雷雙旖,曾 抗

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科,廣州,510515)

0 引言

尖銳濕疣( Condyloma acuminatum,CA) ,是由人乳頭瘤病毒( human papillomavirus,HPV) 感染引起的以皮膚黏膜疣狀增生性病變?yōu)橹鞯募膊?。?954年以來(lái),CA就被認(rèn)為是一種獨(dú)立的性傳播疾病[1]。除此之外它也是一種已知病毒病因的良性腫瘤,并且具有一定惡變的潛力[2]?；颊咂p最初體現(xiàn)為局部細(xì)小丘疹,隨著時(shí)間進(jìn)展逐漸增大或增多,發(fā)展為乳頭狀、菜花狀、雞冠狀或團(tuán)塊狀贅生物。一般無(wú)自覺(jué)癥狀,少數(shù)患者可因皮損位置原因出現(xiàn)瘙癢、異物感、壓迫感等。皮疹部位可因贅生物脆性增加、摩擦而出現(xiàn)破潰、糜爛、繼發(fā)感染等癥狀[3],影響患者的身心健康及生活質(zhì)量。乳頭瘤病毒(Papillomaviruses,PV)是在分化的皮膚細(xì)胞中繁殖的無(wú)包膜雙鏈DNA病毒,呈高度多樣化,可在其天然宿主的特定部位中引起良性腫瘤(疣、乳頭狀瘤),某些特定類型的PV誘導(dǎo)的乳頭狀瘤增生具有惡性進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)[4]。由于種屬特異性,人體是HPV唯一的自然宿主。目前普遍認(rèn)為HPV感染僅限于粘膜皮膚復(fù)層上皮,病毒生命周期依賴于上皮細(xì)胞復(fù)制和分化,細(xì)胞周期的延續(xù)主要由PV E6和E7蛋白驅(qū)動(dòng),病毒顆粒在上皮細(xì)胞從上皮表面脫落并降解后釋放[5]。所描述的400多種乳頭瘤病毒中,218種與人類感染有關(guān),其中約40多型與生殖器、肛周部位的感染有關(guān)。臨床上根據(jù)HPV潛在的致癌性,將其分為低危型和高危型[6]。尖銳濕疣病變中大概率含有多種HPV類型,其中低危型HPV類型HPV6和HPV11在尖銳濕疣的發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位,也可合并HPV16、HPV18等高危型HPV類型。Hawkins等[7]發(fā)現(xiàn)免疫抑制患者感染高危型HPV概率較健康人高,特別常見(jiàn)高危型的高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型包括HPV16、HPV55和HPV59型。由于HPV體外難以通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方式分離出大量病毒顆粒,又因其自然宿主局限于人,缺乏適宜的動(dòng)物模型,這使人們對(duì)HPV的研究難以全面展開。近年來(lái),隨著HPV感染引起的性傳播疾病和腫瘤的發(fā)病率逐年上升,HPV疫苗和HPV感染動(dòng)物模型的研究與開發(fā)也受到越來(lái)越多的關(guān)注。人類在研究中使用動(dòng)物模型已經(jīng)持續(xù)了數(shù)千年,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)藥物的開發(fā)和理解人類疾病過(guò)程做出了重大貢獻(xiàn),但有時(shí)因不同的動(dòng)物種屬誘導(dǎo)疾病的模型與人類不相似、代謝途徑和藥物代謝物途徑有差異、人類和被測(cè)試動(dòng)物物種之間存在內(nèi)在差異等原因使動(dòng)物研究中得出的結(jié)論不能簡(jiǎn)單地轉(zhuǎn)移到人類研究中[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基礎(chǔ)細(xì)胞科學(xué)和組織工程的發(fā)展,三維細(xì)胞培養(yǎng)模型技術(shù)逐步完善,通過(guò)更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)微環(huán)境,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)二維單層培養(yǎng)和動(dòng)物模型之間的差距[9]。

