梅 瑜，王繼華，蔡時(shí)可

（1廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣州 510640；2廣東省道地南藥資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，廣州 510640）

0 引言

金線蓮Anoectochilus sp.(Wall.)Lindl，別名金線蘭、金線虎頭蕉、鳥(niǎo)人參和金不換等，以全草入藥，性味甘、平，入肝、脾、腎三經(jīng)，具有清熱涼血、消炎解毒和強(qiáng)心利尿等功效，屬于珍稀名貴的中藥材，享有“藥中之王”美稱[1-2]。金線蓮為蘭科開(kāi)唇蘭屬草本植物，主要分布于中國(guó)、日本、斯里蘭卡、印度和尼泊爾等東南亞國(guó)家，在中國(guó)的臺(tái)灣、福建和廣東等地區(qū)有人工標(biāo)準(zhǔn)化種植[3-4]，金線蓮的藥用價(jià)值逐漸得到人們的認(rèn)可，市場(chǎng)需求日益增加[5]。金線蓮喜陰涼濕潤(rùn)環(huán)境，適宜生長(zhǎng)溫度為18-25oC，對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻，我國(guó)華南地區(qū)高溫早且時(shí)間長(zhǎng)，人工種植的金線蓮因高溫難以越夏，高溫嚴(yán)重制約著金線蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前金線蓮在耐熱機(jī)制的研究還較少，主要集中在栽培和種苗培育方面。高溫脅迫影響植物生長(zhǎng)、品質(zhì)和產(chǎn)量，植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)一直以來(lái)也是研究的熱點(diǎn)[6]。高溫脅迫對(duì)植物的傷害機(jī)制研究較多，主要集中在生理和生化方面的研究，其中高溫對(duì)葉綠體膜的傷害較為直接[6-7]。近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄技術(shù)解析植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)日益增多，如茶樹(shù)、壇紫菜和玉米等[8-10]。并且和代謝組、蛋白組組學(xué)結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析‘鄭單958’和‘先玉335’兩個(gè)主要玉米品種在響應(yīng)花粒期高溫脅迫下基因表達(dá)及代謝物差異，挖掘玉米響應(yīng)高溫脅迫的關(guān)鍵基因及代謝物聯(lián)合解析其耐熱機(jī)制[10]。本研究所用的金線蓮(NYJ2)是前期篩選出來(lái)的耐熱資源，比較高溫脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組變化有利于解析其耐熱機(jī)制[11]。但是，金線蓮的遺傳背景還不清晰，分子生物方面的研究比較薄弱，基因組和轉(zhuǎn)錄組也還未報(bào)道。因此，本研究對(duì)高溫脅迫前后的金線蓮葉片進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用Denovo對(duì)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝和比對(duì)分析。通過(guò)對(duì)組裝出的unigene進(jìn)行表達(dá)量注釋和功能注釋(GO、KEGG、KOG)，并對(duì)高溫脅迫前后的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類、KEGG通路富集分析，來(lái)揭示其功能差異，這有利于高溫脅迫下差異表達(dá)基因調(diào)控機(jī)制的研究和耐熱基因的挖掘。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所篩選出的耐熱金線蓮(NYJ2)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理方法 馴化后的NYJ2組培苗定植于裝有泥炭土:蛭石=1:1的4×4 cm培養(yǎng)缽內(nèi)，放于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)條件為晝溫/夜溫(12h/12h)25℃/18℃，光照強(qiáng)度2000 Lx，相對(duì)空氣濕度(80%+5%)，每天上午定時(shí)澆水一次，每株20 mL。培養(yǎng)15天后，挑選生長(zhǎng)一致的健壯植株進(jìn)行45℃高溫脅迫處理1 h，以處理前樣品為對(duì)照，每處理2個(gè)重復(fù)。取相同部位的葉片，用液氮處理15 min，待葉片冷固后迅速放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葉片總RNA提取 使用TRNzol Reagent試劑盒(Invitrogen?)提取高溫脅迫前后金線蓮4個(gè)樣品的葉片總RNA，通過(guò)1%電泳凝膠檢測(cè)提取RNA的完整性。采用Invitrogen Qubit? 2.0熒光計(jì)及試劑盒(Fluorometer Life Tech Invitrogen，Q32886)對(duì)總 RNA進(jìn)行定量。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)處理 與廣州基迪奧生物科技有限公司合作完成，利用Illumina HiSeqTM2000平臺(tái)測(cè)序。對(duì)得到的原始文件clean reads再進(jìn)行更嚴(yán)格的過(guò)濾，去除adaptor序列、去除N的比例大于10%的序列、去除低質(zhì)量序列，保留下是High quality clean reads。通過(guò)短reads組裝軟件Trinity[12]的denovo，對(duì)High quality clean reads從頭組裝，將具有一定長(zhǎng)度overlap的reads連成更長(zhǎng)的、不含N的組裝片段(Contig)，對(duì)Contig進(jìn)行比對(duì)、連接得到兩端不能再延長(zhǎng)的序列，即為組裝出來(lái)的unigene。

