王一凡,張飛燕,孟祥荷,王雅娜,米婧璇,劉洪偉 ,趙山山,張麗萍

(1.河北工程大學(xué),河北 邯鄲 056009;2.河北省科學(xué)院生物研究所,河北 石家莊 050052;3.河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050057)

0 引言

Fengycin是芽孢桿菌屬微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1],是芽孢桿菌發(fā)揮抗生作用的重要物質(zhì)[2],其結(jié)構(gòu)、合成方式、特性、功能等不斷被發(fā)掘。在結(jié)構(gòu)上,由于Fengycin的脂肪酸部分如長(zhǎng)度、分支、羥基化和肽鏈中氨基酸的類型及序列不固定,可以有多個(gè)組合,常以多個(gè)同系物的混合形式共存于細(xì)胞中。Fengycin具有低生態(tài)毒性、溫和的生產(chǎn)條件、較高的穩(wěn)定活性以及高度的生物降解性等優(yōu)點(diǎn),且在馬鈴薯晚疫病[3]、棉花黃萎病[4]、辣椒疫霉病[5]、水稻米曲霉病[6]、蘋果青霉病[7]等多種植物病害,雞禽流感[8]等動(dòng)物病害以及結(jié)腸癌[9]和腫瘤[10]等人類臨床疾病上都有一定的應(yīng)用價(jià)值。但目前Fengycin產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高,嚴(yán)重限制了其生產(chǎn)應(yīng)用。本文在闡述Fengycin生物合成的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵工藝優(yōu)化、誘變育種及基因工程理性設(shè)計(jì)提高發(fā)酵水平進(jìn)行綜述,以期為解決Fengycin產(chǎn)量低等問題提供理論參考。

1 Fengycin的生物合成

Fengycin是由非核糖體途徑合成的脂肽類活性物質(zhì),在菌體生長(zhǎng)停止之后合成的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。Fengycin的肽環(huán)是由第3位的D-Tyr和末位的L-Ile以內(nèi)酯鍵結(jié)合而成,再與帶有14～18個(gè)碳原子的β-羥基脂肪酸以內(nèi)酯鍵連接(圖1)。

由于肽環(huán)上第3、4、6、9、10位氨基酸的變化,不同碳原子數(shù)的脂肪酸以及構(gòu)型的差異使得Fengycin也存在許多同系物和同分異構(gòu)體,如Fengycin A[11]、Fengycin B[12]、Fengycin C[13]、Fengycin S[14]等(表1)。

Fengycin由非核糖體肽合成酶NRPS通過腺苷?；Y(jié)構(gòu)域識(shí)別、結(jié)合特定的氨基酸,并由ATP激活,激活的氨基酸與4-磷酸泛酰巰基輔基以共價(jià)鍵形式結(jié)合,再與縮合結(jié)構(gòu)域特定部位結(jié)合,在縮合結(jié)構(gòu)域的作用下,按相鄰合成酶各組成模塊的順序依次向前直連接成多肽鏈。編碼Fengycin的操縱子fen由合成酶的基因fenC、fenD、fenE、fenA、fenB共同構(gòu)成,分別編碼FenC、FenD、FenE、FenA和FenB單體酶,它們線性排列共享一個(gè)啟動(dòng)子。每個(gè)單體酶一般含1～3個(gè)氨基酸激活模塊,且每個(gè)模塊具有接受特定氨基酸及形成相應(yīng)肽鍵的功能[15]。Fengycin的合成途徑是啟動(dòng)子啟動(dòng)后,FenC組裝前兩位氨基酸L-Glu和D-Orn;FenD組裝第三、四位氨基酸D-Tyr和D-Thr;FenE組裝第五、六位氨基酸L-Glu和D-Ala;FenA組裝七、八、九位氨基酸L-Pro、L-Gln和L-Tyr;FenB組裝最后一位氨基酸L-Ile[16],組裝完成后中斷肽鏈合成從NRPS上釋放出Fengycin。

