張云龍 李若琳

(江蘇理工學(xué)院 材料工程學(xué)院，江蘇 常州 213001)

生物相容性是生物醫(yī)用材料的重要指標(biāo)，指的是材料在一段時間內(nèi)充分發(fā)揮其功能而不對植入部位或附近組織和器官產(chǎn)生不利影響的能力[1]。鈦及鈦合金是生物惰性材料，耐所有體液和組織的腐蝕，鈦植入物與宿主組織和骨骼的物理附著率很高，不易引起人體的排異反應(yīng)。在氧化環(huán)境中，鈦表面自發(fā)形成一層薄而粘接的TiO2層，具有誘導(dǎo)體液中鈣、磷離子生成磷灰石的能力，表現(xiàn)出一定的生物活性，使其具有良好的生物相容性和耐腐蝕性[2]。憑借以上特性以及輕質(zhì)且優(yōu)良的力學(xué)性能，鈦及鈦合金在過去的幾十年里成為人工關(guān)節(jié)、牙種植體、脊柱矯形內(nèi)固定系統(tǒng)、髓內(nèi)釘?shù)热梭w硬組織替代物和修復(fù)物的首選材料[3]。

雖然醫(yī)用鈦合金已成為骨科、齒科和心血管等植介入物或器械用主要材料，但在應(yīng)用中也暴露出了一些問題，其中最為關(guān)鍵的是鈦合金與人骨的彈性模量不匹配，植入后產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽，導(dǎo)致植入體的松動、脫落等。合金化是降低應(yīng)力屏蔽的有效方法之一，通過在鈦合金中加入Ta、Nb、Zr、Sn等β相穩(wěn)定元素，在組織中引入β相以降低彈性模量[4]。據(jù)報道，經(jīng)過不同熱處理獲得的β鈦合金的楊氏模量可從110 GPa降低至42 GPa[5]。另一種備受關(guān)注的方法是多孔化，多孔化不僅可以模仿天然骨的結(jié)構(gòu)，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)入孔隙，為藥物或蛋白質(zhì)傳遞提供空間，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)功能一體化[6]。多孔鈦的制備方法有很多，大體可分為粉末冶金法和化學(xué)合成法兩類:粉末冶金法包括壓制成型、無壓成型、造孔劑法、漿料成型以及粉末床激光/電子束增材制造等;化學(xué)合成法包括反應(yīng)燒結(jié)、燃燒合成、熱還原以及去合金法等[7]。粉末燒結(jié)制備的多孔鈦力學(xué)性能較差，鈦纖維燒結(jié)法制備的多孔鈦彈性模量較低，且孔隙形狀和尺寸難以控制[8]。3D打印技術(shù)可以制造具有復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的多孔鈦零件，但在打印時金屬粉末的氮氧含量顯著增加，導(dǎo)致零件的疲勞性能降低[9- 10]。鈦網(wǎng)層疊燒結(jié)是一種較為簡便且可設(shè)計性高的方法，通過控制鈦網(wǎng)孔徑(目數(shù))、層疊方式、壓力可以調(diào)整燒結(jié)實(shí)體的孔隙率，實(shí)現(xiàn)對力學(xué)性能的調(diào)控[11]。

要實(shí)現(xiàn)植入體的長效安全性和功能性，鈦合金的生物及力學(xué)相容性仍有待提高。多孔疏松結(jié)構(gòu)是降低彈性模量的有效方法，但多孔化后可能對生物相容性有一定的影響?；诖?，本文以常見的醫(yī)用鈦合金TC4(Ti- 6A1- 4V)網(wǎng)為原料，采用層疊燒結(jié)法制備多孔試樣，對其顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過對比多孔和實(shí)體鈦合金表面成骨細(xì)胞的黏附及鋪展情況及后續(xù)的細(xì)胞毒性測試結(jié)果，研究了多孔鈦合金表面的生物活性并探討了其作用機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品制備

