封寶紅，喻業(yè)安，晏 莉，伍 軍，張艷霞，朱戈麗

武漢大學(xué)附屬武漢市第三醫(yī)院 腎內(nèi)科, 湖北 武漢 430014

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)具有多向分化潛能，但在老年期，BM-MSCs更多地向脂肪細(xì)胞分化，可引起骨形成減少，進(jìn)而導(dǎo)致老年性骨質(zhì)疏松癥[1]。目前關(guān)于BM-MSCs成脂分化相關(guān)的分子機(jī)制尚不明確，因此，探究該機(jī)制對(duì)于老年性骨質(zhì)疏松癥的治療具有重要意義。研究表明，H2O2可用于誘導(dǎo)BM-MSCs分化，且多種miRNA參與調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的BM-MSCs分化，如miR-183-5p在H2O2誘導(dǎo)的BM-MSCs中高表達(dá)，過表達(dá)miR-183-5p可抑制BM-MSCs成骨分化[2]。過表達(dá)miR-210可促進(jìn)犬BM-MSCs向成骨方向分化[3]。此外，miR-210可參與緩解H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，改善心肌功能[4]。本研究旨在探討miR-210對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BM-MSCs成脂分化的影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠[廣州銳格生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2021-0059]，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則且得到武漢市第三醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ZACUC20210421-14)。

1.1.2 主要試劑：30% H2O2(上海澤葉生物公司)；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferatior-activated receptor，PPARγ)、CCAAT/強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα)抗體(Santa Cruz公司)；抗CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5、CD90-PE流式抗體、兔源一抗β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-Myc、細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclin D1)、GAPDH及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 BM-MSCs的分離、培養(yǎng)[5]：采用頸椎脫位法處死大鼠，分離股骨并暴露骨髓腔，用DMEM低糖培養(yǎng)基反復(fù)吹打骨髓腔，將含有骨髓的培養(yǎng)基加入到離心管中，1 000 r/min心10 min，棄上清，將獲得細(xì)胞在37 ℃、含有5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)BM-MSCs表面抗原：取匯合度90%的P3代BM-MSCs，經(jīng)消化、PBS洗滌后，1 000 r/min離心10min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/mL，分為8個(gè)試管，每管加入50 μL細(xì)胞懸液，并分別加入5 μL CD29 FITC-A、CD44 FITC-A、CD90 PE-A、CD45 PE-C及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，4 ℃下避光孵育20 min，在常溫下以1 000 r/min離心10 min，棄上清，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞的分組及處理：取增殖狀態(tài)良好的P3代BM-MSCs，利用200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)1 h以構(gòu)建BM-MSCs成脂分化模型[6]，命名為模型組。另取正常培養(yǎng)的BM-MSCs為對(duì)照組。 H2O2誘導(dǎo)1 h后將模型組BM-MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并分為mimic NC組(50 nmol/L)、miR-210 mimic組(50 nmol/L)、inhibitor NC組(100 nmol/L)、miR-210 inhibitor組(100 nmol/L)，轉(zhuǎn)染24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-210表達(dá)：用Trizol試劑提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)miR-210表達(dá)。以U6為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計(jì)算miR-210水平。引物序列為：miR-210正向：5′-CATAGATAGCCACTG CCCACA-3′；反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向：5′-AACGCT TTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.5 油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的脂肪顆粒：將細(xì)胞(1.0×105個(gè)/孔)接種到24孔板中，孵育24 h后，將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用PBS洗滌兩次后，在每孔中加入500 μL油紅O染色工作液染色30 min，60%異丙醇洗3次，蒸餾水洗3次，蘇木精染色15 s，水洗3次，封片。觀察胞質(zhì)內(nèi)的脂肪顆粒。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，將總蛋白經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜與一抗PPARγ(1∶2 000)、C/EBPα(1∶1 000)、β-catenin(1∶2 000)、c-Myc(1∶1 000)、cyclin D1(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與二抗(1∶4 000)孵育1 h后，加入ECL試劑觀察蛋白顯影，通過軟件(Image J)分析蛋白質(zhì)條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs形態(tài)學(xué)觀察及表面抗原鑒定

P0代細(xì)胞中混有雜細(xì)胞，經(jīng)多次換液傳代可去除，細(xì)胞貼壁較快，大部分呈長(zhǎng)梭形。P3代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)及排列趨于一致，呈旋渦狀增殖(圖1)。P3代細(xì)胞高表達(dá)CD29(99.27%)、CD44(98.36%)和CD90(99.87%)， 低表達(dá)CD45(5.26%)(圖2)。