1 HPV相關(guān)疾病動(dòng)物模型

1.1 哺乳動(dòng)物PV感染動(dòng)物模型

已建立的幾種天然存在的動(dòng)物乳頭瘤病毒模型,例如,棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus,CRPV)感染家兔模型、兔口腔乳頭瘤病毒(rabbit oral papillomavirus,ROPV)感染家兔模型、犬口腔乳頭瘤病毒(canine oral papillomavirus,COPV)感染犬模型和牛乳頭瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)感染牛模型以及小鼠乳頭瘤病毒( mouse papillomavirus type 1,MmuPV1)感染小鼠模型,CRPV是第一個(gè)鑒定的乳頭瘤病毒,早期的PV相關(guān)疾病模型主要集中在CRPV和BPV1。1933年,Shope 等[10]在野生棉尾兔中觀察到一種乳頭狀瘤,并發(fā)現(xiàn)其可傳染給野生兔和家兔。1964年,Cheville[11]通過(guò)劃痕接種牛疣組織導(dǎo)致牛接種部位上皮增生,通過(guò)皮下接種導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖。Baker等[12]通過(guò)冷凍電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)CRPV、BPV 1和HPV 1的玻璃質(zhì)冰中的病毒顆粒具有基本相同的結(jié)構(gòu),進(jìn)一步證實(shí)了CRPV和BPV1模型對(duì)HPV發(fā)病機(jī)制的適用性。CRPV與高危HPV的廣泛遺傳和功能同源性使該模型系統(tǒng)成為測(cè)試新型抗病毒和抗腫瘤治療的金標(biāo)準(zhǔn),在開發(fā)HPV疫苗、抗病毒藥和抗腫瘤藥方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[13]。由于牛和人類具有多種相似的免疫生理學(xué)特征,包括子宮內(nèi)免疫系統(tǒng)的發(fā)育,這使得牛成為模擬人類免疫學(xué)的優(yōu)秀模型。BPV也有多種亞型,體外研究的牛病毒的生命周期、基因組結(jié)構(gòu)、病毒蛋白和病理生理學(xué)為了解人類病毒鋪平了道路[14]。然而,CRPV僅感染皮膚部位,因此不是模擬肛門生殖器感染和疾病的理想模型[15]。在家兔感染模型中,CRPV產(chǎn)生的乳頭狀瘤不能適當(dāng)支持完整的生產(chǎn)生命周期,并且產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生感染性病毒顆粒[16]。與HPV不同,BPV E6和E7蛋白在生產(chǎn)性感染期間破壞細(xì)胞周期的作用較小,并且在更廣泛的組織中復(fù)制[17]。除此之外,由于體積較大,生物學(xué)、遺傳學(xué)與人類差別過(guò)大,以及病毒來(lái)源、實(shí)驗(yàn)試劑局限等原因,限制了這些感染模型的應(yīng)用。與CRPV一樣,COPV模型也進(jìn)行了大量的疫苗開發(fā)工作,但由于飼養(yǎng)成本較高,且COPV不能感染生殖器組織,近年來(lái)該模型漸漸被ROPV模型所取代[18]。

2011年,在印度癌癥治療研究和教育高級(jí)中心的一群NMRI-Foxn 1(nu)/Foxn 1(nu)(裸)小鼠口鼻部黏膜交界處自發(fā)出現(xiàn)乳頭狀瘤,研究院分離得到MmuPV1,該病毒表現(xiàn)出嗜皮膚性,可感染免疫功能正常的小鼠背部皮膚[19]。之后Cladel等[20-21]發(fā)現(xiàn)MmuPV1在Foxn 1 nu/Foxn 1 nu小鼠陰道、宮頸、肛門、尿道、尾部、口鼻部、面部、內(nèi)頰都易發(fā)生感染,并且可能具有惡性潛能。Spurgeon[22]實(shí)驗(yàn)證明了MmuPV1可通過(guò)性傳播。至此MmuPV1感染小鼠模型被認(rèn)為是研究肛門生殖器乳頭狀瘤病毒疾病的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男?dòng)物模型。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)MmuPV1感染小鼠的能力受到宿主免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈控制,MmuPV1可誘導(dǎo)用CD 3抗體去除T細(xì)胞的BALB/c或C57 BL/6小鼠產(chǎn)生乳頭狀瘤,并且瘤體可在免疫恢復(fù)的8周內(nèi)完全消退,而單獨(dú)CD 4+或CD 8 + T細(xì)胞耗竭均不足以產(chǎn)生可見(jiàn)的乳頭狀瘤。2020年Wei等[24]成功建立了第1個(gè)MmuPV1誘導(dǎo)頭頸部鱗癌的體內(nèi)感染模型。2021年Sauer等[25]通過(guò)MmuPV1感染有效地誘導(dǎo)NSG小鼠肛門高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變,并且實(shí)驗(yàn)表明在用UVB照射的免疫功能正常的FVB/NJ小鼠肛門,MmuPV1感染能持續(xù)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月,提出了一種由自然感染驅(qū)動(dòng)的肛門疾病和癌癥的新模型?？偠灾?雖然MmuPV1感染模型在概括人類感染和疾病的各個(gè)方面的能力存在固有的局限性[26],其仍具有令人難以置信的前景,MmuPV1的發(fā)現(xiàn)提供了一種實(shí)用且遺傳學(xué)上易于處理的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物物種背景下模擬HPV感染、傳播和發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物因其與人類的進(jìn)化較為接近,也是研究HPV發(fā)病機(jī)制的有利模型,但在實(shí)驗(yàn)成本、技術(shù)、試劑等方面仍存在挑戰(zhàn)。