試驗(yàn)材料選用纖維直徑為150 μm的TC4鈦合金網(wǎng)，化學(xué)成分為Ti- 6.2Al- 4.1V- 0.1Fe。首先將其用配比為1∶3∶7的酒精、硝酸、氫氟酸溶液進(jìn)行酸洗，以去除纖維表面的油漬及缺陷，直至鈦合金網(wǎng)表面呈現(xiàn)銀白色金屬光澤；隨后，將TC4網(wǎng)裁剪成φ18 mm的圓片，放入丙酮中進(jìn)行超聲波清洗，空氣中干燥后，將5個圓片放入臺式電動壓片機(jī)所配套的磨具內(nèi)進(jìn)行預(yù)壓，壓力為95 MPa，保壓時間為80～120 s，所得樣品高度約4 mm；最后，將裝有試樣的石英管置于真空固結(jié)設(shè)備，按圖1(a)所示的升溫曲線進(jìn)行燒結(jié)，升溫至1 100 ℃保溫2 h，真空度保持在5×10- 3Pa。該升溫曲線為經(jīng)過多次試驗(yàn)所得的優(yōu)選方案，能夠獲得表面質(zhì)量和力學(xué)性能良好的多孔鈦合金片狀樣品，如圖1(b)所示。

圖1 多孔鈦的燒結(jié)曲線(a)及其樣品(b)Fig.1 Sintering curve of the porous titanium(a) and its sample(b)

1.2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

使用小鼠MC3T3- E1前成骨細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，分別采用直接接觸法和浸提液法檢測細(xì)胞毒性。首先，將處理好的實(shí)體鈦合金片和多孔鈦合金試樣用牛皮紙包裹，放在玻璃容器中，隨后放入高壓鍋內(nèi)(Sanyo Labo autoclave)，120 ℃滅菌20 min，在醫(yī)用干燥箱內(nèi)烘干，取出后在超凈臺中冷卻，靜置過夜。為了降低試驗(yàn)誤差，分別準(zhǔn)備11個實(shí)體鈦合金和多孔鈦合金樣品，其中3個進(jìn)行浸提液試驗(yàn)，6個進(jìn)行直接接觸試驗(yàn)，2個用來觀察細(xì)胞黏附行為。

次日，對超凈臺內(nèi)所用物品進(jìn)行紫外殺菌(30 min)，將多孔和實(shí)體TC4支架試樣分別放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，其中實(shí)體和多孔鈦合金兩種浸提液分別種植3個孔，實(shí)體和多孔鈦合金分別種植8個孔。浸提液法：浸提介質(zhì)為含血清培養(yǎng)基，按照6 cm2/mL 的比例，在(37±1)℃條件下浸提(72±2)h；采用0.66 mL浸提液，將成骨細(xì)胞以2×104個/mL的密度種植于24孔板，連續(xù)培養(yǎng)5天。直接接觸法：將實(shí)體和多孔鈦試樣置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入600 μL培養(yǎng)基，再將細(xì)胞以2×104個/mL的密度種植于試樣表面，每孔200 μL細(xì)胞懸浮液，以空白組為對照，細(xì)胞貼壁長滿后消化下來，未長滿只需換液即可，連續(xù)培養(yǎng)5天后，對用于觀察細(xì)胞黏附行為的樣品進(jìn)行固定處理，其余進(jìn)行吸光度測試。細(xì)胞固定方法：將孔內(nèi)未經(jīng)消化的培養(yǎng)液吸出倒掉，加入95%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)或10%甲醛固定10 min，用磷酸鹽緩沖液沖洗兩次，干燥后進(jìn)行掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察。分別稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO4和0.27 g KH2PO4配制1 000 mL磷酸鹽緩沖液。