2.2 BM-MSCs轉(zhuǎn)染效率及各組BM-MSCs 中miR-210表達(dá)比較

鏡下均可見較強(qiáng)綠色熒光(圖3)。與對(duì)照組比較，模型組BM-MSCs中miR-210水平降低(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中miR-210表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor 組BM-MSCs中miR-210表達(dá)降低(P<0.05)(圖4)。

圖1 倒置顯微鏡觀察BM-MSCs形態(tài)Fig 1 Inverted microscope to observe the morphology of BM-MSCs

2.3 miR-210對(duì)H2O2誘導(dǎo)BM-MSCs成脂分化的影響

與對(duì)照組比較，模型組BM-MSCs中脂肪顆粒數(shù)目升高(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中脂肪顆粒數(shù)目降低(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor 組BM-MSCs中脂肪顆粒數(shù)目升高(P<0.05)(圖5)。

2.4 H2O2誘導(dǎo)BM-MSCs中脂肪細(xì)胞標(biāo)志物PPARγ、C/EBPα 蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor組BM-MSCs中PPAR γ、C/EBPα蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖6)。

Green represents marker expression, red represents isotype control IgG expression圖2 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)BM-MSCs表面抗原Fig 2 Detection of BM-MSCs surface antigen by flow cytometry

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig 3 Results of cell transfection

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group圖4 miR-210在各組細(xì)胞中的表達(dá)Fig 4 Expression of miR-210 in each group of cells

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

2.5 H2O2誘導(dǎo)BM-MSCs中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor 組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖7)。

3 討論

多項(xiàng)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CD29、CD44、CD90呈陽性，而對(duì)CD45呈陰性，抗原CD29、CD44、CD45、CD90的表達(dá)是評(píng)估BM-MSCs純度的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[7]。本研究發(fā)現(xiàn)P3代BM-MSCs高表達(dá)CD29、CD44和CD90，低表達(dá)CD45，符合BM-MSCs的特征。氧化應(yīng)激使細(xì)胞產(chǎn)生大量的自由基，過量自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老，本研究通過H2O2誘導(dǎo)引發(fā)細(xì)胞功能異常，促進(jìn)細(xì)胞脂滴形成，以構(gòu)建BM-MSCs成脂分化模型，結(jié)果顯示模型組BM-MSCs中脂肪顆粒數(shù)目升高，提示BM-MSCs成脂分化模型構(gòu)建成功。PPARγ和C/EBPα是細(xì)胞成脂分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其可通過協(xié)同作用來調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，且PPARγ和C/EBPα表達(dá)減弱可緩解H2O2誘導(dǎo)引發(fā)的損傷，抑制內(nèi)脂滴的形成[8]；本研究顯示，模型組BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα蛋白表達(dá)升高，再次證明BM-MSCs成脂分化模型構(gòu)建成功。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

miRNA可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化、增殖和凋亡等。據(jù)報(bào)道，過表達(dá)miR-330-5p可抑制H2O2誘導(dǎo)的BM-MSCs成脂分化[9]；miR-210的過表達(dá)促進(jìn)兔BM-MSCs 成骨分化并抑制成脂分化[10]。本研究結(jié)果與其一致：miR-210在模型組BM-MSCs中低表達(dá)，表明H2O2可引起miR-210水平降低，低水平miR-210可能與H2O2造成活性氧增多、過氧化反應(yīng)增強(qiáng)進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成的損傷有關(guān)；過表達(dá)miR-210后模型組BM-MSCs中脂肪顆粒數(shù)目降低，而抑制miR-210表達(dá)后則呈相反趨勢(shì)，提示過表達(dá)miR-210可抑制H2O2誘導(dǎo)后BM-MSCs的成脂分化。

Wnt/β-catenin是一種在進(jìn)化上保守的信號(hào)通路，其在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，灌服骨碎補(bǔ)水煎液可以抑制去卵巢大鼠BM-MSCs成脂分化，其機(jī)制與激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)[11]；卡馬西平通過抑制Wnt/β-catenin通路增強(qiáng)脂肪生成[12]。本研究顯示，上調(diào)miR-210表達(dá)后模型組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)升高，而抑制miR-210表達(dá)后模型組BM-MSCs中相應(yīng)蛋白表達(dá)降低，提示過表達(dá)miR-210可抑制H2O2誘導(dǎo)的BM-MSCs成脂分化，該機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin 通路有關(guān)。