1.2.4 Unigene基本功能注釋 通過(guò)blastx將組裝出來(lái)的unigene序列與Swiss Prot、NR蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，與基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)COG/KOG進(jìn)行比對(duì)，與基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG進(jìn)行比對(duì)（E-value＜0.00001），獲得與unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該unigene的蛋白功能注釋信息。通過(guò)Blast2GO[13]軟件，在NR注釋信息的基礎(chǔ)上得到每個(gè)unigene的GO注釋信息，然后用WEGO軟件[14]對(duì)所有unigene做GO功能分類統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)該物種的基因功能分布特征；根據(jù)KEGG的功能注釋信息獲得unigene的Pathway注釋信息并進(jìn)行代謝通路分析。此外，用軟件ESTScan對(duì)以上數(shù)據(jù)庫(kù)都比對(duì)不上的unigene預(yù)測(cè)其編碼區(qū)及序列方向，得到其編碼區(qū)的核酸序列（序列方向5'-＞3'）和氨基酸序列，獲得unigene的功能域及蛋白家族注釋信息，即編碼蛋白框(CDS)預(yù)測(cè)[15]。

1.2.5 Unigene表達(dá)量分析 采用RPKM（Reads Per kb per Million reads）計(jì)算Unigene的表達(dá)量[16]，得到的基因表達(dá)量可用于不同樣品間的Unigene的差異比較，其計(jì)算見(jiàn)公式(1)：

RPKM表示單個(gè)unigene的表達(dá)量；C表示比對(duì)到這個(gè)unigene的reads數(shù)；N表示比對(duì)到所有unigene的總reads數(shù)；L表示這個(gè)unigene的堿基數(shù)。以熱脅迫前為對(duì)照，進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮的轉(zhuǎn)錄組特征

通過(guò)Illunima HiSeqTM2000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得了金線蓮葉片應(yīng)答高溫脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組信息，4個(gè)金線蓮的轉(zhuǎn)錄組樣本共計(jì)產(chǎn)生38,341,121,400 bp數(shù)據(jù)，獲得255,607,476條reads。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除無(wú)效數(shù)據(jù)，最終4個(gè)金線蓮樣本獲得的Clean reads分別為 52049424、55223682、84465826、54304734，Q20（測(cè)序準(zhǔn)確率＞=99%）百分比在96.14%～96.91%之間，GC百分比在47.73%～49.73%之間，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較好。通過(guò)Trinity組裝軟件將各樣本的clean reads從頭組裝，通過(guò)比對(duì)軟件Bowtie[10]將clean reads與unigene進(jìn)行比對(duì)，得到與4個(gè)金線蓮樣本的參考基因比對(duì)上的reads為51641412～83706916，能夠唯一比對(duì)上參考基因的 reads分別為 43737178、46446403、71481627、45406067，分別占各樣本總數(shù)84.69%、84.84%、85.40%、84.30%；能夠比對(duì)上參考基因的reads分別為1252595、1524775、2169327、1317954，占各樣本總數(shù)的2.43%、2.79%、2.59%、2.45%；不能比對(duì)上的reads分別為6651639、6777118、10055962、7139527，占各樣本總數(shù)的12.88%、12.38%、12.01%和13.25%。繼續(xù)將這些reads組裝，4個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組庫(kù)共獲得了75688個(gè)unigene，GC百分比為40.81%，unigene總長(zhǎng)度為64225402 nt，最長(zhǎng)為20118nt，最小長(zhǎng)度為201 nt，平均長(zhǎng)度為848 nt，N50為1448 nt，表明組裝結(jié)果比較理想；其中，長(zhǎng)度在201～999 nt之間的unigene有57198個(gè)，占總基因數(shù)的75.57%，長(zhǎng)度在1000～1999 nt之間的unigene有10828個(gè)，占總基因數(shù)的14.31%，長(zhǎng)度在2000～2999 nt之間的unigene有4620個(gè)，占總基因數(shù)的6.10%，長(zhǎng)度超過(guò)3000nt的unigene有3042個(gè)，占總基因數(shù)的4.02%。