2 Fengycin的合成策略

Fengycin在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)中都具有應(yīng)用價(jià)值,但因其合成生產(chǎn)存在產(chǎn)量低、成本高和規(guī)模小等問題,限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。目前只有MedChemExpress、SigmaAldrich等少數(shù)企業(yè)能夠微量生產(chǎn)。為了Fengycin能得到更加廣泛的應(yīng)用,主要通過發(fā)酵工藝優(yōu)化、誘變育種及基因工程理性設(shè)計(jì)等策略提高其產(chǎn)量。

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化可提高菌株的Fengycin產(chǎn)量。目前優(yōu)化主要集中在發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。Wei等人[17]通過單因素試驗(yàn)得到的培養(yǎng)基配方為木糖20.00 g/L、豆粕21.90 g/L、NaNO33.10 g/L、MnSO4·H2O 0.20 g/L,初始pH為7.50,轉(zhuǎn)速為180 r/min,發(fā)酵溫度為30 ℃,此發(fā)酵策略使菌株168DSABA的Fengycin產(chǎn)量提高了4.26倍。Maliheh等人[18]通過添加氨基酸來提高菌株UTB96的Fengycin產(chǎn)量,添加賴氨酸將Fengycin產(chǎn)量提高了27%,添加丙氨酸將Fengycin產(chǎn)量提高了47%。陳曉萌[19]通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的培養(yǎng)基配方為玉米粉3.85%、黃豆餅粉1.57%、FeSO4·7H2O 0.03%、NaH2PO4·2H2O 0.02%、Na2HPO4· 2H2O 0.04%,初始pH為7.00,接種量為8.50%,轉(zhuǎn)速為190 r/min,培養(yǎng)溫度為37 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為33 h,用優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)菌株Z-14使得Fengycin的產(chǎn)量提高了4.19倍。

2.2 誘變育種

通過菌種改造獲得高產(chǎn)Fengycin的菌株更具有實(shí)際生產(chǎn)意義,誘變育種是一種選育高產(chǎn)菌株的方法。陳尚里等人[20]通過紫外-ARTP-LiCl化學(xué)復(fù)合誘變選育高產(chǎn)菌株,先經(jīng)紫外誘變,與野生型菌株YA-215對(duì)比,突變菌株mutUV503的Fengycin產(chǎn)量從113.02 mg/L提高到221.39 mg/L,將突變菌株mutUV503繼續(xù)ARTP-LiCl誘變,與突變菌株mutUV503對(duì)比,突變菌株mutUA397的Fengycin產(chǎn)量從221.39 mg/L提高到388.34 mg/L,復(fù)合誘變后Fengycin的產(chǎn)量提高了3.44倍。高兆建等人[21]采用紫外線-硫酸二乙酯化學(xué)復(fù)合誘變的方法,誘變菌株XF32,將突變菌株XF32-22所產(chǎn)Fengycin的抑菌活性提高了1.53倍。

2.3 基因工程理性設(shè)計(jì)

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,基于合成生物學(xué)基礎(chǔ)利用基因工程手段改造菌種對(duì)Fengycin的代謝途徑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)提高Fengycin的產(chǎn)量是未來的發(fā)展方向?；蚬こ淌侄沃饕瑔?dòng)子替換、前體物質(zhì)合成途徑設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因改造、分泌途徑改造等。

2.3.1 啟動(dòng)子替換

Fengycin的合成基因簇長(zhǎng)達(dá)37 kb,利用過表達(dá)方式來提高Fengycin的產(chǎn)量難度較大,而啟動(dòng)子可以決定基因表達(dá)水平,因此替換fen啟動(dòng)子成為提高產(chǎn)量的有效手段。替換啟動(dòng)子主要是選擇天然強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及人工嵌合誘導(dǎo)啟動(dòng)子。Jin等人[22]將Fengycin生物合成基因簇的原生啟動(dòng)子替換為階段依賴型啟動(dòng)子PYLB,Fengycin產(chǎn)量從121.20 mg/L提高至137.05 mg/L。Yaseen等人[23]將來自B.subtilisBBG111的PPPS啟動(dòng)子替換為來自BBG21的PFEN啟動(dòng)子時(shí),Fengycin的產(chǎn)量提高了約10倍。

2.3.2 前體物質(zhì)合成途徑設(shè)計(jì)

