梁宗英，楊 陽，鄭競雄，趙寶山，侯繼申，孫光蕊△

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，河北承德 067000；2.河北省胸科醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050000)

我國食管癌發(fā)病率和病死率均占世界范圍內(nèi)的50%以上，極大地危害了居民健康[1]。雖然手術(shù)切除、化療及放療等在一定程度上改善了食管癌患者的預(yù)后，但其總體生存率和生活質(zhì)量仍較差[2]。賴氨酸乙?；潜碛^遺傳學(xué)中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯后主要修飾方式之一，乙?；揎椇推渌揎椫g的交叉調(diào)節(jié)對轉(zhuǎn)錄控制和表觀遺傳程序至關(guān)重要。除組蛋白外，許多核蛋白和腫瘤相關(guān)蛋白也可以發(fā)生賴氨酸乙酰化修飾，并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性作用[3]。研究表明，賴氨酸乙?；揎椥枰阴；D(zhuǎn)移酶參與完成，KAT5作為一種經(jīng)典乙?；D(zhuǎn)移酶通過調(diào)控組蛋白和非組蛋白的乙?；揎梾⑴c多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[4]，但其在食管癌中相關(guān)蛋白乙?；揎椫械淖饔蒙袩o研究報(bào)道。Survivin是細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制家族中抗凋亡能力最強(qiáng)的蛋白之一，在多種腫瘤中呈高表達(dá)，參與了腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移[5]。前期研究顯示，Survivin在食管癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中呈高表達(dá)并發(fā)生了乙?；?，且其高乙?；脚c食管癌分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。然而，Survivin乙?；龠M(jìn)食管癌發(fā)生及發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。本研究觀察乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑NU9056對食管癌細(xì)胞乙?；D(zhuǎn)移酶KAT5、Survivin乙?；郊凹?xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響，探討KAT5與Survivin乙?；揎椏赡艽嬖诘膬?nèi)在聯(lián)系及在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌EC109細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)；F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、Matrigel基質(zhì)膠(廣州銳博生物科技有限公司)；SDS-PAGE蛋白凝膠電泳試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液、MTT(北京碧云天生物科技有限公司)；KAT5、Survivin、乙?；嚢彼酇cetylatedLysine、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、癌基因-Myc(c-Myc)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL2)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(英國 Abcam公司或美國CST公司)；A/G瓊脂糖珠(上海一基實(shí)業(yè)有限公司)；DMSO和NU9056(上海斯百全化學(xué)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組

取凍存的人食管癌EC109細(xì)胞，37 ℃水浴速溶，微量移液槍轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)并加5 mL含10% F12培養(yǎng)基輕輕吸打混勻，常溫離心；棄上清液，加7～10 mL F12培養(yǎng)基吸打混勻后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶；37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，24 h后換液并觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部約95%進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。NU9056處理食管癌EC109細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組(NU9056組)，DMSO處理食管癌EC109細(xì)胞為對照組(DMSO組)。用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期EC109細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞/100 μL的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加藥處理，NU9056按照濃度梯度0、0.1、0.5、1.0、5.0 μmol/L處理，每組3個(gè)平行孔。細(xì)胞處理24 h后進(jìn)行MTT檢測。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，加入100 μL DMSO 10 min后，酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(A)值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。計(jì)算藥物對細(xì)胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以NU9056 IC50值為細(xì)胞給藥濃度。

1.2.2RT-qPCR

RNA提取試劑盒提取總RNA，取300 ng RNA，應(yīng)用PrimeScriptTMRT Reagent kit，按說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用SYBR Green qPCR Master熒光定量試劑盒檢測mRNA表達(dá)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(30個(gè)循環(huán))。溶解曲線參照儀器自動(dòng)程序。使用U6和GAPDH作為內(nèi)參，相對表達(dá)量以2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.3Western blot

提取細(xì)胞總蛋白，測定濃度；制備電泳蛋白上樣液，行凝膠電泳。電泳后，轉(zhuǎn)膜。加一抗4 ℃過夜。次日孵育二抗，重復(fù)洗膜后顯影。采用Image proplus軟件分析蛋白條帶的積分光密度(IOD值)。

1.2.4免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總蛋白，測定濃度。加入目的蛋白純抗體5 μL和A/G瓊脂糖珠5 mL,混勻后2×裂解緩沖液補(bǔ)充至總體積450 μL，12 000 r/min離心3 min后，取上清液400 μL置入離心管，4 ℃ 15 r/min,共沉淀12 h。4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清液。1×裂解緩沖液500 μL洗滌A/G瓊脂糖珠。12 000 r/min離心3 min,棄上清液。重復(fù)洗滌3次。最后一次洗滌完畢后，棄去上清液。1×裂解緩沖液35 μL和等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸后離心；行Western blot。