2.2 金線蓮轉(zhuǎn)錄組的注釋

通過(guò)BLASTx軟件，將獲得的unigene依次與NCBI中已公布的Nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)得基因信息進(jìn)行比對(duì)(E-value＜0.00001)，得到與給定unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該unigene的蛋白功能注釋信息。在75688條unigene中，共有28323個(gè)unigene被注釋，占所有unigene的37.42%，另有47365個(gè)unigene未被注釋，占總unigene的62.58%。在被注釋的unigene中，與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的已知編碼蛋白具有同源性的基因有28038個(gè)，占被注釋基因的98.99%，被注釋到Swissprot protein數(shù)據(jù)庫(kù)的unigene有19149個(gè)，占被注釋基因的67.61%，被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因有17532個(gè)，占被注釋基因的61.90%，10108個(gè)unigene被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，占所有被注釋基因的35.69%，被注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的基因有17485個(gè)，占被注釋基因的62.36%。unigene被Nr、Swissprot、KOG、KEGG4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，同時(shí)被4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的unigene有7854個(gè)，被數(shù)據(jù)庫(kù)單獨(dú)注釋的unigene數(shù)目分別為5870個(gè)、104個(gè)、56個(gè)、42個(gè)。金線蓮轉(zhuǎn)錄組中比對(duì)上unigene數(shù)目最多的前10個(gè)物種分別是油棕(Elaeis guineensis)、海棗(Phoenix dactylifera)、野 芭 蕉 (Musa acuminate)、水 稻 (Oryza sativa)、可 可 (Theobroma cacao)、苜 蓿 (Medicago truncatula)、荷 花 (Nelumbo nucifera)、油 菜 (Brassica napus)、葡 萄 (Vitis vinifera)、棉 花 (Gossypium arboretum)，分別占被注釋總數(shù)的18.75%、16.00%、8.41%、7.14%、3.91%、2.74%、2.55%、2.71%、1.88%、2.50%，注釋到其他物種的unigene逐漸減少。

17532個(gè)Unigenes被KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的unigene被歸為25個(gè)蛋白質(zhì)家族中。其中，7830個(gè)unigene注釋到一般性功能預(yù)測(cè)類，這是最大的類群；其次是翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白的unigene有2794個(gè)；信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的unigene有2322個(gè)；RNA的加工修飾的unigene有1537個(gè)；轉(zhuǎn)錄的unigene有1443個(gè)；蛋白翻譯的unigene有1384個(gè)；細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的unigene有1219個(gè)；25個(gè)蛋白家族中有17個(gè)蛋白質(zhì)家族的unigene數(shù)目超過(guò)500個(gè)；而被歸類到細(xì)胞流動(dòng)性、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的unigene較少，分別為15、60和90。

10108個(gè)unigenes被KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，5727個(gè)unigene被注釋到128個(gè)KEGG Pathway中，其中，有512個(gè)unigene被注釋到核糖體通路中，是數(shù)目最多的；其次是被注釋到碳代謝通路，有396個(gè)unigene；346個(gè)unigene注釋到氨基酸的生物合成通路；262個(gè)unigene注釋到淀粉和蔗糖的代謝通路；其他通路被注釋的基因富集數(shù)目逐漸減少。Gene Ontology(GO)是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，從宏觀上表述基因產(chǎn)物的功能，其功能體系涵蓋生物學(xué)的三個(gè)方面：分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)Nr注釋信息，利用Blast2GO[13]軟件對(duì)unigene進(jìn)行GO注釋信息，在此基礎(chǔ)上用WEGO軟件[14]對(duì)unigene進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果有17485個(gè)unigene被注釋到47個(gè)GO terms中。其中，被注釋到生物學(xué)過(guò)程的unigene最多，為37170個(gè)，尤其是代謝過(guò)程(10139 unigenes)、細(xì)胞過(guò)程(9284 unigenes)和單有機(jī)體過(guò)程(6412 unigenes)；其次是被注釋到細(xì)胞組分途徑的unigene有32535個(gè)，以細(xì)胞(8115 unigenes)、細(xì)胞部分(8112 unigenes)和細(xì)胞器(6724 unigenes)為主；而注釋到分子功能過(guò)程的基因較少(19889 unigenes)，主要是結(jié)合捆綁條目(9180 unigenes)和催化活性條目(8730 unigenes)。

