陳 前，申楚翹，程 凱，袁慧倫，葉 樹(shù)，申國(guó)明，江愛(ài)娟

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230031)

心肌梗死是因暫時(shí)或永久性冠狀動(dòng)脈閉塞，導(dǎo)致負(fù)性心肌重構(gòu)、收縮功能障礙、心肌壞死、心律失常，甚至心力衰竭的一種嚴(yán)重的心血管疾病[1]。心肌梗死的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、鈣超載、線粒體紊亂、細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)等。

自噬是普遍存在于真核生物細(xì)胞中的一種生理現(xiàn)象，在高血壓病、心力衰竭、心肌梗死等疾病的發(fā)病方面起著非常重要的作用[2]。研究[3]表明，自噬通過(guò)降解錯(cuò)誤折疊蛋白、減輕線粒體功能障礙和抑制氧化應(yīng)激維持心臟功能并減少心肌損傷。因此，自噬對(duì)心臟穩(wěn)態(tài)和功能至關(guān)重要。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路是介導(dǎo)自噬的經(jīng)典信號(hào)通路，有研究[4]表明，其與心血管疾病的病理進(jìn)程有密切關(guān)系。自噬功能的增強(qiáng)有利于心肌梗死的治療[5]。促進(jìn)心肌梗死中自噬的發(fā)生是緩解心肌細(xì)胞死亡和保護(hù)心功能的一種有效方法。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪、當(dāng)歸兩味中藥組成，功能益氣補(bǔ)血、活血化瘀，用于治療心血管疾病[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡改善心臟病理學(xué)改變。且當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理還可以通過(guò)增加心肌細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激損傷的抵抗力，提供更有效的心臟保護(hù)[8]。還有研究[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬改善線粒體功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡從而改善慢性間歇性低氧小鼠心功能。這些研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以調(diào)節(jié)受損心肌的自噬，起到保護(hù)心臟的作用，但是其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)給藥對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎致心肌梗死大鼠心肌損傷、病理改變和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響，探究其調(diào)節(jié)自噬改善心肌梗死大鼠心肌損傷的作用機(jī)制，為臨床防治心肌梗死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 50只SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雄性，購(gòu)自江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-003]，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，濕度為40%～70%。

1.3 試劑 TTC粉(貨號(hào) T8170)：北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(貨號(hào) A020-2)：南京建成生物工程研究所；肌酸激酶心肌型同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)試劑盒(貨號(hào) JL12296)：上海江萊生物科技有限公司；磷酸化PI3K(phosphorylate PI3K,p-PI3K)兔抗大鼠抗體(批號(hào) BS4605)：美國(guó)Bioworld公司；磷酸化AKT(phosphorylate AKT,p-AKT)兔抗大鼠抗體(批號(hào) 4060S)、磷酸化mTOR(phosphorylate mTOR, p-mTOR)兔抗大鼠抗體(批號(hào) 5536S)、LC3A/B兔抗大鼠抗體(批號(hào) 4108S)、Beclin-1兔抗大鼠抗體(批號(hào) 3495T)、p62兔抗大鼠抗體(批號(hào) 39749T)：美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH(批號(hào) TA-08)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒(貨號(hào) BL520B)：中國(guó)Biosharp公司。

1.4 儀器 病理切片機(jī)(RM2016)：上海徠卡儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡(Eclipse E100)：日本尼康公司；電泳儀(EPS300)：上海天能科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(JS-M6P)：上海培清科技有限公司。

2 方法

2.2 動(dòng)物取材 復(fù)制模型24 h后，用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，從腹主動(dòng)脈取血，隨后取出大鼠心臟，清洗并剔除非心肌組織后用濾紙吸干水分。每組隨機(jī)挑選3只大鼠心臟做TTC染色，取每組剩余大鼠心臟結(jié)扎部位以下部分組織，置于4%多聚甲醛中固定；取大鼠左心室梗死區(qū)組織，置于-80 ℃冰箱備用。

2.3 心肌梗死面積檢測(cè) 取剔除非心肌組織后的心肌組織，自冠狀面切成4～5片2～3 mm厚的切片，放入37 ℃預(yù)溫的2% TTC染液中，染色10～15 min后取出，白色代表梗死組織。采用Image J(1.51J8)分析梗死面積。以白色梗死面積與全切片面積的百分比作為梗死面積。

2.4 心臟的組織形態(tài)觀察 取出用4%多聚甲醛固定的心臟，常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心臟的組織形態(tài)。