1.2.5MTT

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后離心收集細(xì)胞沉淀。以F12培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL。常規(guī)培養(yǎng)至每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。12、24、48、72 h后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出一塊板，每孔加入5 mg/mL MTT液30 μL，繼續(xù)常規(guī)孵育4 h。離心，棄上清液。每孔加入DMSO 150 μL，水平搖床80 r/min 5～10 min。酶標(biāo)儀檢測每孔的570 nm處A值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液；以每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔100 μL。常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿孔底，用10 μL無菌移液槍頭垂直板面劃痕，用無血清的培養(yǎng)基將掉下來的細(xì)胞洗去。每孔加入2 mL無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡測量劃痕的寬度。

1.2.7Transwell小室實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染后鋪滿孔底細(xì)胞，用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，收集后計(jì)數(shù)細(xì)胞。將Transwell小室按順序放入24孔板，無菌鑷子取出小室，室外加入含15%血清F12培養(yǎng)基600 μL。小室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)2×104個(gè))，培養(yǎng)液為不含血清的F12培養(yǎng)基，每組細(xì)胞重復(fù)6個(gè)標(biāo)本。24孔板放入CO2孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室，PBS緩沖液淋洗3次，用棉簽擦去微孔膜內(nèi)層細(xì)胞。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。PBS緩沖液涮洗3次，每次更換液體；棉簽擦干液體，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)；每個(gè)小室隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞活力的影響

NU9056可濃度依賴性抑制食管癌EC109細(xì)胞增殖活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)計(jì)算IC50=0.946 μmol/ L，本研究選取0.9 μmol/L為 NU9056的終濃度，見圖 1。

圖1 不同濃度NU9056對食管癌EC109細(xì)胞抑制作用

2.2 NU9056對KAT5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

NU9056組KAT5 mRNA表達(dá)(0.12±0.02)明顯低于DMSO 組(1.42±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NU9056組KAT5蛋白表達(dá)(9.27±0.08)明顯低于DMSO 組(75.67±1.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞KAT5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3 NU9056對Survivin乙?；降挠绊?/h3>

NU9056組中Survivin乙?；蕿?24.74±1.36)%低于DMSO組(76.15±2.04)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 NU9056對腫瘤增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

NU9056組中VEGF、BCL2、c-Myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平分別為7.34±0.24、8.75±0.14、10.24±0.17和21.75±0.85，而DMSO組各蛋白的表達(dá)水平分別為67.84±1.12、60.72±1.34、70.38±2.04和72.34±1.71，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 NU9056對食管癌增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞增殖能力的影響

鋪板培養(yǎng)48 h后NU9056組和DMSO組的A值分別為0.48±0.04和0.65±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鋪板72 h后NU9056組和DMSO組的A值分別為0.56±0.03和0.78±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞存活能力的影響

2.6 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞侵襲能力的影響

NU9056組穿膜細(xì)胞數(shù)(76.32±1.58)個(gè)低于DMSO組(127.32±2.46)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)

2.7 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞遷移能力的影響

鋪板培養(yǎng)48 h后NU9056組細(xì)胞劃痕間距(356.42±2.56)μm低于DMSO組(64.54±1.38)μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 NU9056對食管癌EC109細(xì)胞遷移能力的影響(×400)

3 討 論

食管癌是臨床上常見的上消化道惡性腫瘤。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，近年來我國食管癌發(fā)病率雖有所下降，但總體病死率仍居高不下，嚴(yán)重威脅居民健康[7]。侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者高病死率的主要原因，其中癌基因活化與抑癌基因失活是導(dǎo)致臨床治療失敗的關(guān)鍵因素[8]。因此，有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移對降低食管癌復(fù)發(fā)率并提升遠(yuǎn)期生存率至關(guān)重要。

乙?；揎検潜碛^遺傳學(xué)中較常見的一種組蛋白修飾方式，參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。既往研究多關(guān)注于組蛋白的乙酰化修飾在腫瘤中的作用機(jī)制，而近年研究發(fā)現(xiàn)多種非組蛋白也可以發(fā)生乙酰化修飾，且與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9]。Survivin基因是一種存在于多種惡性腫瘤及胚胎組織中的獨(dú)特分子標(biāo)記物[10]。大多數(shù)惡性腫瘤中Survivin呈過表達(dá)狀態(tài)，可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分化和腫瘤血管生成[11]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Survivin可以抑制癌細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致腫瘤異常增殖，且與腫瘤的不良預(yù)后、侵襲轉(zhuǎn)移行為、耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)[12-13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中Survivin發(fā)生了乙酰化，且乙?；脚c食管癌的分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性[6]。然而，Survivin乙?；c食管癌的發(fā)生和發(fā)展具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了食管癌EC109細(xì)胞內(nèi)Survivin呈高乙?；癄顟B(tài)，說明Survivin作為一種非組蛋白同樣可以發(fā)生乙?；揎棧移湟阴；揎椏赡軈⑴c了食管癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