1.2 HPV相關(guān)異種移植物模型

異種移植,即將一個(gè)物種的細(xì)胞組織移植到另一個(gè)物種體內(nèi)。患者來(lái)源的異種移植物(Patient-derived xenografts,PDX),即將新鮮人腫瘤組織的細(xì)胞或完整片段移植到免疫系統(tǒng)中具有防止移植排斥的遺傳缺陷的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(通常是小鼠),有助于體內(nèi)抗腫瘤研究和篩選臨床新型藥物。1987年,Kreider等[27]將感染了HPV11的新生兒包皮的碎片移植到無(wú)胸腺小鼠的腎包膜下,建立了第1個(gè)HPV相關(guān)的異種移植模型。后續(xù)也有研究者利用相似方式構(gòu)建出HPV40、HPVLVX 82/MM 7、HPV16的裸鼠/免疫缺陷小鼠腎包膜下/表皮下異種移植物模型[28-29]。1989年,Stanle等[30]嘗試將含有高拷貝數(shù)HPV16 DNA的宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞系W12移植到無(wú)胸腺裸鼠上皮。次年Sterling等[31]同樣將W12細(xì)胞系移植到裸鼠上,并成功誘導(dǎo)其形成復(fù)層分化上皮;長(zhǎng)期移植顯示出低度宮頸發(fā)育不良的組織學(xué)特征,終末分化細(xì)胞含有擴(kuò)增水平的HPV-16 DNA、病毒衣殼抗原和病毒顆粒。Duan等[32]改良了Kreider的異種移植模型,以網(wǎng)狀移植物模式接種,提高了模型低風(fēng)險(xiǎn)HPV的繁殖率和可重復(fù)性。2012年Kimple等[33]描述了一組HPV陽(yáng)性和HPV陰性人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)腫瘤移植物模型,移植瘤具有典型的臨床組織病理學(xué)標(biāo)本的分化譜,并且在原始患者腫瘤和移植瘤之間具有高度的一致性。2018年,Larmour等[34]首次證明了新鮮宮頸癌、宮頸不典型增生和正常宮頸組織可以在高度免疫功能低下小鼠的腎包膜下生長(zhǎng),其中來(lái)自宮頸癌異種移植物的腫瘤在小鼠體內(nèi)至少傳代3次,重現(xiàn)了親本腫瘤的結(jié)構(gòu)和p16和HPV的免疫組化特征。

與癌細(xì)胞系或細(xì)胞系異種移植物相比,通過(guò)異種移植涉及人體組織的模型更適用于人類疾病。PDX模型在分子特征和治療反應(yīng)方面可能更接近其人類原始腫瘤,并且可能保留人類癌癥典型的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。盡管如此,仍需要確認(rèn)已建立的PDX模型成功植入率,以及是否保留了原始人類腫瘤的特征,是否適用于進(jìn)一步的研究[35]。但最近Kruse等[36]和Zottnick等[37]構(gòu)建了一種新型MHC人源化小鼠原位HPV腫瘤模型。與現(xiàn)有的HPV 腫瘤模型相比,它適用于在排除鼠MHC呈遞的表位的干擾下,研究HLA-A2和DR 1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。A2.DR1小鼠經(jīng)工程改造以缺乏所有鼠MHC分子,具有人MHC分子的排他性表達(dá),因此可直接用于體內(nèi)治療性疫苗接種。Kruse等[36]通過(guò)用HPV 16 E6和E7轉(zhuǎn)導(dǎo)A2.DR1肉瘤細(xì)胞系2277 NS產(chǎn)生E6+/E7+細(xì)胞系PAP-A2,并注射到A2.DR1小鼠的側(cè)腹形成原位腫瘤。由于PAP-A2 luc細(xì)胞系中轉(zhuǎn)導(dǎo)的HPV16蛋白表達(dá)水平較低且細(xì)胞存活不依賴于這些蛋白。Zottnick等[37]建立了一種新的E6+/E7+依賴性細(xì)胞系,用HPV 16 E6和E7轉(zhuǎn)導(dǎo)A2.DR1衍生的肺細(xì)胞,用活化的癌蛋白H-ras G12 V轉(zhuǎn)染細(xì)胞以使其致瘤,用螢火蟲熒光素酶基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞使其能夠被跟蹤,該細(xì)胞系被命名為E6/7-lucA 2。將細(xì)胞系滴注到已同步到相同間情狀態(tài)的小鼠陰道內(nèi)。PAP-A2-luc細(xì)胞使3只小鼠中的2只形成陰道腫瘤,而E6/7-lucA 2細(xì)胞能夠在所有3只小鼠中形成陰道腫瘤。Tseng等[38]和Peng等[39-40]也用HLA-A2(AAD)人源化小鼠構(gòu)建HPV16 E6/E7口腔癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和HPV18 E7 E6宮頸陰道腺鱗癌模型。AAD轉(zhuǎn)基因小鼠含有表達(dá)人HLA-A2的α1、α2結(jié)構(gòu)域和源自小鼠的H-2Dd的α3跨膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合HLA I類分子,這種小鼠通常用于模擬人類T細(xì)胞HLA-A2呈遞抗原的免疫應(yīng)答。以上的腫瘤模型都可以形成自發(fā)的、局部的HPV致癌基因誘導(dǎo)的腫瘤,能跟蹤從正常組織到侵襲性和/或轉(zhuǎn)移性狀態(tài)的進(jìn)展,易于檢測(cè),可能適用于不同的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠,未來(lái)在測(cè)試各種疫苗和新型免疫療法方面具有巨大的潛力。