另外，通過(guò)MISA軟件對(duì)所有unigene進(jìn)行搜索，在75688個(gè)序列中，共鑒定出7026個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR），其中975個(gè)序列至少含有1個(gè)SSR位點(diǎn)，如表1。

表1 SSR類型統(tǒng)計(jì)表

2.3 金線蓮應(yīng)答高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析

利用FPKM值檢測(cè)樣品的重復(fù)性，比較樣品間表達(dá)量的相關(guān)性。熱處理前后樣品的皮爾森相關(guān)系數(shù)(r)為0.9117和0.9373，表明同一處理的兩次平行之間的相關(guān)性良好。通過(guò)比較高溫脅迫處理樣本的葉片unigene的表達(dá)水平（FDR＜0.05且差異倍數(shù)1.5倍以上）。對(duì)照樣本和高溫脅迫處理樣本共有777個(gè)unigene被差異表達(dá)，其中有362個(gè)unigene在高溫脅迫后表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，有415個(gè)unigene表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。

通過(guò)對(duì)基因注釋結(jié)果的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)與光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)相關(guān)的基因和3個(gè)葉綠體基因rbcL(Unigene0012214、Unigene0023 0681、Unigene0010382)、CAT 編碼基因(Unigene002 1709)、GAPDH基因(Unigene0055305)、2個(gè)PLD基因(Unigene0026596、Unigene0036040)、CYP 編碼基因(Unigene0030805)等，其中光系統(tǒng)Ⅱ的3個(gè)基因和CYP編碼基因在高溫脅迫后下調(diào)，其余基因均顯著上調(diào)。此外，MBL基因(Unigene0007875)、Sporamin B基因(Unigene0018863)、PI基因(Unigene0005251)、ZFP 編碼基因的表達(dá)在高溫脅迫后顯著上調(diào)；液泡鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、吲哚乙酸氨基化合成酶基因基因、膜相關(guān)激酶調(diào)節(jié)因子基因均下調(diào)表達(dá)。

2.3.1 高溫脅迫前后差異表達(dá)基因分析 為了進(jìn)一步研究分析高溫脅迫下組間樣本的差異基因的生物學(xué)功能，從中尋找與高溫脅迫相關(guān)的基因，將兩個(gè)比較組中所有的差異基因與GO數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)term進(jìn)行比對(duì)（圖1）。

圖1 差異基因的GO分類及表達(dá)

結(jié)果生物學(xué)過(guò)程((Biological Process)的GO term富集的最多，有620個(gè)terms。按富集基因數(shù)量依次列出較多的10個(gè)terms為：代謝過(guò)程(181 unigenes)、細(xì)胞過(guò)程(158 unigenes)、單一有機(jī)體過(guò)程(142 unigenes)、細(xì)胞代謝過(guò)程(126 unigenes)、有機(jī)物質(zhì)代謝過(guò)程(120 unigenes)、主要代謝過(guò)程(98 unigenes)、單個(gè)有機(jī)體代謝過(guò)程(95 unigenes)、單個(gè)有機(jī)體的細(xì)胞過(guò)程(93 unigenes)、高分子代謝過(guò)程(77 unigenes)、細(xì)胞高分子代謝過(guò)程(57 unigenes)。其次是分子功能(Molecular Function，216 terms)富集，基因數(shù)量較多的10個(gè)term為：催化活性(169 unigenes)、結(jié)合綁定(155 unigenes)、有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合綁定(84 unigenes)、雜環(huán)化合物結(jié)合(80 unigenes)、離子結(jié)合(64 unigenes)、陽(yáng)離子綁定 55 unigenes)、水解酶活性(53 unigenes)、氧化還原酶活性(49 unigenes)、轉(zhuǎn)移酶活性(45 unigenes)、小分子結(jié)合綁定(41 unigenes)等。

富集term最少的是細(xì)胞組分(Cellular Component，85 terms)，基因數(shù)量較多的10個(gè)term：細(xì)胞部分(153 unigenes)、細(xì)胞(153 unigenes)、細(xì)胞內(nèi)(145 unigenes)、細(xì)胞內(nèi)部分(142 unigenes)、細(xì)胞內(nèi)膜細(xì)胞器(125 unigenes)、膜旁細(xì)胞器(125 unigenes)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(125 unigenes)、細(xì)胞器(125 unigenes)、膜(83 unigenes)、胞質(zhì)部分(75 unigenes)。

