于靜，許倩，李芬，牛希躍*

（1.阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心，新疆 阿克蘇 843000；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.塔里木大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；4.塔里木大學(xué) 分析測(cè)試中心，新疆 阿拉爾 843300）

馕在新疆已有兩千多年的歷史，又稱(chēng)之為“胡餅”、“爐餅”，是新疆維吾爾等少數(shù)民族的傳統(tǒng)主食之一[1-2]，其在生活中扮演著重要角色，在新疆有“可以一日無(wú)菜，但絕不可以一日無(wú)馕”的說(shuō)法[3-5]。近年來(lái)，隨著活性干酵母被引入我國(guó)且被廣泛地應(yīng)用于面制品中，傳統(tǒng)酸面團(tuán)逐漸呈現(xiàn)劣勢(shì)[6]。但新疆馕中的酵頭仍被廣泛應(yīng)用于自治區(qū)內(nèi)各大、中、小城市（鎮(zhèn)），主要是由于傳統(tǒng)酸面團(tuán)發(fā)酵的馕口感更優(yōu)，而活性干酵母與傳統(tǒng)酸面團(tuán)相比則口感、風(fēng)味、香氣單一[7-8]。傳統(tǒng)酸面團(tuán)中主要是以酵母菌、乳酸菌為主的多菌種混雜體系[9]，由于各種微生物代謝出不同的物質(zhì)且相互之間能發(fā)生反應(yīng)，從而來(lái)影響面團(tuán)的風(fēng)味、口感和感官品質(zhì)。酵母菌在發(fā)酵面團(tuán)中產(chǎn)生的CO2被面團(tuán)中的面筋包裹而使面團(tuán)體積增大，這也是面團(tuán)疏松多孔的原因；乳酸菌能代謝產(chǎn)生乳酸等多種揮發(fā)性酸而使面制品擁有多種風(fēng)味，并且可以降低面團(tuán)的pH值，同時(shí)產(chǎn)生胞外多糖，能改變食品的流變性。乳酸菌能生成一些抑菌物質(zhì)如細(xì)菌素來(lái)抑制面食中致病菌和腐敗菌的繁殖，以此來(lái)延長(zhǎng)貨架期[10-12]。這些都是活性干酵母所不具備的，因此傳統(tǒng)發(fā)酵劑仍然存在于全國(guó)各地，其制作的面食仍受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。但傳統(tǒng)方式制作面制品存在制作工藝粗放、技術(shù)落后、培養(yǎng)條件不穩(wěn)定、貯藏過(guò)程變質(zhì)明顯等弊端，主要是因?yàn)槲⑸锞翰煌?、衛(wèi)生條件不達(dá)標(biāo)、面團(tuán)中含有有害菌等[13-15]。

目前只有少部分人研究馕中的微生物，并且是研究馕中的酵母菌，而對(duì)馕中微生物的多樣性研究相對(duì)較少。本文對(duì)新疆7個(gè)地區(qū)馕面團(tuán)微生物多樣性進(jìn)行研究，不僅為酸面團(tuán)中微生物的多樣性研究提供初步的理論依據(jù)，也為后續(xù)研究區(qū)域性面食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

酸面團(tuán)樣品從新疆采集，共計(jì)12份，7個(gè)采集地區(qū)見(jiàn)表1。

表1 各地區(qū)采集的酸面團(tuán)樣品Table 1 The sourdough samples collected from different areas

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone glucose agar medium，YPD）培養(yǎng)基：固體加2%瓊脂、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1%酵母膏；WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島日水生物有限公司；MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司；引物27f/1492r、NL1/NL4：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 主要儀器

PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-20bR型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HJ-4A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：江蘇金怡儀器科技有限公司；HPX-9162MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；PowerPac Universal型電泳儀、MYCYCLER型PCR儀及ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（化學(xué)發(fā)光）：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；CX21FS1型生物顯微鏡：日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在無(wú)菌室中稱(chēng)取25 g樣品于225 mL滅菌生理鹽水（0.85%）中，用預(yù)先滅菌的磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杌靹颍ǜ蓸悠穭t預(yù)先用無(wú)菌生理鹽水浸泡），采用10倍梯度稀釋法稀釋至10-7，備用。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

