，但其具體作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步的研究確定。