在生物學(xué)過(guò)程中，代謝過(guò)程顯著上調(diào)的基因有105個(gè)，顯著下調(diào)的有76個(gè)；細(xì)胞過(guò)程顯著上調(diào)94個(gè)unigenes，顯著下調(diào)64個(gè)unigenes；單一有機(jī)體過(guò)程顯著上調(diào)基因79個(gè)，顯著下調(diào)基因63個(gè)，其余term逐漸減少。分子功能中，差異基因在催化活性途徑顯著上調(diào)86個(gè)，顯著下調(diào)83個(gè)；在結(jié)合綁定term中顯著上調(diào)87個(gè)，顯著下調(diào)68個(gè)；在膜中顯著上調(diào)49個(gè)，顯著下調(diào)34個(gè)。在細(xì)胞組分中，差異基因在細(xì)胞和細(xì)胞部分兩個(gè)term中顯著上調(diào)的數(shù)目均為92個(gè)，顯著下調(diào)的為61個(gè)；在細(xì)胞器term有68個(gè)unigenes顯著上調(diào)，57個(gè)unigenes顯著下調(diào)；49個(gè)基因在膜中顯著下調(diào)，34個(gè)下調(diào)。

2.3.2 高溫脅迫前后差異表達(dá)基因的KEGG分析 自然界生物體內(nèi)的不同基因相互協(xié)調(diào)的，基于代謝途徑的分析有助于對(duì)基因的生物學(xué)功能進(jìn)一步了解，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析。139個(gè)差異基因被注釋到75個(gè)代謝途徑中，其中光合作用途徑中被注釋的基因最多（27個(gè)），有16個(gè)基因顯著上調(diào)，11個(gè)基因顯著下調(diào)；其次是碳代謝途徑，有23個(gè)基因與碳代謝有關(guān)。從富集前20的代謝途徑中可以看出（圖2），前4個(gè)途徑富集結(jié)果較好，且上調(diào)的基因與光合作用中的生物固碳有關(guān)。CYP81E1/E7、PLD、CHS、CYP、GH3、FabF、FAR、Lhca、LHC、pepA、CAlM、BKI1、JAZ等基因在KEGG途徑的特定階段出現(xiàn)。

圖2 差異基因的KEGG富集結(jié)果

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫下，植物的光合作用途徑、碳代謝途徑、光合固碳作用、代謝途徑、氨基酸代謝途徑、黃酮類代謝途徑、酯類代謝途徑、萜類合成途徑和脂肪酸合成代謝等途徑相關(guān)基因表達(dá)量受影響而變化[17-19]。本研究借助高通量測(cè)序技術(shù)較早的對(duì)高溫脅迫前后的金線蓮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和解析，共獲得75688個(gè)unigene，其中28323個(gè)在數(shù)據(jù)庫(kù)中得到功能注釋。17532個(gè)unigene被KOG數(shù)據(jù)庫(kù)歸類到25個(gè)家族，與128個(gè)Pathway有關(guān)；其中，17485個(gè)unigene被注釋到GO三大功能分類下的47個(gè)條目中。對(duì)比高溫脅迫前后共有777個(gè)基因表達(dá)差異明顯，大部分為光合途徑和抗氧化途徑相關(guān)，KEGG注釋結(jié)果顯示光合作用的差異基因最多。其中與PSⅠ、PSⅡ相關(guān)的基因15個(gè)、3個(gè)葉綠體基因rbcL、2個(gè)PLD基因，CAT編碼基因、GAPDH基因、CYP編碼基因各1個(gè)，除了光系統(tǒng)Ⅱ的3個(gè)基因和CYP編碼基因在高溫脅迫后下調(diào)外，其余基因均顯著上調(diào)。

