謝佶芹， 鄭麗君， 楊宇， 張文平， ， 岳碧松

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065；2.成都大熊貓繁育研究基地，成都610081； 3.四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610081）

大熊貓Ailuropoda melanoleuca隸屬食肉目Carnivora，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，從吃肉轉(zhuǎn)化到吃竹子，腸道微生物必然發(fā)生相應(yīng)變化。關(guān)于大熊貓腸道菌群的研究可以追溯到20世紀(jì)80年代（Hirayama，1989）。Wei等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓的腸道菌群對(duì)其消化吸收、免疫代謝以及疾病等具有重要的意義；陳希文等（2015）認(rèn)為腸道疾病是大熊貓死亡的重要原因之一，腸道菌群改變可能引起大熊貓消化功能紊亂，甚至死亡；薛正晟（2015）和王嵐（2019）研究發(fā)現(xiàn)，埃希氏菌屬-志賀菌屬Escherichia-Shigella和鏈球菌屬Streptococcus為大熊貓腸道的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，但缺乏在其他食草動(dòng)物腸道中普遍存在的與消化相關(guān)的典型細(xì)菌，如瘤胃菌科Ruminococcaceae和擬桿菌屬Bacteroides等；王鑫等（2021）通過(guò)高通量檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)74只圈養(yǎng)大熊貓的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)在門(mén)級(jí)水平上以變形菌門(mén)Proteobacteria和厚壁菌門(mén)Firmicutes，在屬級(jí)水平上以大腸埃希氏菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas、鏈球菌屬和梭菌屬Clostridium為腸道核心菌群。

腸道菌群結(jié)構(gòu)與人和動(dòng)物的疾病與健康有非常密切的關(guān)系，可以采取服用益生菌的辦法來(lái)預(yù)防和治療相關(guān)疾?。ㄐ煳膵傻?，2020；鄭樂(lè)銘等，2020；林炫財(cái)?shù)龋?021；許軍軍，2022）。王強(qiáng)和張安居（1998）應(yīng)用大熊貓?jiān)慈闂U菌Lactobacillussp.治療大熊貓腹瀉、腸炎、營(yíng)養(yǎng)不良等疾病療效顯著；Liu等（2017）和王黎明等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，幾株大熊貓?jiān)慈闂U菌對(duì)大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、沙門(mén)氏菌Salmonellasp.具有很好的抑制效果；曾東等（2019）發(fā)現(xiàn)1株具有預(yù)防和治療胃腸疾病作用的大熊貓?jiān)慈诤衔核故暇鶺eissalla confusa。人和動(dòng)物腸道有益微生物能通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)、緩解炎癥 等 益 生 作 用（Fukudaet al.，2011；Heet al.，2019）。大熊貓腸道中有數(shù)以千計(jì)的細(xì)菌，如何才能分離獲得產(chǎn)酸能力強(qiáng)的益生菌呢？本文研究幾種商用益生菌富集培養(yǎng)基對(duì)大熊貓腸道菌產(chǎn)SCFA的影響，為益生菌的富集培養(yǎng)和分離篩選提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀：7890A（安捷倫公司，配有FID檢測(cè)器）。

厭氧培養(yǎng)箱：Bactron系列（美國(guó)Shellab），箱體采用氮?dú)猓?9.99%）和混合氣體（5.0%二氧化碳、89.9%氮?dú)狻?.1%氫氣）填充。使用時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)提前進(jìn)行壓強(qiáng)平衡。

SCFA標(biāo)準(zhǔn)溶液：乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸和正己酸（Sigma公司，色譜純）。使用20%磷酸（國(guó)藥集團(tuán)，分析純）逐級(jí)稀釋?zhuān)?0 μg·mL-1、8 μg·mL-1、4 μg·mL-1、2 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1），配置成混合標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)溶液：2-乙基丁酸（Sigma公司，色譜純）。以2-乙基丁酸為內(nèi)標(biāo)物，20%磷酸稀釋2-乙基丁酸溶液，配制成1 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)母液。隨后稀釋為50 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。

培養(yǎng)基：GYP、LBS、M17、SL、TJA商用培養(yǎng)基（表1）均購(gòu)自海博生物公司。

表1 各培養(yǎng)基主要成分信息Table 1 Main components of culture media used in this study

1.2 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 pm）；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?50 ℃保持 1 min，以 15 ℃·min-1升至 120 ℃，以5 ℃·min-1升至 170 ℃，以 15 ℃·min-1升至 240 ℃后保持3 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度：250 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL，分流比50∶1；載氣：高純氮?dú)猓兌龋?9.999%），流速：1.0 mL·min-1；尾吹氣：高純氮?dú)猓兌龋?9.999%），流速：30 mL·min-1；氫氣流速：47 mL·min-1；空氣流速：400 mL·min-1。