盡管異種移植物模型的概念和初步建立已經(jīng)存在了幾十年,但隨著個(gè)體化治療方法改變癌癥治療,它們?cè)谀[瘤藥物開發(fā)中的價(jià)值才剛剛實(shí)現(xiàn),在增加人們對(duì)疾病生物學(xué)的理解,開發(fā)新的治療方法和生物標(biāo)志物方面,異種移植物模型仍是一個(gè)有吸引力的臨床前替代癌癥治療模型。

1.3 HPV轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將期望的目標(biāo)基因,經(jīng)過(guò)人工分離、重組后,導(dǎo)入并整合到生物體的基因組中,從而改變生物原有的性狀或賦予其新的性狀。將基因?qū)氩溉閯?dòng)物的生殖系是生物學(xué)上重大技術(shù)進(jìn)步之一。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在發(fā)育和發(fā)育基因調(diào)控機(jī)制、癌基因的作用以及免疫系統(tǒng)內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞相互作用方面發(fā)揮了重要作用[41]。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型克服了HPV的種屬特異性這一缺點(diǎn),通過(guò)組織特異性的外源啟動(dòng)子,使HPV癌蛋白定向表達(dá)在特定的組織細(xì)胞中。按 HPV 基因功能可分為早期區(qū)(E區(qū))、晚期區(qū)(L區(qū))和上游調(diào)控區(qū)(URR)3個(gè)區(qū)域(以HPV16為例):E區(qū)包括 E1～E7開放閱讀框架,主要編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白;L 區(qū)分為 L1和L2的2個(gè)開放閱讀框架,分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白;URR位于E區(qū)與L區(qū)間,負(fù)責(zé)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,與 HPV 在人皮膚粘膜上皮的定向表達(dá)有關(guān)[42]。HPV16和HPV18是最常見(jiàn)的2種高危HPV,約占所有HPV相關(guān)宮頸癌和頭頸癌的70%。占高風(fēng)險(xiǎn)HPV表達(dá)2種有效的癌蛋白E6和E7,分別介導(dǎo)細(xì)胞p53和pRb的降解,這2種腫瘤抑制蛋白對(duì)細(xì)胞周期控制和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要,導(dǎo)致HPV誘導(dǎo)的癌變[43]。最初研究員們運(yùn)用BPV-1研究乳頭瘤病毒的轉(zhuǎn)基因模型,發(fā)現(xiàn)BPV-1基因組通過(guò)小鼠生殖系傳播導(dǎo)致皮膚纖維乳頭瘤形成,并為HPV相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)[44]。人乳頭瘤病毒的上游調(diào)控區(qū)(URR)又稱長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件,這些元件決定了病毒的細(xì)胞類型特異性。Yang等[45]將HPV 16基因組串聯(lián)的頭尾二聚體的形式與內(nèi)源性HPV 16URR以顯微注射到CD-1小鼠中。在沒(méi)有其他干預(yù)的情況下,中年轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)了多器官自發(fā)性惡性腫瘤,腫瘤發(fā)生在皮下、胸腔或腹部,一半小鼠出現(xiàn)肺、肝、腎、腦、淋巴結(jié)和脾中轉(zhuǎn)移。腫瘤可在裸鼠體內(nèi)移植并迅速生長(zhǎng)。宮頸是女性HPV 16感染的主要部位,然而沒(méi)有觀察到宮頸的病變,Yang等考慮可能是由于E2區(qū)缺失/截短,或者動(dòng)物沒(méi)有存活足夠長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)顯示腫瘤。利用HPV調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)驅(qū)動(dòng)HPV癌蛋白的表達(dá)的研究并不順利,腫瘤往往是非上皮來(lái)源的,且出現(xiàn)在非理想的靶器官中。于是研究者們嘗試用異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)癌蛋白的表達(dá)。

