王維順，楊 駿，樊吟秋，王 萍，查必祥，孔 鈺，張雅婷

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性、出血性卒中等血管性腦損傷疾病所產(chǎn)生的認(rèn)知障礙綜合征，其臨床表現(xiàn)以記憶、行為和認(rèn)知功能缺損為主[1]。VD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的常見癡呆類型[2]，約占所有癡呆病例的15%～20%[3]。VD目前尚無有效的治療手段，而艾灸可改善VD認(rèn)知障礙，促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)新生和VD后神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的增殖、遷移、分化[4]。研究[5]表明，VD的病理特征除灰質(zhì)損傷外，還包括白質(zhì)損傷和髓鞘缺失。但既往研究主要著眼于腦灰質(zhì)及構(gòu)成灰質(zhì)主體的神經(jīng)細(xì)胞，針灸對VD后腦白質(zhì)功能的影響鮮有報道。實際上除了大腦灰質(zhì)會發(fā)生缺血、低氧損傷外，大腦白質(zhì)亦對缺血、低氧敏感，因此腦白質(zhì)的脫髓鞘病變被認(rèn)為是VD的發(fā)病機制之一[6]。

化瘀通絡(luò)灸是治療腦血管病的有效方法，前期的臨床研究和基礎(chǔ)實驗[7-8]均證實了化瘀通絡(luò)灸治療VD的療效。本實驗觀察化瘀通絡(luò)灸對VD大鼠髓鞘再生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討化瘀通絡(luò)灸治療VD的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物 選用SPF級健康成年雄性Wistar大鼠60只，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2019-0003]提供，體質(zhì)量(250±20)g。統(tǒng)一飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所普通級動物房。飼養(yǎng)條件：恒溫(25±1)℃，濕度(50±10)%。實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：AHUCM-rats-2022034。

1.2 試劑 氯馬斯汀(批號 C129211)：阿拉??；髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)一抗(批號 bs-0258R)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein，MAG)一抗(批號 bs-0380R)：北京Bioss公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(批號 A0423)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(批號 L3012)：美國SAB公司。

1.3 儀器 Morris水迷宮：北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司；RM2016病理切片機：德國Leica；全自動數(shù)字掃描儀：匈牙利3DHISTECH公司；垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與分組 將大鼠飼養(yǎng)1周后，使用Morris水迷宮實驗篩除原地旋轉(zhuǎn)、漂浮不動和特別靈敏的大鼠，將余下55只納入實驗。采用隨機數(shù)字表法將12只大鼠隨機選為假手術(shù)組，其余大鼠用于復(fù)制VD模型。采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法復(fù)制VD大鼠模型[9]。術(shù)前大鼠禁水、禁食8 h，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，淺反射消失后，將大鼠固定在特制鼠板上，無菌操作，在大鼠頸部正中作縱向切口，用鑷子鈍性分離一側(cè)頸總動脈，避免觸碰神經(jīng)，動脈夾夾閉右側(cè)頸總動脈10 min，松開10 min，夾閉、松開反復(fù)操作3次，用4-0號外科縫線分別在動脈近心端及遠(yuǎn)心端永久結(jié)扎，從中間剪斷動脈，縫合傷口，分開放回籠中飼養(yǎng)。1周后再以相同方法處理左側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組按上述操作，分離頸總動脈后不作其他處理。模型復(fù)制3 d后，用水迷宮對大鼠進(jìn)行模型鑒定。將假手術(shù)組大鼠定位航行實驗第4天逃避潛伏期的平均值作為參考值，再將模型復(fù)制后的每只大鼠第4天的平均逃避潛伏期減去參考值，所得差值與該鼠的平均逃避潛伏期相除得一比值，若比值超過20%，則表明模型復(fù)制成功[10]。篩選模型成功的VD大鼠36只，隨機分為艾灸組、西藥組、模型組，每組12只。