1.3 樣品前處理

于成都大熊貓繁育研究基地采集2只1歲左右健康亞成體大熊貓的新鮮糞便，裝入?yún)捬醪杉兴突?。于厭氧操作臺(tái)上，取糞便樣本中間部分按照1∶2體積比與PBS緩沖液混合，200 r·min-1振蕩5 min，過(guò)濾雜質(zhì)制成菌懸液，并將所得2份菌懸液混合均勻備用。

按照使用說(shuō)明書(shū)配置5種培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基分裝3支試管，每支15 mL，高壓滅菌15 min備用。取混合菌懸液1 mL厭氧條件下接種于試管液體培養(yǎng)基中（每種培養(yǎng)基各3個(gè)重復(fù)），橡皮塞封口并用封口膜多層纏繞密封，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h備用。上機(jī)前，20%磷酸調(diào)節(jié)菌懸液至pH3.0。試驗(yàn)用水均為超純水。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

利用GraphPad Prism 8.3.0分析測(cè)得SCFA濃度數(shù)據(jù)（本研究中以濃度表示產(chǎn)量）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總SCFA產(chǎn)量

氣相色譜分析表明，大熊貓腸道菌在不同培養(yǎng)基中總SCFA產(chǎn)量差異明顯，其中產(chǎn)量最高的是SL、LBS培養(yǎng)基，總SCFA濃度分別達(dá)到16.410 μg·mL-1、15.650 μg·mL-1；總SCFA產(chǎn)量最低的是GPY和M17培養(yǎng)基，濃度僅為1.250 μg·mL-1和2.410 μg·mL-1（表2）。

表2 不同培養(yǎng)基的總短鏈脂肪酸產(chǎn)量Table 2 Production of total short-chain fatty acid（SCFA） in different culture media

2.2 各SCFA產(chǎn)量

SCFA主要由乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸和正己酸組成。氣相色譜分析表明，大熊貓腸道菌在不同培養(yǎng)基中各種SCFA的產(chǎn)量差異明顯（表3）。除M17培養(yǎng)基外，其余4種培養(yǎng)基培養(yǎng)的大熊貓腸道菌所產(chǎn)均以乙酸為主，其他SCFA的濃度較低，有的甚至沒(méi)有檢測(cè)到。SL和LBS培養(yǎng)基中乙酸濃度最高，分別為15.979 μg·mL-1和15.215 μg·mL-1，約占總含量的97%。雖然 M17培養(yǎng)基的總SCFA產(chǎn)量不高，乙酸的濃度僅為0.243 μg·mL-1，約占總含量的10%，但其他6種均可檢測(cè)到，特別是正丁酸最高，達(dá) 1.230 μg·mL-1，約占51%，此外，丙酸和正己酸也占總含量的10%以上。5種培養(yǎng)基檢測(cè)得到的異丁酸和正戊酸含量普遍較低，基本上無(wú)法檢測(cè)到。

表3 不同培養(yǎng)基中各短鏈脂肪酸的產(chǎn)量Table 3 Production of short-chain fatty acids in different culture media

在GPY培養(yǎng)基中，乙酸濃度為0.528 μg·mL-1，約占總含量的42%，正己酸濃度為0.271 μg·mL-1，剩余產(chǎn)物的濃度均低于0.2 μg·mL-1，異丁酸和正戊酸檢測(cè)不到。LBS培養(yǎng)基中，乙酸為主要產(chǎn)物，約占總含量的97%，剩余產(chǎn)物的濃度均低于0.2 μg·mL-1，其中異丁酸、正戊酸和正己酸檢測(cè)不到。M17培養(yǎng)基以正丁酸為主，約占總含量的51%，其他6種均可檢測(cè)到。SL與LBS培養(yǎng)基的產(chǎn)物均以乙酸為主，約占總含量的97%，剩余產(chǎn)物的濃度均低于0.2 μg·mL-1，異丁酸、正戊酸和正己酸檢測(cè)不到。TJA培養(yǎng)基中的乙酸濃度為5.694 μg·mL-1，約占總含量的 88%，正己酸濃度 0.274 μg·mL-1，剩余產(chǎn) 物的濃度均 低 于 0.2 μg·mL-1，正戊酸 檢 測(cè)不到。

