梅文馨，胡高斌，彭 輝，經(jīng)文善，黃 龍，于慶生

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)外科研究所,安徽 合肥 230031)

肝纖維化是由飲酒、代謝障礙和病毒等引起的慢性肝損傷的過程，是一種可逆的創(chuàng)傷愈合反應[1]。在肝臟持續(xù)損傷過程中，慢性炎癥和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的持續(xù)積累導致肝實質逐漸被瘢痕組織替代，最終導致肝硬化。許多類型的細胞、細胞因子和miRNA均參與肝纖維化和肝硬化的進程，如庫普弗細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)、血小板源性生長因子、轉化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)[2-3]。肝纖維化的發(fā)展與HSCs的激活密切相關，在肝臟慢性損傷發(fā)展過程中，靜止的HSCs被激活，并進一步分化成肌成纖維細胞，分泌大量以Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白為主的ECM。因此，抑制HSCs的激活成為改善肝纖維化的研究熱點[4]。前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，健脾活血中藥能明顯提升門靜脈高壓合并脾功能亢進脾切除患者術后肝臟血液供應，改善肝功能。因此，筆者推測健脾活血中藥在改善肝功能的同時，能進一步改善肝纖維化。本研究通過細胞實驗觀察健脾活血中藥對HSCs的主要纖維化指標的影響，探究其改善肝纖維化的機制。

1 材料

1.1 細胞與試劑 人HSCs細胞系LX-2(貨號 CC4023)：上海細胞所；高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號 01-052-1ACS)：以色列Biological Industries公司；澳洲胎牛血清(fetal bovine serum, FBS；貨號 10099-141C)、胰蛋白酶(貨號 25200-072)、雙抗[青霉素+鏈霉素(P.S)；貨號 15140-122]：美國Gibco公司；TGF-β1試劑盒(貨號 240-B-002)：美國R&D Systems；一抗內參(GAPDH；貨號 60004-1-Ig)：武漢三鷹生物技術有限公司；一抗[α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA；貨號 380653)、膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ，Col-Ⅰ；貨號 R26615)、膠原蛋白Ⅲ(collagen Ⅲ，Col-Ⅲ；貨號 R23957)：正能生物；二抗山羊抗兔IgG(貨號 ZF-2301)、山羊抗鼠IgG(貨號 ZF-2305)：中杉金橋；熒光二抗山羊抗兔(貨號 A21428)：美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8增強型試劑盒、Triton-100、抗熒光淬滅劑(含DAPI)、SDS裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE電泳液(10×)、Western blot轉膜液、吐溫-20：上海碧云天生物技術有限公司；TBS緩沖液(即用型干粉)：合肥白鯊生物科技有限公司；極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒：山東思科捷生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 轉膜儀、電泳儀(PowerPac 系列)：Bio-Rad；細胞培養(yǎng)箱(3111型)：Thermo；酶標儀(SpectraMax iD3)：美谷分子儀器(上海)有限公司；凍干機(BXXW-LGJ-10)：北京博翔興旺科技；熒光顯微鏡(BX51)：Olympus。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 用含10% FBS、1% P.S的高糖DMEM(完全培養(yǎng)基)將細胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的無菌環(huán)境中，待細胞密度達到90%左右時，吸去原培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗2次，每90 mm培養(yǎng)皿加入1 mL胰酶，在培養(yǎng)箱中孵育1～2 min后，加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打后移入15 mL離心管，5 000 r/min離心5 min，吸去上層培養(yǎng)基，加入2 mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，混勻后分別移入1 mL至新的培養(yǎng)皿中，補足每皿完全培養(yǎng)基至6 mL，混勻后移入培養(yǎng)箱。

2.2 凍干粉制作 健脾活血中藥(黃芪、白術各30 g，黨參、茯苓、當歸、熟地黃、白芍各20 g，川芎、桃仁、紅花各10 g)由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供。將所有藥材放入煎藥壺中，加入1 000 mL純水，浸泡30 min后加熱煎藥，水沸后繼續(xù)煎煮濃縮至100 mL，則最終藥物濃度為1.9 g/mL。冷卻過濾后分裝至90 mm培養(yǎng)皿中，覆蓋保鮮膜，表面戳孔，并放入-80 ℃冰箱冷凍。在真空冷凍干燥機中預冷至-50 ℃，將凝結后的藥液放入凍干機中，真空低溫干燥48 h后制成健脾活血中藥凍干粉(每克凍干粉相當于原藥材9.5 g)，將制作好的凍干粉分裝至凍存管中，-80 ℃冰箱冷凍備用，使用時用完全培養(yǎng)基充分溶解后用0.22 μm濾頭過濾。

2.3 CCK-8檢測LX-2細胞活力 在96孔板中，每孔接種LX-2細胞100 μL，培養(yǎng)過夜后，加入5 ng/mL的TGF-β1誘導48 h，吸去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，待細胞饑餓4 h后，再向每孔加入100 μL含F(xiàn)BS及健脾活血中藥凍干粉的培養(yǎng)基，使每孔最終含10% FBS，分別含有0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL健脾活血中藥凍干粉，培養(yǎng)48 h，每個濃度設3個復孔，實驗重復3次，其中0為對照組。因中藥凍干粉溶解后顏色較深，每3個復孔后均設立1個與上述濃度一致的不含細胞的空白組，實驗結束后向每孔加入20 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育3 h后，酶標儀檢測450 nm處吸光度(optical density,OD)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