角蛋白K5和K14的表達(dá)通常局限于表皮基底層,表皮異常增生與這些標(biāo)記物的超基礎(chǔ)表達(dá)相關(guān)。表皮發(fā)育不良的增加與DNA合成增加,與角蛋白K5和K14出現(xiàn)在顆粒層,K10和微絲蛋白表達(dá)減少有關(guān)。角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化的標(biāo)志物K10和微絲蛋白的表達(dá)降低,與上皮細(xì)胞分化的喪失一致[46]。人角蛋白14啟動(dòng)子(HK14)定位于各種復(fù)層表面上皮細(xì)胞的基底層表達(dá),并驅(qū)動(dòng)高水平的表達(dá)。1994年Arbeit等[47]為了模擬人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展,使用人角蛋白14(hK14)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子將人乳頭瘤病毒16型(HPV 16)的早期區(qū)域的表達(dá)靶向于轉(zhuǎn)基因小鼠中鱗狀上皮的基底細(xì)胞,建立了K14-HPV16進(jìn)展型鱗狀上皮腫瘤轉(zhuǎn)基因鼠。小鼠耳、軀干皮膚、面部、口鼻部、眼瞼以及肛門表皮和黏膜出現(xiàn)增生、乳頭狀瘤病和發(fā)育不良癥狀。K14控制的HPV癌蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型也已用于研究其他HPV類型蛋白的致癌潛力。在沒(méi)有任何物理或化學(xué)致癌物治療的情況下,HPV8轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了非黑色素瘤皮膚癌[48]。Marcuzzi等[49]也發(fā)現(xiàn),帶有HPV 8的全部早期區(qū)域(CER)的轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)地發(fā)生皮膚的乳頭狀瘤、發(fā)育不良和鱗狀細(xì)胞癌,另外幾乎所有的HPV8 E6陽(yáng)性小鼠自發(fā)地發(fā)生多灶性腫瘤,與HPV 8 CER小鼠相當(dāng),證明E6是誘導(dǎo)自發(fā)腫瘤發(fā)展至鱗狀細(xì)胞癌水平所必需且足夠的主要癌基因。當(dāng)在小鼠子宮頸中給予雌激素時(shí),K14 E7小鼠可發(fā)生宮頸癌,證明了E7癌蛋白與雌激素在小鼠宮頸中的強(qiáng)效共致癌活性[50]。除了K14啟動(dòng)子外,Borchers等[51]用人角蛋白10(hK10)作為啟動(dòng)子構(gòu)建K10-HPV16-E6/E7轉(zhuǎn)基因小鼠,并推斷E7轉(zhuǎn)基因表達(dá)在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)水平上誘導(dǎo)特異性免疫耐受。Michel等[52]也用K10構(gòu)建在基底層上表達(dá)HPV20和HPV27 E6和E7蛋白的轉(zhuǎn)基因SKH-hr 1無(wú)毛小鼠,并暴露于慢性UV照射,兩品系小鼠表皮層和乳頭狀瘤形成的增殖增強(qiáng),并發(fā)展成鱗狀細(xì)胞癌。

以牛角蛋白6(bK6)基因?yàn)閱?dòng)子也可產(chǎn)生表達(dá)HPV 16早期區(qū)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,HPV 病毒的轉(zhuǎn)錄一般在基底上層被激活,且依賴細(xì)胞分化,bK6 E6/E7轉(zhuǎn)基因小鼠中,E6/E7轉(zhuǎn)錄物在皮膚、子宮頸、十二指腸、胃和舌中過(guò)表達(dá)[53-55]。Crish等[56]用人外皮蛋白(hINV)啟動(dòng)子建立hINV-HPV16-E6/E7-SV 40轉(zhuǎn)基因小鼠,導(dǎo)致棘皮癥、角化不全和脫屑,小鼠的頰粘膜和舌上皮中也觀察到過(guò)度增殖。hINV是一種上皮組織基底上層早期分化的標(biāo)記,與角蛋白相比,外皮蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較低,普遍認(rèn)為該啟動(dòng)子比角蛋白啟動(dòng)子的活性低[42]。國(guó)內(nèi)高慧等[57]以pCEP4載體為骨架,人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子啟動(dòng)下游基因表達(dá),構(gòu)建pCEP4-CMV-HPV16 E6/7真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)受精卵顯微注射法獲得了可繁殖傳代的整合了HPV16E6/7基因,可自行發(fā)生皮膚腫瘤的HPV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。為了模擬成年人HPV感染,最近研究人員構(gòu)建了2種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因模型,他莫昔芬[58]和多西環(huán)素[59]分別誘導(dǎo)表達(dá)K14-CreERTam和K5-rtTA啟動(dòng)子系統(tǒng),誘導(dǎo)后癌基因E6和E7均高表達(dá),導(dǎo)致表皮快速增生。