樣品稀釋方法同1.3.1。在無(wú)菌環(huán)境中，取稀釋梯度為10-2～10-4，用滅菌的槍頭從每個(gè)梯度各吸取100 μL均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，在37℃厭氧條件下48 h～72 h培養(yǎng)。在同一個(gè)樣品不同梯度下挑選出不一樣的疑似乳酸菌的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，再進(jìn)行平板劃線(xiàn)純化，經(jīng)過(guò)數(shù)次反復(fù)的劃線(xiàn)純化，革蘭氏染色、鏡檢無(wú)雜菌為止，再進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。將革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性菌初步視為乳酸菌；其余則根據(jù)鏡檢后的形態(tài)及顏色另行歸類(lèi)[16]。

1.3.3 酵母菌的分離純化

選擇稀釋梯度為10-2～10-4的樣液，吸取100 μL均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)48h～72h，在同一個(gè)樣品不同梯度下挑選出不一樣的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，在相同溫度條件下培養(yǎng)24 h～48 h再進(jìn)行平板劃線(xiàn)純化，反復(fù)多次劃線(xiàn)后經(jīng)鏡檢無(wú)雜菌為止。

1.3.4 酵母菌形態(tài)學(xué)的初步認(rèn)定

將1.3.3中獲得的純酵母菌劃線(xiàn)接種到WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5 d～7 d，根據(jù)平板上菌落的顏色與形態(tài)，來(lái)判定酵母菌的類(lèi)別。

1.3.5 DNA提取與PCR擴(kuò)增

細(xì)菌用十二烷基硫酸鈉法，真菌采用凍融法[17]分別提取相應(yīng)菌株的DNA，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，采用細(xì)菌通用引物27f和1492r，PCR反應(yīng)體系（50 μL）如下：10buffer5.0μL，dNTPs2.0μL，正、反引物各 2.0μL，ExTaq 酶 0.5 μL， 模板 DNA2.0μL，dwater 36.5 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。真菌進(jìn)行26S rDNA擴(kuò)增，采用酵母菌擴(kuò)增引物NL1和NL4，PCR反應(yīng)體系（50 μL）如下：10buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，正、反引物各 3.0 μL，ExTaq 酶 0.5 μL，模板 DNA 2.0 μL，dwater 32.5μL。其PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min，4℃保存。

1.3.6 瓊脂糖凝膠電泳、DNA測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

采用2.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，合格后測(cè)序。細(xì)菌和真菌分別登錄Ezbiocloud（http：//www.ezbiocloud.net/）和 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行已知序列的同源性比對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用MEGA5.05軟件進(jìn)行分析，采用鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的基本形態(tài)

2.1.1 乳酸菌的分離純化與鑒定

根據(jù)革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，共得到乳酸菌80株，再依據(jù)菌株在MRS固體上的基本形態(tài)及顏色共挑選出28株菌進(jìn)行測(cè)序鑒定。經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)得到一定量的菌株并提其DNA，以其模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，條帶清晰明亮，片段大小約1500 bp，符合測(cè)序要求。進(jìn)而將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與Ezbiocloud進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。

圖1 部分乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶Fig.1 Amplified products of 16S rDNA sequences of several lactic acid bacteria strain

圖2 基于16S rDNA的乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the lactobacillus strains according to 16S rDNA sequences