吸光度(optical density, OD)測試：細(xì)胞貼壁長滿后將24孔板中培養(yǎng)液吸出倒掉，每孔加入200 μL胰酶，消化3 min后加入300 μL培養(yǎng)基/孔種植消化；吹勻均分到96孔板中(每孔125 μL)，每孔加入100 μL培養(yǎng)基+20 μL MTT溶液(甲基噻唑基四唑5 g/L，溶于磷酸鹽緩沖液，過濾后，-4 ℃避光保存，需提前配制)；然后放入培養(yǎng)箱孵化4 h后，產(chǎn)生沉淀，吸去上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，用Biorad 680型酶標(biāo)儀(波長490 nm)測定各孔吸光度。根據(jù)測得的吸光度值計算細(xì)胞數(shù)量并作圖。以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔鈦的顯微組織

采用鈦網(wǎng)層疊燒結(jié)制備的多孔鈦的孔隙率約為50%，其微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。鈦合金網(wǎng)在壓制過程中旋轉(zhuǎn)一定角度后疊加，這種疊加方式可增大鈦合金纖維之間的結(jié)合力。從圖2可見，鈦合金纖維之間基本以平行的方式排列，形成三維貫通規(guī)則孔隙，呈現(xiàn)規(guī)則的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，孔尺寸在一百到幾百微米之間。多孔植入體植入人體后所發(fā)生的骨誘導(dǎo)是一個三維過程。目前普遍接受的是形成骨長入多孔鈦孔隙尺寸大于100 μm即可。Parikh[12]研究指出，僅僅有孔隙對于形成骨內(nèi)生長還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，孔隙要相互貫通，且貫通孔尺寸大于100 μm。因此，本文所制備的多孔鈦孔隙滿足骨長入要求，且孔隙排列規(guī)則，有利于調(diào)控多孔鈦的彈性模量和屈服強(qiáng)度，以適應(yīng)不同環(huán)境的需要。

多孔鈦合金支架在種植初期，由于表面有一層致密的TiO2鈍化層，易與植入組織間形成一層纖維組織，植入人體后難以誘導(dǎo)磷酸鹽沉積，因此在沉積磷酸鹽涂層之前，需對多孔鈦合金進(jìn)行表面活化。鈦合金纖維原料在拉拔過程中表面產(chǎn)生了大量裂紋，且在編織成鈦網(wǎng)過程中表面黏附了大量油性潤滑劑，因此需對鈦合金網(wǎng)進(jìn)行酸洗，并且酸洗可改善多孔鈦合金的表面氧化層結(jié)構(gòu)及表面粗糙度。圖3為酸處理前后多孔鈦合金表面SEM形貌。酸洗前多孔鈦合金表面雜亂無規(guī)則，存在大量因纖維拉拔產(chǎn)生的裂紋、脫出顆粒等缺陷，不利于后續(xù)生物涂層的均勻附著，成為后續(xù)材料因涂層結(jié)合力差而失效及因纖維表面顆粒脫落而制毒等潛在危險因素。酸洗后多孔鈦合金表面呈現(xiàn)規(guī)則的階梯型層片結(jié)構(gòu)，層片表面平整光滑，在無缺陷的前提下，層片結(jié)構(gòu)可顯著提高鈦合金的表面粗糙度，增強(qiáng)了生物涂層的附著力和結(jié)合力，為后續(xù)表面改性提供良好的基礎(chǔ)。酸洗還能夠顯著降低層疊燒結(jié)多孔鈦的楊氏模量，而屈服強(qiáng)度變化不大[13]。

圖3 酸洗前(a)、后(b、c) 多孔鈦合金表面SEM形貌Fig.3 SEM morphologies of the surface of porous titanium alloy before(a) and after(b,c) pickling