本研究獲得的psaA(Unigene0004500；Unigene 0047840)和psaB(Unigene0004499)基因是PSⅠ的核心亞基，由它們編碼的蛋白A1和A2是PSⅠ復(fù)合體中心的組成部分，能夠束縛一些還原因子從而減緩上游的移動(dòng)電子到psaC；從PSⅠ到NADP+穿梭電子的鐵硫蛋白為鐵還原蛋白，其復(fù)合體鑲嵌在psaC上，具有電子轉(zhuǎn)移載體的作用，由psaD(Unigene0006392)和psaE(Unigene0013764)翻譯的蛋白能夠協(xié)助電子從鐵還原到PSⅠ[20]，這兩個(gè)基因在高溫脅迫后上調(diào)，而且它們是PSⅠ的受體位點(diǎn)亞基，金線蓮可通過(guò)提高或激發(fā)PSⅠ的功能來(lái)抵御高溫。另外，PSⅡ是應(yīng)答外界脅迫最為敏感的光合系統(tǒng)，參與水的裂解、釋放氧是它的重要功能。本研究共獲得10個(gè)參與PSⅡ的unigene，葉綠體基因psbB、psbC、psbM、psbD參與編碼葉綠素結(jié)合蛋白CP47、反應(yīng)中心蛋白D2，前3個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；有7個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，psbO、psbP、psbQ分別編碼葉綠體類囊體膜放氧復(fù)合體的外周蛋白OEE1、OEE2、OEE3來(lái)維持放氧反應(yīng)[21]；編碼放氧蛋白的3個(gè)基因在高溫脅迫后顯著上調(diào)，與金線蓮的高溫反應(yīng)正相關(guān)，這與溫度脅迫誘導(dǎo)的甘蔗psbO和psbP基因的表達(dá)一致[22]。此外，據(jù)報(bào)道psbR連接psbP和psbQ蛋白組成放氧復(fù)合體[23]；psbY是一種新型的與錳結(jié)合的低分子蛋白質(zhì)，位于PSⅡ外圍，靠近細(xì)胞色素b559的α和β亞基[24]。

本研究中獲得的3個(gè)葉綠體基因rbcL在高溫脅迫后表達(dá)下降，這與學(xué)者在研究高溫脅迫下龍須菜rbcL轉(zhuǎn)錄表達(dá)一致，同時(shí)Rubisco活性降低，當(dāng)使用外源激素SA和MJ50時(shí)，Rubisco活性逐漸恢復(fù)、rbcL繼續(xù)表達(dá)[26]?？赡苡捎趓bcL來(lái)源于葉綠體DNA，屬母性遺傳保守性較高，Rubisco在植物光合作用中具有雙重作用，既有活化Rubisco的活性，也有ATP水解酶的活性[25]。此外，還獲得了3個(gè)磷脂酰膽堿磷脂水解酶D(phospholipaseD，PLD)基因，在高溫脅迫后均差異表達(dá)，據(jù)報(bào)道PLD的水解產(chǎn)物PA能參與植物的熱激反應(yīng)中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，并能積極調(diào)動(dòng)和激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的抗性反應(yīng)來(lái)應(yīng)答逆境[27-29]，YANG等[30]發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下的高山離子芥大量表達(dá)CbPLD基因，其產(chǎn)物P在膜脂降解中有比較重要的作用[31]，推測(cè)該基因可能參與了金線蓮應(yīng)答高溫脅迫的調(diào)控。

作為糖酵解反應(yīng)酶之一，3-磷酸甘油全脫氫酶GAPDH基因緩解外界脅迫導(dǎo)致的氧化脅迫中的作用明顯，在植物抗病和非生物脅迫中具有重要的作用。有研究表明，在擬南芥中GAPCs能夠與PLDδ作用產(chǎn)生H2O2來(lái)抵抗ROS和干旱脅迫，并闡明了膜質(zhì)的信號(hào)傳遞、能量代謝及生長(zhǎng)調(diào)控這三個(gè)途徑的關(guān)系[32]。轉(zhuǎn)ERD15基因的煙草和翦股穎的GAPDH基因干旱脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)，并且與其對(duì)應(yīng)的蛋白的表達(dá)量也顯著增加[8,33-34]。本研究中GAPDH編碼基因在高溫脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)，可見(jiàn)金線蓮抵抗高溫脅迫與該基因密切相關(guān)。熱激蛋白(HSPs)家族的基因?qū)Ω邷?、低溫的非生物脅迫具有明顯的應(yīng)答反應(yīng)，金線蓮中與HSP合成有關(guān)的基因(Unigene0029507、Unigene0052917)，在高溫脅迫后顯著上調(diào)，研究表明HSP家族的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控金線蓮對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)[9,35]。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄組分析是鑒定植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控最為有效和低成本的工具之一，也是非模式植物功能基因組學(xué)研究的重要手段之一，是本草基因組學(xué)重要組成之一。本研究可為蘭科植物分子生物學(xué)研究提供參考。此外，金線蓮資源的收集、保護(hù)、利用，以及種質(zhì)資源創(chuàng)制是今后研究的重點(diǎn)，為金線蓮產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供保障。