高危型HPV與癌癥有關(guān),且這些病毒編碼的E6/E7癌蛋白已被證明在滅活p53和Rb方面更有效。上述研究都與高風(fēng)險(xiǎn)HPV不同亞型的癌蛋白的靶向作用相關(guān)。相比高危型HPV,低危型HPV轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)的研究較少。1992年Tinsley等[60]用角蛋白6(K6)基因的啟動(dòng)子區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小鼠中HPV1早期區(qū)域的表達(dá),HPV 1的存在與良性疣的形成有關(guān),作者在小鼠爪、耳、背部皮膚和舌的上皮覆蓋物中檢測(cè)到HPV轉(zhuǎn)錄本。新生兒尾部皮膚變得堅(jiān)硬,表面破裂成薄片,皮質(zhì)層角化不全、角化過(guò)度,基底上層增生。爪和尾部的皮膚的上基底層中檢測(cè)到E1-E4蛋白,轉(zhuǎn)基因小鼠的角蛋白K6和K16水平升高,與其過(guò)度增殖狀態(tài)一致,其表現(xiàn)與人類病毒疣觀察到的相似。最終小鼠的皮膚在出生后3周內(nèi)恢復(fù)正常,沒(méi)有觀察到良性或惡性乳頭狀瘤。Schenkel等[61]利用HPV11自身URR作為啟動(dòng)子,并觀察到報(bào)告基因的毛發(fā)特異性轉(zhuǎn)錄。Michel等[52]構(gòu)建K10-HPV27-E6/E7轉(zhuǎn)基因小鼠在慢性UV照射下發(fā)展成鱗狀細(xì)胞癌。

總的來(lái)說(shuō),低危型HPV癌蛋白的表達(dá)不產(chǎn)生穩(wěn)定的表型改變,而高危型HPV癌蛋白的表達(dá)產(chǎn)生穩(wěn)定和進(jìn)行性疾病。不同的組織特異性啟動(dòng)子在發(fā)育過(guò)程中的不同時(shí)間被激活,表達(dá)HPV癌蛋白,靶向組織方面HPV自身啟動(dòng)子不如異源啟動(dòng)子成功。在多種轉(zhuǎn)基因小鼠,小鼠呈現(xiàn)出相似或相矛盾的表型,有的還需要各種輔因子促進(jìn)致癌進(jìn)展。每種品系都有其自身的潛力和局限性。但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型允許選擇性地去除特定免疫途徑中的不同分子、其他細(xì)胞致癌基因和腫瘤抑制基因,通過(guò)減少或增加其抗腫瘤活性和/或其促腫瘤信號(hào),有助于進(jìn)一步研究HPV的致病機(jī)理和開發(fā)新的預(yù)防和治療措施。

2 HPV相關(guān)三維細(xì)胞培養(yǎng)模型

HPV在最初感染基底細(xì)胞后,HPV DNA擴(kuò)增并建立為低拷貝數(shù)的染色體外基因組,HPV基因組與宿主基因組一起復(fù)制。作為細(xì)胞分化周期的一部分,受感染的細(xì)胞從基底膜脫離并進(jìn)入基底上皮層。病毒E6和E7蛋白的表達(dá)促進(jìn)非預(yù)定的細(xì)胞周期進(jìn)展,支持連續(xù)的病毒復(fù)制。隨著細(xì)胞繼續(xù)分化,E1和E2蛋白的表達(dá)增加導(dǎo)致向生產(chǎn)性病毒DNA擴(kuò)增過(guò)渡。最后,病毒衣殼蛋白L1和L2在上皮的終末分化層內(nèi)合成,完成病毒體組裝。這意味著HPV的生命周期是分化依賴性的,需要重現(xiàn)三維復(fù)層上皮[62]。以下主要介紹3種三維細(xì)胞培養(yǎng)模型,器官型筏式培養(yǎng)模型、多細(xì)胞球體模型、類器官模型。

