楊孟迪，丁雨露，王玉潔，何風(fēng)英，孫琳楠，甄東戶

1.蘭州大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院 內(nèi)分泌科， 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是在糖尿病基礎(chǔ)上形成的以骨量減少、骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、脆性增加為特點，進(jìn)而容易發(fā)生骨折的一種代謝性骨病。其中高糖抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的成骨分化，促進(jìn)成脂分化，是導(dǎo)致DOP患者骨形成減少、骨穩(wěn)態(tài)破壞的重要原因[1]。Wnt/β-catenin信號通路是決定BM-MSCs命運的關(guān)鍵信號通路[2]。在高糖(high glucose, HG)環(huán)境下BM-MSCs的成骨潛能會因該信號通路的抑制而受損，微小RNA(microRNA，miRNA)作為當(dāng)前研究最熱表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子，在這個過程中起著至關(guān)重要的作用，決定了該信號通路下游的基因在細(xì)胞中的表達(dá)[3]。本文主要以Wnt/β-catenin信號通路為軸心， 對HG環(huán)境中異常表達(dá)的 miRNA在調(diào)控BM-MSCs成骨分化過程中的具體作用途徑進(jìn)行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類長度約21～25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA。前體miRNA在細(xì)胞核經(jīng)過處理后轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)，并在細(xì)胞質(zhì)中被核酸內(nèi)切酶加工為成熟的miRNA，后者通過結(jié)合argonaute蛋白形成miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，與信使RNA的3′非翻譯區(qū)互補結(jié)合，控制信使RNA的翻譯或降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[4]。

2 經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路與成骨分化

Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控BM-MSCs成骨細(xì)胞分化的經(jīng)典路徑。Wnt蛋白與跨膜受體卷曲蛋白(frizzled, Frz)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein 5 and 6,LRP5/6)結(jié)合后，活化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)支架蛋白(disheveled,DVL)，使得軸蛋白(axis inhibitor, Axin)-結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)-糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)所形成的降解復(fù)合物解離，穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白(β-catenin)。后者在胞質(zhì)內(nèi)不斷積累，隨后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核激活Wnt相關(guān)靶基因的表達(dá)，如：成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)，達(dá)到促進(jìn)成骨分化的目的[5]。

3 異常表達(dá)miRNAs調(diào)控Wnt信號通路導(dǎo)致DOP

Wnt/β-catenin信號通路中許多蛋白表達(dá)水平均可影響B(tài)M-MSCs向成骨細(xì)胞分化的過程。β-catenin被視為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的核心，其上下游乃至本身都可受到miRNA的調(diào)控。下面將從miRNA對β-catenin上游信號、β-catenin本身、其他通路信號因子與該通路的串?dāng)_、RUNX2表達(dá)的影響來分別闡述miRNA在DOP發(fā)生中的作用(圖1)。