2.2 各組干預(yù)方法 艾灸組大鼠參照《實驗動物常用穴位名稱與定位》[11]選取“大椎”“百會”“神庭”穴進(jìn)行艾灸，將大鼠固定于自制的灸架上，點燃清艾條(5 mm×12 cm，江蘇康美制藥有限公司)，于相應(yīng)穴位上1～2 cm處進(jìn)行懸灸，每天20 min，7 d為1個療程，共干預(yù)3個療程。西藥組大鼠用氯馬斯汀(H1受體拮抗劑)與蒸餾水配置灌胃溶液，按10 mL/kg灌胃，每日2次，7 d為1個療程，共干預(yù)3個療程。僅將假手術(shù)組和模型組大鼠放于灸架上，不作其他任何處理，干預(yù)時間同艾灸組。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 定位航行實驗 Morris水迷宮為大鼠通用型泳池，避光，控制水溫為(23±2)℃。沿水池周長等距分布，水池區(qū)域被劃分為4個象限，透明圓形平臺放在第3象限中間位置水下2 cm。將大鼠分別從4個象限放入水中，其逃避潛伏期為2 min內(nèi)找到平臺的時間。2 min內(nèi)仍未找到平臺的大鼠，將此次入水逃避潛伏期記錄為2 min，然后將大鼠引導(dǎo)到平臺上，停留30 s。連續(xù)訓(xùn)練4 d，確保大鼠每天實驗時間相同，每次入水時位置相同。

2.3.2 免疫熒光染色法檢測大鼠胼胝體區(qū)MAG、MBP陽性細(xì)胞表達(dá)水平 治療結(jié)束24 h內(nèi)，每組各取6只大鼠灌注4%多聚甲醛后取腦，將大腦組織用石蠟包埋后切片。切片使用0.01 mmol/L PBS漂洗，羊血清封閉，加入一抗MAG、MBP(1∶200)，4 ℃過夜，二抗使用Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。陰性對照采用PBS代替一抗，其余步驟不變。用全自動數(shù)字掃描儀掃描整個腦片區(qū)域，重點觀察胼胝體區(qū)MAG、MBP的表達(dá)水平。

2.3.3 Western blot法檢測大鼠胼胝體區(qū)MAG、MBP表達(dá)水平 取剩余6只大鼠斷頭后取腦，冰上提取胼胝體，-80 ℃保存。裂解液提取組織總蛋白后，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜等過程，分別加入一抗MBP(1∶1 000)、MAG(1∶1 000)，4 ℃孵育搖床過夜。加入羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)，再使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，放入成像系統(tǒng)中掃描，使用Image J軟件讀取灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較 模型復(fù)制3 d后，用水迷宮對大鼠進(jìn)行模型鑒定，假手術(shù)組大鼠(n=12)逃避潛伏期為(11.06±3.23)s，VD模型大鼠(n=36)逃避潛伏期為(66.58±31.76)s，兩組大鼠逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明VD大鼠模型制備成功。

與假手術(shù)組比較，干預(yù)后模型組逃避潛伏期延長(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組、西藥組逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05)。見圖1。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠胼胝體區(qū)MAG、MBP陽性細(xì)胞表達(dá)水平比較 胼胝體區(qū)MAG、MBP染色為絲狀。與假手術(shù)組比較，模型組胼胝體區(qū)MAG、MBP平均熒光強度均降低(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組MAG、MBP平均熒光強度增強(P<0.05)；與西藥組比較，艾灸組MAG平均熒光強度增強(P<0.05)，MBP平均熒光強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.艾灸組；D.西藥組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05

3.3 各組大鼠胼胝體區(qū)MAG、MBP表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組胼胝體區(qū)MAG、MBP表達(dá)水平下降(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組MAG、MBP表達(dá)水平增加(P<0.05)；與西藥組比較，艾灸組MAG表達(dá)水平增加(P<0.05)，MBP表達(dá)水平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.艾灸組；D.西藥組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05