器官型筏式培養(yǎng)模型由Asselineau和Prunieras[63]開發(fā),是公認(rèn)能代表上皮組織的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型,角質(zhì)形成細(xì)胞被置于含或不含成纖維細(xì)胞的真皮等同物(例如去表皮皮膚、膠原蛋白或基質(zhì)膠)的頂部,通過(guò)在空氣-液體界面中支架上培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)分化和分層。由于角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物“漂浮”在空氣/液體界面處,故這種上皮細(xì)胞培養(yǎng)物通常被稱為“筏”培養(yǎng)物。該模型形成的復(fù)層和分化的上皮,為研究人員提供了研究嗜上皮病毒的有用手段,已應(yīng)用在研究HPV-癌癥/其他病毒相互作用、HPV生命周期、HPV的傳播及感染、評(píng)估HPV治療的有效性等方面,在體內(nèi)觀察到的HPV-宿主相互作用已被證明與該模型中的表現(xiàn)類似[9]。器官型筏式培養(yǎng)模型是迄今為止HPV研究中的一個(gè)重要里程碑。建立人原代上皮細(xì)胞的三維器官型培養(yǎng)模型步驟如下,第1步使用成纖維細(xì)胞(可使用永生化的人包皮成纖維細(xì)胞系或原代人成纖維細(xì)胞)和膠原蛋白建立真皮等同物;第2步將角質(zhì)形成細(xì)胞的基底層接種到含有活性成纖維細(xì)胞的真皮等同物上;第3步將“筏”提升到空氣-液體界面,及將“筏”轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)濕的膜插入物上,該膜插入物位于6孔板中分化培養(yǎng)基的表面上。然后使組織分化1—3周,進(jìn)行完全上皮分層。目前研究人員開發(fā)了來(lái)自肛門生殖道、口咽和皮膚上皮的人類HPV相關(guān)粘膜惡性腫瘤的體外三維器官型培養(yǎng)模型[64-65]。從健康或腫瘤相關(guān)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來(lái)源的組織建立的器官型培養(yǎng)模型在體外概括了其天然對(duì)應(yīng)物的組成和結(jié)構(gòu)組織(上皮分層、功能性基底膜、成纖維細(xì)胞聚集的基質(zhì)、復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)),能更好地闡明致癌過(guò)程中基質(zhì)和上皮間室之間的相互作用,代表了用于研究腫瘤進(jìn)展和評(píng)價(jià)非動(dòng)物模型中的聯(lián)合療法的新模型[66]。

球狀體是研究腫瘤的有力的模型,因?yàn)樗鼈兏爬四[瘤細(xì)胞的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)途徑和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué),產(chǎn)生球體的基本概念是促進(jìn)細(xì)胞相互作用,在附著表面或支架上聚集并經(jīng)歷自組裝,在這個(gè)過(guò)程中,單一分散的細(xì)胞形成三維微組織,它具有與人類腫瘤組織接近的表型特征[67]。最常用的模型是多細(xì)胞腫瘤球體模型,1970年Sutherland等[68]就開始培養(yǎng)多細(xì)胞腫瘤球體。構(gòu)建球狀體可以使用培養(yǎng)基和特殊方法避免細(xì)胞粘附在容器表面,比如轉(zhuǎn)瓶法,通過(guò)持續(xù)攪拌防止細(xì)胞附著在容器表面,促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞接觸,該方法相對(duì)簡(jiǎn)單,能產(chǎn)生大量球狀體,但具有高剪切力并且細(xì)胞大小和數(shù)量不可控[69]。懸滴法,依賴于重力在倒置的基底上形成球狀體,該方法價(jià)格低廉,球體大小可控,但大規(guī)模生產(chǎn)受到限制[70]。液體覆蓋法,用非粘附材料處理,防止細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)板并促進(jìn)球狀體形成,該方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高,但球狀體的大小和形狀是不均勻的。轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器(RWV)法,反應(yīng)器可使細(xì)胞在懸浮液中水平旋轉(zhuǎn),產(chǎn)生微重力,并促進(jìn)細(xì)胞聚集成球狀體,該方法提供低流體剪切環(huán)境和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和隨機(jī)化重力矢量的最小湍流[71],但設(shè)置較復(fù)雜,成本較高。磁懸浮法,用鐵或金氧化物處理細(xì)胞,再用磁鐵將它們懸浮在介質(zhì)中,促進(jìn)球體的形成,該方法能快速生成球體,但成本過(guò)高,金屬納米顆粒也可能會(huì)干擾球體的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。除了運(yùn)用特殊方法避免細(xì)胞粘附外,還可以運(yùn)用基質(zhì)促進(jìn)球體生長(zhǎng),其提供細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-基質(zhì)相互作用,細(xì)胞懸浮接種在基質(zhì)包被的平板上方或包埋在基質(zhì)內(nèi)。天然來(lái)源的基質(zhì)更能代表腫瘤微環(huán)境,因?yàn)樗鼈冾愃朴趯?shí)體瘤的基質(zhì)成分,最常用的是膠原蛋白或基質(zhì)膠,除此之外還可用成纖維細(xì)胞衍生基質(zhì)、絲素蛋白、藻酸鹽、透明質(zhì)酸等。合成基質(zhì)如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)和聚ε-己內(nèi)酯(PCL)可自行定制培養(yǎng)所需的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等添加劑,與天然基質(zhì)相比,這些基質(zhì)更均勻,但生理學(xué)適用性較差[72]。