3 討論

SL和LBS培養(yǎng)基更有利于培養(yǎng)大熊貓腸道產(chǎn)乙酸性能強(qiáng)的微生物。在動(dòng)物腸道內(nèi)，如微生物菌群的數(shù)量和種類(lèi)、發(fā)酵底物的來(lái)源與性質(zhì)及食糜在腸道的時(shí)間等都會(huì)對(duì)SCFA產(chǎn)生影響（Cook &Sellin，1998；Roberfroid，2005）。不同微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFA的數(shù)量及種類(lèi)存在差異（陳燕等，2006）。本研究結(jié)果表明，大熊貓腸道微生物在SL、LBS培養(yǎng)基中產(chǎn)SCFA的能力明顯高于其他3種培養(yǎng)基，其中，乙酸產(chǎn)量占總SCFA的97%。乙酸是結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵的主要產(chǎn)物，主要由結(jié)腸厭氧細(xì)菌發(fā)酵未被小腸消化的碳水化合物產(chǎn)生和結(jié)腸內(nèi)蛋白質(zhì)降解和氨基酸發(fā)酵產(chǎn)生（Bianehiet al.，2011）。在機(jī)體內(nèi)，乙酸被吸收進(jìn)入肝臟作為能源物質(zhì)進(jìn)行代謝，參與肌肉、脾臟、心臟、腦等的代謝（王子花等，2007；劉松珍等，2013）。曾霖等（2022）研究表明，乙酸主要由擬桿菌類(lèi)、雙歧桿菌類(lèi)、鏈球菌類(lèi)、消化鏈球桿菌類(lèi)、梭菌類(lèi)、瘤胃球菌類(lèi)產(chǎn)生，說(shuō)明SL、LBS培養(yǎng)基可能對(duì)這些菌類(lèi)有較強(qiáng)的富集作用。

M17培養(yǎng)基有利于培養(yǎng)大熊貓腸道產(chǎn)正丁酸、正己酸性能強(qiáng)的微生物。張文平等（2021）基于氣相色譜法檢測(cè)大熊貓糞便7種SCFA的含量發(fā)現(xiàn)，乙酸為 0.66 μg·mL-1、丙酸 0.48 μg·mL-1、正丁酸 0.28 μg·mL-1、異 丁 酸 0.10 μg·mL-1、正 戊 酸0.12 μg·mL-1、異 戊 酸 0.25 μg·mL-1和正己酸0.14 μg·mL-1。對(duì)比本研究可以發(fā)現(xiàn)，SL、LBS 和TJA培養(yǎng)基富集菌液的乙酸濃度極顯著高于大熊貓糞便樣本，M17培養(yǎng)基富集菌液的正丁酸、正戊酸濃度高于大熊貓糞便樣本（正丁酸的濃度約為糞便樣本的4倍），GPY、M17、TJA培養(yǎng)基富集菌液的正己酸濃度約為大熊貓糞便樣本的2倍。說(shuō)明本研究所使用培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)乙酸、正丁酸、正戊酸和正己酸性能較強(qiáng)的大熊貓腸道微生物的富集能力較強(qiáng)。因此，本研究中的M17培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)正丁酸、正戊酸和正己酸性能較強(qiáng)的大熊貓腸道微生物的富集能力也較強(qiáng)。

腸道微生物產(chǎn)生的SCFA主要包括乙酸、丙酸、正丁酸，它們對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài)和保持宿主健康具有重要作用。研究顯示，腸道微生物產(chǎn)生的SCFA在降低結(jié)腸炎癥反應(yīng)（高紫云，王震華，2021）、防止過(guò)度肥胖（邵茗等，2019）、緩解糖尿?。嫴┑龋?018）、抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖（耿珊珊，蔡?hào)|聯(lián)，2005）等方面有重要作用。Fukuda等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌Bifidobacteriumspp.可以保護(hù)小鼠Mus musculus免受強(qiáng)毒株大腸桿菌O157導(dǎo)致的死亡，并發(fā)現(xiàn)灌胃雙歧桿菌的小鼠糞便中的乙酸濃度增高。在以葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，腸道菌群的缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重結(jié)腸炎，通過(guò)乙酸治療后可顯著改善小鼠疾病指數(shù)（Maslowskiet al.，2009）。臨床上應(yīng)用正丁酸治療先天性氯化物腹瀉也有較好效果（Cananiet al.，2004）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生理劑量的乙酸、丙酸、丁酸均能抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡（Hagueet al.，1995），具有抗腫瘤效果（Tanet al.，2014）。正是由于SCFA具有如此重要的作用，益生菌分泌的SCFA在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。因此，本研究在體外培養(yǎng)大熊貓腸道菌群并以SCFA含量為檢測(cè)指標(biāo)，篩選出有利于培養(yǎng)產(chǎn)SCFA含量高的3種培養(yǎng)基（SL、LBS和M17），為進(jìn)一步篩選潛在益生菌打下基礎(chǔ)。同時(shí)，在體外培養(yǎng)的大熊貓糞便菌懸液的基礎(chǔ)上，可以采用傳統(tǒng)微生物分離方法分離出單菌落，進(jìn)一步研究其益生性能，以期篩選出大熊貓?jiān)匆嫔辏瑧?yīng)用于大熊貓疾病，特別是消化道疾病的治療。