蛋白的乙?；揎椥枰谝阴；D(zhuǎn)移酶的參與下完成，故乙?；D(zhuǎn)移酶在乙酰化修飾過程中起到了至關(guān)重要的作用。食管組織中Survivin發(fā)生乙酰化同樣需要乙?；D(zhuǎn)移酶的參與，但催化其發(fā)生乙?；囊阴；D(zhuǎn)移酶尚未明確。乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT5屬于MYST家族中的代表性成員，可以催化多種組蛋白和非組蛋白發(fā)生乙?；?，同時(shí)自身也參與并調(diào)控DNA 損傷應(yīng)答、細(xì)胞周期、自噬、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中KAT5呈高表達(dá)，與腫瘤分期、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且其陽性表達(dá)與Survivin乙?；收嚓P(guān)[15]。這提示KAT5可能通過自身功能或者靶向調(diào)控其他基因的途徑，促進(jìn)了食管癌發(fā)生和發(fā)展。KAT5可以通過催化多種組蛋白及非組蛋白發(fā)生乙?；揎梾⑴c癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14]。研究證實(shí)，抑制乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞內(nèi)乙?；鞍椎囊阴；癄顟B(tài)發(fā)生改變[16]。理論上，通過抑制乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)會改變食管癌組織中Survivin乙?；揎棤顟B(tài)，進(jìn)而改變食管癌的生物學(xué)行為。在沉默或下調(diào)乙?；D(zhuǎn)移酶促進(jìn)相關(guān)蛋白發(fā)生去乙酰化作用機(jī)制中，沉默KAT5有可能發(fā)揮更高的去乙酰化的作用。但在食管癌中，KAT5作為乙?；D(zhuǎn)移酶是否參與Survivin乙?；揎椀年P(guān)系尚不明確。

本研究以食管癌EC109細(xì)胞為研究對象，通過應(yīng)用乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑NU9056對食管癌細(xì)胞進(jìn)行處置，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測證實(shí)，NU9056可濃度依賴性抑制食管癌EC109細(xì)胞增殖活力。乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑在體內(nèi)可以抑制多種乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，但其往往具有針對性的主要抑制一種乙?；D(zhuǎn)移酶的活性和表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，NU9056可以明顯抑制KAT5 mRNA和蛋白表達(dá)。說明乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑NU9056可以有針對性地抑制KAT5的活性和表達(dá)，是乙?；D(zhuǎn)移酶KAT5的特異性抑制劑。進(jìn)一步通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Survivin乙?；剑Y(jié)果顯示KAT5表達(dá)下調(diào)后，食管癌細(xì)胞內(nèi)Survivin乙酰化率明顯降低，提示KAT5作為乙酰基轉(zhuǎn)移酶催化了非組蛋白Survivin的乙?；揎棧赡苁钦{(diào)控Survivin發(fā)生乙?；M(jìn)而改變食管癌生物學(xué)功能的一個(gè)重要上游分子。

腫瘤的異常增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的重要手段。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖受到了明顯的抑制，細(xì)胞的愈合遷移距離縮短，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。提示NU9056抑制乙?；D(zhuǎn)移酶KAT5的表達(dá)使Survivin發(fā)生去乙酰化后，抑制了EC109細(xì)胞的增殖活力，延緩了細(xì)胞愈合遷移能力，且侵襲能力受到了明顯抑制。腫瘤的異常增殖是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，腫瘤增殖過程中起到關(guān)鍵作用的基因分子主要包括腫瘤增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF，也是預(yù)測腫瘤異常增殖的重要標(biāo)志。研究表明，腫瘤細(xì)胞在異常增殖過程中Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF均呈表達(dá)上調(diào)狀態(tài)。本研究通過Western blot檢測4種蛋白表達(dá)證實(shí)，NU9056干預(yù)后的食管癌細(xì)胞中Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF蛋白表達(dá)均明顯降低。筆者推測，NU9056干預(yù)食管癌EC109細(xì)胞后抑制了乙?；D(zhuǎn)移酶KAT5的活性，使其催化的Survivin蛋白發(fā)生去乙?；M(jìn)而改變了Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF的表達(dá)。提示抑制KAT5表達(dá)可以降低Survivin乙?；?，抑制了細(xì)胞增殖通路，進(jìn)而抑制了食管癌EC109細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑NU9056可通過下調(diào)乙?；D(zhuǎn)移酶KAT5靶向調(diào)控Survivin乙酰化修飾，進(jìn)一步通過調(diào)控腫瘤增殖過程中起到關(guān)鍵作用的基因，進(jìn)而抑制食管癌EC109細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，為食管癌的臨床治療提供了新的思路和作用靶點(diǎn)。