在Fengycin合成過程中,脂肪酸及氨基酸前體的生物合成是第一步,前人對(duì)氨基酸及脂肪酸供應(yīng)改變是否會(huì)影響Fengycin產(chǎn)量進(jìn)行了相關(guān)研究。Gao等人[24,25]提高脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因opuE的表達(dá)量后,添加8.00 g/L外源脯氨酸,枯草芽孢桿菌Fengycin的產(chǎn)量從753.47 mg/L提高到871.86 mg/L;通過上調(diào)脂肪酸途徑中相關(guān)基因的表達(dá),將Fengycin產(chǎn)量從174.63 mg/L升高至258.52 mg/L。Shu等人[26]分析了由fenE編碼的酶的功能,它包含兩個(gè)氨基酸激活模塊,FenE1和FenE2,FenE1激活L-Glu,FenE2激活和L-Ala、L-Val和l-2-氨基丁酸,這解釋了為什么枯草芽孢桿菌F29-3產(chǎn)生了兩種類型的Fengycin——Fengycin A和Fengycin B,與L-Ala相比,L-Val是FenE2體外更好的底物,這一發(fā)現(xiàn)與菌株F29-3產(chǎn)生的Fengycin B通常是Fengycin A的2倍的觀察結(jié)果一致。

2.3.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因改造

Fengycin的合成需要多種調(diào)控因子參與,可通過過表達(dá)或敲除這些調(diào)控因子的基因提高Fengycin產(chǎn)量。Lu等人[27]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加果糖改變了氨基酸合成、脂肪酸代謝和能量代謝的轉(zhuǎn)錄,這些代謝途徑的改變有助于Fengycin的合成,使得Fengycin操縱子的表達(dá)水平提高了2倍。Gao等人[28]將編碼Dahms木糖利用途徑的基因整合到菌株168的amyE位點(diǎn),并基于Dahms途徑的代謝特性,敲除乙酸激酶(ACKA)和乳酸脫氫酶(LDH)基因,將乙醛轉(zhuǎn)化為蘋果酸和草酰乙酸,乙醇醛再循環(huán)到TCA循環(huán)中,從而產(chǎn)生菌株BSU03,Fengycin的產(chǎn)量較原菌株增加了87%。

2.3.4 分泌途徑改造

對(duì)Fengycin分泌途徑的改造,可通過強(qiáng)化表達(dá)參與其分泌的跨膜蛋白增加產(chǎn)出。Fu等人[29]基于iTRAQ的菌株NCD-2蛋白組學(xué)分析PhoPR雙組分系統(tǒng)調(diào)控,與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的比較分析揭示了支鏈氨基酸對(duì)Fengycin生成的調(diào)控,PhoPR雙組分系統(tǒng)(TCS)是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,用于調(diào)節(jié)菌株的磷酸鹽饑餓反應(yīng),并調(diào)節(jié)低磷酸鹽條件下菌株NCD-2中Fengycin的產(chǎn)生,研究結(jié)果表明,PhoPR TCS通過影響支鏈氨基酸生物合成來調(diào)節(jié)Fengycin的產(chǎn)生。Zhao等人[30]對(duì)親本菌株ES-2-4和基因組重排菌株FMB72進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,以檢測(cè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì),在鑒定的44個(gè)蛋白中,信號(hào)蛋白Com A和Spo0A可能在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控Fengycin的合成。

3 展望

Fengycin具有低毒性、較高穩(wěn)定性和高度生物降解性等優(yōu)勢(shì)屬性,在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。Fengycin在實(shí)驗(yàn)室研究階段已取得一定進(jìn)展,但其大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化仍受限于發(fā)酵工藝、生產(chǎn)菌種和生產(chǎn)成本等因素。展望未來,在發(fā)酵工藝方面,發(fā)酵液的泡沫分離及下游的提取純化等問題亟待解決。在誘變育種方面,開發(fā)新的高效誘變方法誘變高產(chǎn)菌株、新篩選方法減少高產(chǎn)菌株篩選的工作量。在基因工程理性設(shè)計(jì)方面,還需要探索效果更好的啟動(dòng)子,尋找更合適的氨基酸及脂肪酸供應(yīng)途徑,研究調(diào)控因子參與合成的方式,從而提高Fengycin產(chǎn)量。