2.4 Western blot法檢測健脾活血中藥凍干粉對Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平的影響 用6孔板對細胞進行培養(yǎng)，待細胞密度達80%后，吸去原培養(yǎng)基，PBS清洗2次；對照組只加入完全培養(yǎng)基(高糖DMEM含10% FBS、1% P.S)，模型組加入含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基，中藥組加入含5 ng/mL TGF-β1和1.5 mg/mL健脾活血中藥凍干粉的完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)48 h后，消化，離心，去除培養(yǎng)基；每孔細胞加入100 μL SDS裂解液(含1% PMSF)，冰上裂解30 min后，離心，取上清，進行BCA蛋白定量檢測。按4∶1加入5×上樣緩沖液，100 ℃加熱8 min，將變性后的蛋白樣品按每孔20 μg進行凝膠電泳、轉膜、封閉，加一抗在4 ℃下孵育過夜，加二抗在常溫下孵育1.5 h，每個步驟結束后均用TBST清洗3次，每次5 min，然后使用化學發(fā)光法檢測條帶，并用Image J(1.52a)分析Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA條帶的灰度值。

2.5 免疫熒光法檢測健脾活血中藥凍干粉對Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平的影響 在提前放置好細胞爬片的12孔板中接種(1～2)×105個細胞，培養(yǎng)過夜后按照上述分組依次處理細胞，細胞處理結束后用PBS清洗2次，然后進行固定、通透、封閉，封閉結束后加一抗孵育過夜，加熒光二抗后避光孵育，每個步驟結束后均用PBS清洗3次，每次5 min。封片前在載玻片上滴加1滴含DAPI的抗熒光淬滅劑，細胞面朝下蓋好爬片，用透明指甲油封邊，在熒光顯微鏡下檢測結果，并用Image J(1.52a)分析Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA的熒光表達量。

3 結果

3.1 健脾活血中藥凍干粉對LX-2細胞增殖率的影響 培養(yǎng)48 h后，不同濃度健脾活血中藥凍干粉對LX-2細胞增殖率的影響呈現(xiàn)先促進后抑制的效應，濃度為1.5 mg/mL時LX-2細胞增殖率達到峰值，濃度達到2.0、2.5、3.0 mg/mL時LX-2細胞增殖率顯著降低。見圖1。因此，后續(xù)實驗采用1.5 mg/mL作為最佳實驗濃度。

注：與健脾活血中藥凍干粉0 mg/mL組比較，*P<0.05；與健脾活血中藥凍干粉1.5 mg/mL組比較，#P<0.05

3.2 Western blot法檢測的3組LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA相對表達水平比較 與對照組比較，模型組LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注：A.對照組；B.模型組；C.中藥組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 免疫熒光法檢測的3組LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平比較 與對照組比較，模型組LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、圖4、圖5、圖6。

圖3 3組LX-2細胞中Col-Ⅰ表達水平(免疫熒光染色，10×20倍)

圖4 3組LX-2細胞中Col-Ⅲ表達水平(免疫熒光染色，10×20倍)

圖5 3組LX-2細胞中α-SMA表達水平(免疫熒光染色，10×20倍)

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

HSCs在肝纖維化進程中發(fā)揮著重要作用[6]。靜息狀態(tài)下HSCs被TGF-β1所激活，存在于竇周間隙(Disse間隙)Ⅳ型、Ⅵ型膠原蛋白被Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白取代。α-SMA蛋白表達水平大幅升高，隨著纖維化的發(fā)展，大量活化的HSCs和肌成纖維細胞的收縮性促進肝竇的收縮，影響血流和營養(yǎng)物質的交換，可進一步導致肝功能障礙，加速疾病的發(fā)展[4,7]。

目前國內對肝纖維化的研究甚多，而中藥作用的廣泛性更為肝纖維化的治療提供了新思路。如郭茜等[8]發(fā)現(xiàn)，連翹酯苷A不僅可以改善肝纖維化小鼠的肝功能，也能降低肝臟中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達水平。劉近明等[9]發(fā)現(xiàn)，四逆軟肝方能抑制LX-2細胞的活化，顯著降低LX-2細胞中基質金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloprotinase,TIMP-1)蛋白的表達水平，促進ECM的降解。盧金等[10]發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯可以抑制LX-2細胞增殖，降低Col-Ⅰ的表達水平。陳黎旭等[11]發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀膠囊含藥血清可促進HSCs的氧化應激反應，抑制HSCs的活化。同時，也有學者[12-13]對中藥調節(jié)肝纖維化相關的信號通路和miRNA展開研究。

中藥在抑制HSCs激活，減輕炎癥反應，改善肝纖維化方面療效甚佳[14]。健脾活血治法中，健脾之法借鑒李東垣《脾胃論》補中益氣湯組方思想，選擇黃芪、黨參、茯苓、白術益氣健脾；活血法吸收吳謙《醫(yī)宗金鑒》桃紅四物湯的組方要義，選擇當歸、川芎、桃仁、紅花活血化瘀。方中黃芪可提高肝組織中基質金屬蛋白酶1含量，降低TIMP1含量，減少ECM生成，改善肝纖維化[15]。桃紅四物湯可以提高CCl4誘導的肝纖維化小鼠肝組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，對肝纖維化具有延緩作用[16]。本研究結果表明，健脾活血中藥能顯著抑制激活后LX-2細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA的表達，改善LX-2細胞的纖維化。但健脾活血中藥抑制肝纖維化指標表達的具體機制尚不明確，是否與細胞因子或miRNA介導的信號通路相關，尚需進一步研究。