4 討論

VD屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇，年老腎精不足，氣血虧虛，血脈瘀滯，腦絡(luò)瘀阻，日久可導(dǎo)致腦失所養(yǎng)、髓腦空虛，發(fā)為本病，故血瘀與VD密切相關(guān)?；鐾ńj(luò)灸取督脈百會、大椎、神庭穴，發(fā)揮艾灸溫陽通脈、活血散結(jié)的作用，以充養(yǎng)腦髓、安神寧志。研究[12]表明，針刺“百會”等督脈穴不僅可以改善學(xué)習(xí)記憶能力，而且能促進(jìn)腦缺血大鼠腦白質(zhì)髓鞘再生。本實驗通過Morris水迷宮觀察發(fā)現(xiàn)，艾灸干預(yù)后VD大鼠的逃避潛伏期比治療前顯著減少，說明化瘀通絡(luò)灸能改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。這與課題組前期報道[13]的化瘀通絡(luò)灸能夠明顯改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的研究結(jié)果一致。

腦白質(zhì)由許多髓鞘化的軸突組成，其基礎(chǔ)代謝率高，因此即使是輕微缺血也會造成腦白質(zhì)損傷。胼胝體是大腦最大的白質(zhì)帶，是VD的主要損傷部位，故選用胼胝體作為VD白質(zhì)損傷的觀察對象。髓鞘是白質(zhì)中必不可少的成分，由成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出的細(xì)胞突起包裹神經(jīng)細(xì)胞軸突形成。髓鞘的完整性對腦白質(zhì)功能的恢復(fù)至關(guān)重要，因此髓鞘脫失也會引起以認(rèn)知障礙為主的一系列臨床綜合征[14]。當(dāng)提供營養(yǎng)支持時，腦白質(zhì)中的髓鞘被激活，發(fā)生增殖，并遷移到損傷部位，使髓鞘重新包裹軸突，這個過程稱為“髓鞘再生”[15]。同時實驗研究[16]證明，氯馬斯汀(H1受體拮抗劑)具有增強少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和促進(jìn)髓鞘再生的作用，因此本研究選擇氯馬斯汀作為陽性對照藥。

MAG是構(gòu)成髓鞘的重要成分之一，其表達(dá)在髓鞘的最內(nèi)層，直接與軸突表面相鄰，具有穩(wěn)定軸-髓鞘方面的作用、維持髓鞘結(jié)構(gòu)的完整性等[17]。有研究[18]報道，脫髓鞘會導(dǎo)致MAG損失，MAG可能是髓鞘形成所必需的物質(zhì)。MBP位于髓鞘漿液表面，是髓鞘的特異性標(biāo)志物，可啟動髓鞘的合成，穩(wěn)定髓鞘的結(jié)構(gòu)[19]。同時既往實驗[20]表明，大腦缺血損傷后，髓鞘相關(guān)蛋白MAG、MBP含量明顯降低。因此，髓鞘相關(guān)蛋白MAG、MBP表達(dá)水平的高低可反映髓鞘再生情況和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)程度。

本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠髓鞘相關(guān)蛋白MAG、MBP表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組髓鞘相關(guān)蛋白MAG、MBP表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。結(jié)果提示化瘀通絡(luò)灸能夠促進(jìn)髓鞘相關(guān)蛋白MAG、MBP的合成，促進(jìn)髓鞘再生。與西藥組比較，艾灸組MAG表達(dá)水平升高(P<0.05)，說明艾灸組的療效優(yōu)于西藥組；艾灸組MBP表達(dá)趨勢略優(yōu)于西藥組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，究其原因可能與樣本量不足有關(guān)。由此推斷，艾灸能夠加快大鼠腦白質(zhì)髓鞘損傷的修復(fù)，從而證實化瘀通絡(luò)灸可以促進(jìn)髓鞘再生，對促進(jìn)髓鞘再生起到積極作用。

綜上，化瘀通絡(luò)灸能促進(jìn)VD大鼠髓鞘相關(guān)蛋白MAG、MBP的合成，促使髓鞘再生，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。