2.2 多孔鈦的生物相容性

圖4(a)和圖4(b)分別為裝有實(shí)體和多孔TC4支架的24孔板底部細(xì)胞培養(yǎng)5天的形貌，圖中黑色部分為實(shí)體和多孔鈦合金支架。由圖4(a)可以看出，細(xì)胞死亡較少，生長狀態(tài)良好，已有部分細(xì)胞在孔板底部黏附和鋪展。由圖4(b)可知，細(xì)胞大量增殖，形態(tài)良好，在孔板底部黏附,鋪展較充分。試驗(yàn)證明，多孔鈦的浸出液無毒，且由于多孔鈦特殊的多孔結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)液流動性更好，細(xì)胞增殖更多。但由于多孔鈦不透光，細(xì)胞固定后才能觀察到多孔鈦表面黏附的細(xì)胞形態(tài)。圖5為成骨細(xì)胞在多孔鈦表面培養(yǎng)5天后的形貌?？梢姸嗫租伇砻嬗猩倭考?xì)胞黏附和鋪展，并出現(xiàn)了跨纖維的孔內(nèi)延伸生長，證明多孔鈦合金無毒，且具有一定的生物相容性。

圖4 裝有實(shí)體(a)和多孔(b)TC4支架的24孔板底部細(xì)胞培養(yǎng)5天的形貌Fig.4 Micrographs of cells cultured for five days at the bottom of a 24- well plate containing solid(a) and porous TC4 scaffolds(b)

圖5 成骨細(xì)胞在多孔鈦合金表面培養(yǎng)5天后的黏附及鋪展Fig.5 Adhesion and spreading of osteoblasts on the surface of porous titanium alloy after culturing for five days

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，24孔板的對照孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)5天后全部貼壁生長；多孔鈦合金浸提液種植的3個孔中只有1個孔內(nèi)細(xì)胞生長良好，細(xì)胞貼壁率可達(dá)85%以上，其余2個孔內(nèi)細(xì)胞貼壁率只有35%～45%；而裝有實(shí)體鈦合金浸提液的3個孔內(nèi)細(xì)胞貼壁情況均較差，細(xì)胞貼壁率只有15%～30%，說明鈦合金支架的浸提液不利于小鼠前成骨細(xì)胞的生長和鋪展。

圖6為實(shí)體和多孔鈦合金分別種植的6個孔的吸光度測試結(jié)果，每個孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量均低于不放鈦合金支架的6個孔板(空白對照組)，且差異顯著。以對照組細(xì)胞存活率為100%，計算得到實(shí)體鈦合金浸提液孔、多孔鈦合金浸提液孔、實(shí)體鈦合金、多孔鈦合金的細(xì)胞存活率分別為24.74%、43.05%、12.77%、28.60%。與實(shí)體鈦合金相比，多孔鈦合金的直接接觸孔和浸提液孔內(nèi)的細(xì)胞存活率即細(xì)胞數(shù)量相對較高，但差異不顯著。實(shí)體和多孔鈦合金種植的直接接觸孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量均低于浸提液孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，差異也不顯著。4種樣品的重復(fù)試驗(yàn)孔內(nèi)細(xì)胞的生長和鋪展情況均有差異，相應(yīng)的吸光度差異也較大。試驗(yàn)證明，相較實(shí)體鈦合金，多孔鈦合金具有更好的生物相容性。

圖6 吸光度- 細(xì)胞數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線(a)與各樣品中細(xì)胞數(shù)量(b)Fig.6 OD standard curve against cell number (a) and cell number in each sample(b)

由于多孔鈦合金特殊的三維貫通孔隙結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)基具有良好的流動性，并且鈦合金纖維大大增加了細(xì)胞可生長和鋪展的面積，更有利于細(xì)胞的黏附和增殖，鈦合金纖維的直徑越小，細(xì)胞越易出現(xiàn)跨纖維黏附生長[14]。而實(shí)體鈦合金完全占據(jù)孔板底部，細(xì)胞的生長和鋪展面積受限，培養(yǎng)液流動性差，因此細(xì)胞的鋪展和增殖較少。

3 結(jié)論

通過層疊燒結(jié)法制備的多孔鈦合金呈現(xiàn)規(guī)則的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，孔隙尺寸在一百到幾百微米之間，滿足骨長入要求。酸洗顯著提高了鈦合金表面粗糙度，增強(qiáng)了生物涂層的附著力和結(jié)合力。細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明，多孔鈦合金無毒，較實(shí)體鈦合金具有更高的細(xì)胞存活率，即具有更好的生物相容性。