2.5 血清LDH和CK-MB檢測(cè) 從腹主動(dòng)脈取血，2 500 r/min離心10 min，取上清液，用生化試劑盒檢測(cè)血清LDH水平，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清CK-MB水平。

2.6 Western blot檢測(cè)心肌組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 從-80 ℃冰箱中取出大鼠心臟，選取左心室梗死區(qū)心臟組織用于提取總蛋白，用BCA對(duì)組織蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5～10 min后，于SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，用TBST洗10 min，共3次，分別與p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin-1的一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過(guò)夜，次日從一抗中拿出條帶，用TBST洗10 min，共3次，然后放入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1.5～2 h。TBST洗10 min，共3次，再加入ECL發(fā)光試劑顯影、定影。以目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參的灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組；D.當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組；E.地爾硫組

表1 5組大鼠心肌梗死面積比較

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組;D.當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組;E.地爾硫組

表2 5組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組；D.當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組；E.地爾硫組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組比較，△P<0.05

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組；D.當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組；E.地爾硫組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組比較，△P<0.05

4 討論

心肌梗死屬于中醫(yī)學(xué)“真心痛”“胸痹”等病范疇，其主要病機(jī)為氣血陰陽(yáng)不足，邪閉心脈，不通則痛[10]?！峨y經(jīng)·十四難》云：“損其肺者，益其氣；損其心者，調(diào)其榮衛(wèi)；損其脾者，調(diào)其飲食?！惫手委熜乇孕耐串?dāng)調(diào)其氣血。當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，方中黃芪大補(bǔ)肺脾之氣，以滋生化之源；當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，兩者合用，氣血雙補(bǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠出現(xiàn)明顯心肌梗死，心肌細(xì)胞破裂、心肌纖維排列紊亂、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且血清CK-MB和LDH水平明顯升高，提示模型復(fù)制成功。當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后，大鼠心肌梗死面積縮小，心肌損傷程度減輕，血清CK-MB和LDH水平降低，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯有明顯改善大鼠心肌梗死的作用。

自噬是一個(gè)高度保守的自我降解過(guò)程，參與心血管疾病等多種疾病，與心肌梗死的發(fā)生密切相關(guān)。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生心肌梗死時(shí)，線粒體中自噬小體受損，心肌細(xì)胞大量凋亡，而適當(dāng)促進(jìn)自噬能清除凋亡的細(xì)胞以保護(hù)受損的心臟。據(jù)報(bào)道[12]，Beclin-1可促進(jìn)脂質(zhì)膜延伸、物質(zhì)募集和自噬體成熟，是心臟中關(guān)鍵的自噬調(diào)節(jié)器。Beclin-1、LC3、p62蛋白參與自噬小體的形成與自噬溶酶體降解的過(guò)程，也因此成為經(jīng)典的自噬標(biāo)志物。自噬小體的減少會(huì)導(dǎo)致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平降低[13]，而p62蛋白由于細(xì)胞無(wú)法正常形成自噬溶酶體并進(jìn)行降解而表達(dá)水平升高[14]。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死后Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平降低，而p62表達(dá)水平升高。這些結(jié)果表明，心肌梗死后自噬功能顯著受損。相反，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可逆轉(zhuǎn)心肌梗死誘導(dǎo)的這些自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的紊亂，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以激活自噬以發(fā)揮其心臟保護(hù)作用。

增強(qiáng)的心肌細(xì)胞自噬可由PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)[15]，PI3K可以在自身磷酸化后活化，將磷脂酰肌醇磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)。PIP3結(jié)合3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1進(jìn)行磷酸化，激活下游分子AKT，而磷酸化AKT的產(chǎn)生會(huì)激活雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)。當(dāng)mTORC1水平上升時(shí)，mTORC1通過(guò)對(duì)Unc-51自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)進(jìn)行抑制性磷酸化，導(dǎo)致無(wú)法啟動(dòng)自噬小體的形成過(guò)程[16-17]。本研究結(jié)果顯示，模型組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明發(fā)生心肌梗死時(shí)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致自噬的形成過(guò)程受到抑制，而當(dāng)歸補(bǔ)血湯能明顯降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，在一定程度上促進(jìn)自噬從而達(dá)到保護(hù)受損心肌的作用。

綜上所述，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬的形成，激活細(xì)胞自噬，從而保護(hù)心肌梗死引起的心肌損傷，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。