類器官是三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的最新發(fā)展成果,可用于通過(guò)引入疾病突變或使用患者來(lái)源的人多能干細(xì)胞來(lái)模擬疾病,模擬疾病的類器官可以用作藥物測(cè)試的替代系統(tǒng),可以更好地再現(xiàn)人類患者的治療效果,甚至可能運(yùn)用到組織替代療法。類器官是從干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的器官特異性細(xì)胞類型的集合,并以類似于體內(nèi)的方式通過(guò)細(xì)胞分選和空間限制的譜系定型進(jìn)行自組織[73]。這使得類器官能夠比任何其他類型的三維細(xì)胞培養(yǎng)物更有效地復(fù)制親本組織的基因型和表型,甚至能夠刺激體內(nèi)細(xì)胞外囊泡的形成和分泌[74]。類器官并非沒(méi)有缺陷,其最常用的培養(yǎng)基質(zhì)為基質(zhì)膠,基質(zhì)膠來(lái)自小鼠肉瘤,不能完全重現(xiàn)人體組織微環(huán)境。但這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)有所改善,研究者將類器官與免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞或生態(tài)位細(xì)胞的分泌組分共培養(yǎng),以模擬人體組織微環(huán)境條件[75]。其次并非所有原代細(xì)胞都可以容易地培養(yǎng)為類器官,類器官生成也是一個(gè)相當(dāng)昂貴的過(guò)程。目前人類多能干細(xì)胞生成三維類器官仍處于起步階段,迄今為止,人類多能干細(xì)胞已經(jīng)被誘導(dǎo)產(chǎn)生腸、腎、腦、視網(wǎng)膜、子宮頸等類器官,子宮頸類器官提供了一個(gè)新的平臺(tái),以研究HPV驅(qū)動(dòng)的宮頸癌發(fā)展[73.76],但隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和組織再生技術(shù)的飛速發(fā)展,相信在不久的將來(lái),人類類器官會(huì)變得更加成熟且多樣化。

3 總結(jié)

尖銳濕疣由HPV感染引起,導(dǎo)致人肛門和外生殖器的皮膚黏膜贅生物生成。HPV6和HPV11在其發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位,若由HPV16、HPV18等高危型HPV感染引起,則伴有一定惡變潛力。在以上所描述的動(dòng)物模型和三維細(xì)胞培養(yǎng)模型中,MmuPV1感染小鼠模型可以模擬HPV感染、傳播和引起人類肛門生殖器乳頭狀瘤的發(fā)病機(jī)制,是研究尖銳濕疣極具潛力的模型之一。異種移植物模型雖然在研究初期有著移植物存活時(shí)間短、成功率低、缺少模擬HPV感染及發(fā)病過(guò)程等缺點(diǎn),但隨著轉(zhuǎn)基因人源化小鼠和種類增多和異種移植技術(shù)的成熟,尖銳濕疣異種移植物模型仍可作為其他模型在免疫應(yīng)答方面的替代或補(bǔ)充。各種高危型和低危型HPV癌蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型,也有助于研究HPV引起尖銳濕疣的致病機(jī)制,促進(jìn)相關(guān)疫苗和治療措施的開發(fā)。各種三維細(xì)胞培養(yǎng)模型有各自的優(yōu)勢(shì)和缺陷,但足以滿足研究HPV的整個(gè)分化依賴性生命周期,包括病毒體形態(tài)發(fā)生、病毒生長(zhǎng)、感染、發(fā)病機(jī)制和病毒-宿主相互作用等,相比動(dòng)物模型來(lái)說(shuō)更適合研究嗜上皮病毒,在倫理問(wèn)題、費(fèi)用、處理方法以及將研究結(jié)果從非人類模型轉(zhuǎn)化為臨床方面都要更有優(yōu)勢(shì)?？偠灾?隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改善,這些模型將成為研究人員研究尖銳濕疣和相關(guān)治療方案的主要平臺(tái)。本片文章分類總結(jié)了HPV相關(guān)疾病動(dòng)物模型和三維細(xì)胞培養(yǎng)模型,研究者可參考各模型優(yōu)缺點(diǎn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇適合的模型。