3.1 異常表達(dá)miRNA作用于β-catenin調(diào)控成骨分化

首先，轉(zhuǎn)錄阻抑物鋅指E-box結(jié)合同源異型盒2(zinc finger E-box binding homeobox-2,ZEB2)位于β-catenin上游，可以通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白增加胞質(zhì)β-catenin的表達(dá)。HG通過上調(diào)靶向ZEB2的miR-493-5p，抑制Wnt/β-catenin途徑進(jìn)一步阻止人BM-MSCs的成骨分化，最終導(dǎo)致DOP[6]。DDX17(DEAD-box protein17,DDX17)屬于RNA解旋酶家族，可以增強β-catenin靶基因的轉(zhuǎn)錄。miR-9-5p的下調(diào)改善了HG條件下BM-MSCs的體外成骨分化，并通過靶向DDX17緩解了體內(nèi)大鼠的DOP狀況[7]。其次，miRNA也通過靶向Wnt信號拮抗劑影響該通路。HG降低了MC3T3-E1成骨細(xì)胞中miR-295的表達(dá)， 從而上調(diào)了Dickkopf-1(DKK1)的蛋白表達(dá)水平。DKK1可通過結(jié)合LRP6， 促使胞質(zhì)β-catenin降解，抑制Wnt /β-catenin途徑[8]。GSK-3β是又一個經(jīng)典Wnt信號通路的抑制劑，一方面，GSK-3β受胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors1，IGF-1)調(diào)控，另一方面，活化的GSK-3β導(dǎo)致胰島素受體底物(insulin receptor substrate, IRS)降解，導(dǎo)致β-catenin上游組分DVL-2的穩(wěn)定性降低，促使β-catenin降解[9]。在HG處理的大鼠BM-MSCs中，miR-124-3p的抑制使得Wnt通路中的GSK-3β上調(diào)，加強了HG對β-catenin的表達(dá)的抑制，促使β-catenin降解，從而使糖尿病大鼠BM-MSCs成骨分化受阻，引起DOP的發(fā)生[10]。而miR-29c-3p通過有針對性地調(diào)節(jié)DVL2表達(dá)來減少DOP大鼠的骨質(zhì)流失[11]。動物實驗表明，miR-26a通過阻止糖尿病小鼠體內(nèi)DKK1的上調(diào)以及抑制GSK-3β的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨形成[12]。再者，一些miRNA通過作用于β-catenin本身，從而影響成骨分化。HG隨著時間和劑量的增加顯著上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞miR-214-3p的表達(dá)。后者通過直接與β-catenin的3′-UTR結(jié)合而降低了β-catenin的mRNA和蛋白水平，抑制了Wnt/β-catenin途徑，從而抑制成骨細(xì)胞分化[13](表1)。上述研究表明干預(yù)β-catenin的表達(dá)可為控制DOP提供新的思路。

圖1 異常表達(dá)miRNAs調(diào)控Wnt信號通路導(dǎo)致DOPFig 1 Abnormally expressed miRNAs lead to DOP by regulating Wnt signal pathways

3.2 異常表達(dá)miRNA通過IGF/β-catenin調(diào)控成骨分化

骨骼形成和吸收并非是由一條通路孤立起作用的，不同信號通路之間相互交叉相互影響。Wnt信號作為骨骼發(fā)育中必不可少的途徑，其中的信號分子能夠與其他途徑的信號分子相互干擾，從而調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育過程[14]。miRNA決定了多種信號分子的表達(dá)，也在這其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors1，IGF-1)是葡萄糖和骨骼代謝紊亂的關(guān)鍵介質(zhì)，并在DOP的發(fā)生中起重要作用[15]。IGF-1是與胰島素原高度同源的小肽激素，其發(fā)揮作用主要通過與特異性受體(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-R)結(jié)合，誘導(dǎo)IRS磷酸化，觸發(fā)下游信號通路，進(jìn)而生成成骨所需的各種因子，如RUNX2[16]。IGF-1不僅可以激活MAPK/ERK通路，還可以通過調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的組成部分GSK-3β進(jìn)一步調(diào)節(jié)β-catenin，并且其受體也可以通過穩(wěn)定DVL2(β-catenin上游成分)來促進(jìn)Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)，實現(xiàn)兩個通路的協(xié)同工作[9]。

使用小劑量鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂喂養(yǎng)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，提取BM-MSCs并使用不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化時發(fā)現(xiàn)，在HG培養(yǎng)基中，大鼠BM-MSCs中的miR-221-3p和miR-222-3p的表達(dá)顯著升高， 使得IGF-1mRNA和IGF-1表達(dá)下調(diào)，抑制了BM-MSCs中成骨所需相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制成骨分化[17]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3 (insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP-3)作為IGF轉(zhuǎn)運蛋白，起到儲存和“緩沖”的作用[18]。在DM伴OP患者的血清中發(fā)現(xiàn)HG狀態(tài)下miR-210表達(dá)上調(diào)。一方面， miR-210表達(dá)上調(diào)影響血管生成，影響骨代謝;另一方面，上調(diào)miR-210抑制IGFBP3表達(dá)， 導(dǎo)致IGFBP3與IGF-1二者結(jié)合率降低，削弱IGF-1在骨代謝過程中的正向作用，進(jìn)一步加重骨代謝紊亂[19]。中藥淫羊藿-仙茅藥及利拉魯肽都通過調(diào)控體內(nèi)miRNA-144表達(dá)水平提高IRS1表達(dá)，保護(hù)HG狀態(tài)下的成骨分化[20-21]。這為DOP的新藥研發(fā)和治療提供了新方向(表2)。