結(jié)合圖2可知，處于同一分支上的測(cè)序菌株與比對(duì)菌株的置信度極高，因此，可以得到測(cè)序的23株菌中，乳酸菌有4個(gè)屬7個(gè)種，分別為戊糖乳桿菌13株、副干酪乳桿菌3株、戊糖片球菌2株、類(lèi)食品乳桿菌2株、干酪乳桿菌1株、食竇魏斯氏菌1株及嗜檸檬酸明串珠菌1株。數(shù)量上，戊糖乳桿菌最多，其次是副干酪乳桿菌。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道，酸面團(tuán)中乳酸菌主要是以植物乳桿菌、舊金山乳桿菌及短乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種[18-19]。然而關(guān)于新疆馕面團(tuán)的研究論文中僅有朱曉瑩等[20]研究了馕中的乳酸菌，從其分離的菌株來(lái)看，并未發(fā)現(xiàn)上述3種菌中的任一種。而本次試驗(yàn)結(jié)果也未出現(xiàn)，可以斷定新疆馕中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌與其他地方的存在差異。

不同地區(qū)樣品中乳酸菌的分布情況見(jiàn)表2。

表2 不同地區(qū)樣品中乳酸菌的分布情況Table 2 Distribution of lactobacillus from different samples in different regions

由表2可知，菌種分布最多的是庫(kù)爾勒及阿拉爾，戊糖乳桿菌廣泛存在于7個(gè)地區(qū)，嗜檸檬酸明串珠菌只存在于阿拉爾地區(qū)，是該地區(qū)的特有菌株。

2.1.2 非乳酸菌的分離純化及鑒定

在乳酸菌的篩選過(guò)程中獲得了17株非乳酸菌細(xì)菌，根據(jù)菌株的顏色、形態(tài)和狀態(tài)進(jìn)一步區(qū)分挑選出不相同的菌株5株，并提取其DNA，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳后測(cè)序，將其結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。

圖3 非乳酸菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the non-lactobacillus strains according to 16S rDNA sequences

在17株非乳酸菌中，馬洛姆西桿菌僅伊犁的樣品未發(fā)現(xiàn)，暹羅芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)于庫(kù)爾勒和昌吉地區(qū)，表皮葡萄球菌在庫(kù)爾勒、阿克蘇及阿拉爾樣品中都存在。具體數(shù)量見(jiàn)表3。

表3 非乳酸菌在各地區(qū)的分布Table 3 Distribution of non-lactobacillus stains in various regions

由圖3可知，5株非乳酸菌包含3種菌，分別為（醋酸菌屬）馬洛姆西桿菌3株、表皮葡萄球菌1株、暹羅芽孢桿菌1株。馬洛姆西桿菌屬于醋酸菌的一種，能代謝產(chǎn)生乙醇、二氧化碳及醋酸等物質(zhì)，代謝物能增加面食的風(fēng)味同時(shí)改善面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)，而醋酸可以降低面團(tuán)的pH值從而抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖。暹羅芽孢桿菌尚未了解其特性。表皮葡萄球菌多數(shù)為非致病菌，少數(shù)致病。這表明了傳統(tǒng)酸面團(tuán)中可能存在一些有害細(xì)菌。

2.2 酵母菌的基本形態(tài)

2.2.1 利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)酵母菌的基本分類(lèi)

通過(guò)在WL瓊脂上菌株菌落的形態(tài)顏色觀察，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21-23]比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4、圖4。不同酵母菌在各地區(qū)的分布見(jiàn)圖5。

表4 酵母菌在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)描述Table 4 Description of morphology of the yeasts on WL media

由表 4、圖 4 可知，其中類(lèi)型 5、6、7、9、16、17、18、19可能為釀酒酵母，類(lèi)型2、12可能為畢赤酵母，類(lèi)型15可能為紅酵母，其他類(lèi)型則未提及。將12份樣品經(jīng)過(guò)篩選純化后，共得到229株菌，利用酵母菌在WL培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同顏色進(jìn)行分類(lèi)，從而得到19種類(lèi)型。由圖5可知，其中類(lèi)型5、7、17、18廣泛分布于7個(gè)地區(qū)，類(lèi)型15只存在于庫(kù)爾勒地區(qū)，庫(kù)爾勒地區(qū)酵母菌菌落形態(tài)分布最多，有15種，喀什地區(qū)菌落形態(tài)最少分布最少，只有6種。