表1 異常表達(dá)miRNA作用于β-catenin調(diào)控成骨分化

3.3 異常表達(dá)miRNA通過RUNX2調(diào)控成骨分化

RUNX2是BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化和由分化的成骨細(xì)胞形成骨所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也是各個信號通路發(fā)揮作用的共同樞紐。其表達(dá)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，如：堿性磷酸酶、骨鈣素及Ⅰ型膠原等[22]。RUNX2可受到miRNA的調(diào)控，影響其控制基因的表達(dá)，進(jìn)而影響成骨。

miR-205及miR-340-5p的過表達(dá)直接抑制靶基因RUNX2的表達(dá)，抑制了患有DOP的雌鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[23-24]。轉(zhuǎn)錄激活因子1(silent information regulator 1，SIRT1)可與RUNX2相互作用，并通過積極促進(jìn)RUNX2轉(zhuǎn)錄來刺激成骨細(xì)胞分化。在探索DOP的發(fā)病機制時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中顯著上調(diào)的miR-155直接作用于SIRT1，抑制其在人BM-MSCs的表達(dá)，進(jìn)而抑制了成骨分化關(guān)鍵標(biāo)志因子RUNX2的表達(dá)，從而抑制人BM-MSCs成骨分化[25]。特異AT序列結(jié)合蛋白2(special AT-rich sequence-binding protein2，SATB2)是一個有效的成骨誘導(dǎo)因子,不僅可以直接促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá),還可能通過協(xié)同作用增強其他轉(zhuǎn)錄因子影響RUNX2等，調(diào)節(jié)骨發(fā)生和成骨細(xì)胞的分化。在DOP小鼠來源的BM-MSCs中，miR-31的表達(dá)明顯升高，并且miR-31通過直接與靶基因SATB2的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，減少SATB2生成，繼而下調(diào)RUNX2的表達(dá)，同時降低其協(xié)同作用，參與HG抑制的成骨分化[26-27](表3)。上述研究不僅證實了RUNX2在成骨細(xì)胞增殖分化過程中的核心地位， 而且圍繞在RUNX2周圍發(fā)揮調(diào)控作用的miRNA有可能成為DOP治療的新靶點。

表2 異常表達(dá)miRNA作用于IGF/β-catenin調(diào)控成骨分化

表3 異常表達(dá)miRNA作用于RUNX2調(diào)控成骨分化Table 3 Abnormal expression of miRNA plays an important role in the regulation of osteogenic differentiation by RUNX2

4 問題與展望

參與DOP骨代謝過程的miRNA及其靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)證實了miRNA在維持糖尿病骨的動態(tài)平衡方面具有巨大潛力，對DOP的認(rèn)識由原來的細(xì)胞層面拓寬到分子層面。目前已有的研究多是圍繞著與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)的成骨分化展開的，但對于其他通路以及破骨細(xì)胞方面的研究相對較少。盡管一些miRNA模擬物及抑制物的作用已在動物模型及體外實驗中得到證實，但如何將其應(yīng)用于DOP的診斷以及如何研制靶向投遞miRNA模擬物或抑制物的技術(shù)并且使其在逆轉(zhuǎn)糖尿病患者骨代謝失衡中發(fā)揮作用，目前尚不明確。未來可針對各種miRNA及其靶標(biāo)探索不同信號通路在DOP骨代謝中的作用，并嘗試建立信號通路網(wǎng)絡(luò)，深入研究miRNA作為DOP潛在生物診斷標(biāo)志物的意義，以便開展針對此疾病的新診療策略及治療手段。