圖4 不同菌株在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.4 The morphology of the different strains on WL nutrient agar media

圖5 不同類(lèi)型酵母菌在各地區(qū)的分布Fig.5 Distribution of different morphology of the yeasts in various regions

2.2.2 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)分析

根據(jù)菌落的形狀、顏色、狀態(tài)選取不同的代表菌株33株提取其DNA，并進(jìn)行26S rDNA的D1/D2PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳，條帶大約在600 bp，見(jiàn)圖6，符合測(cè)序要求，檢測(cè)后，將結(jié)果與NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖7。

圖6 部分酵母菌26S rDNA D1/D2 PCR產(chǎn)物Fig.6 Amplified products of the D1/D2 sequences of several yeast strains

圖7 酵母菌基于26S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of the yeast strains according to 26S rDNA

根據(jù)測(cè)序結(jié)果得出： 類(lèi)型 5、6、7、8、9、16、17、18、19鑒定為釀酒酵母；類(lèi)型1鑒定為假絲酵母；類(lèi)型2鑒定為異常威克漢姆酵母；類(lèi)型3、4鑒定為近平滑假絲酵母菌；類(lèi)型10鑒定扣囊復(fù)膜酵母；類(lèi)型11鑒定為克魯維畢赤酵母；類(lèi)型12鑒定為庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母；類(lèi)型13、14鑒定為奧默柯達(dá)菌；類(lèi)型15鑒定為膠紅酵母。鑒定的33株菌中，釀酒酵母18株，假絲酵母1株，異常威克漢姆酵母1株，近平滑假絲酵母菌7株及膠紅酵母6株；乳酸菌80株，共鑒定近平滑假絲酵母菌2株，扣囊復(fù)膜酵母2株，克魯維畢赤酵母1株，庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母3株，奧默柯達(dá)菌4株，膠紅酵母1株，共7個(gè)屬9個(gè)種。

2.2.3 各地區(qū)酵母菌分布情況

酵母菌在各地區(qū)總的分布見(jiàn)表5。

表5 酵母菌在各地區(qū)總的分布Table 5 Distribution of the yeasts in various regions

從表5可以看出，釀酒酵母是分布最廣，數(shù)量最多的菌種，并且在所有地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，這與以往的研究一致。異常威克漢姆酵母也分布較廣，研究發(fā)現(xiàn)，其能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)從而延長(zhǎng)面食的貨架期[24]，這與新疆馕有超長(zhǎng)的食用周期可能存在一定的關(guān)系。膠紅酵母僅存在于庫(kù)爾勒地區(qū)，說(shuō)明是該地區(qū)的特有菌株。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)新疆7個(gè)地區(qū)12個(gè)樣品的研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的酸面團(tuán)菌種區(qū)別較大。主要對(duì)其中的酵母和乳酸菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)論如下：乳酸菌發(fā)現(xiàn)7種，分別為戊糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖片球菌、類(lèi)食品乳桿菌、干酪乳桿菌、食竇魏斯氏菌及嗜檸檬酸明串珠菌，從菌種占的數(shù)量和地區(qū)分布來(lái)看，戊糖乳桿菌和類(lèi)食品乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌；酵母菌發(fā)現(xiàn)9種，分別為假絲酵母、異常威克漢姆酵母、近平滑假絲酵母、釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母、奧默柯達(dá)菌及膠紅酵母，釀酒酵母為優(yōu)勢(shì)菌；非乳酸菌3株，分別為馬洛姆西桿菌、表皮葡萄球菌及暹羅芽孢桿菌。由此可知，傳統(tǒng)酸面團(tuán)菌種組成復(fù)雜多樣，正是其復(fù)雜的微生物菌相致使傳統(tǒng)發(fā)酵面食擁有獨(dú)特的風(fēng)味和口感。本次研究也說(shuō)明了新疆不同地區(qū)不同酸面團(tuán)樣品的微生物存在明顯差異，這為以后的深入研究奠定基礎(chǔ)。