王一名,衛(wèi)曉紅,王忠一,于曉靜,吳帥
(煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東煙臺(tái) 264000)
類黃酮化合物是自然界存在的酚類化合物中最大的一個(gè)亞類,在植物中廣泛存在。其基本骨架具有C6=C3=C6結(jié)構(gòu),即由2個(gè)芳香環(huán)A和B,通過(guò)中央三碳鏈相互連結(jié)而成。已經(jīng)有4000多種類黃酮化合物被分離鑒定,由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同,這些化合物呈現(xiàn)出不同的特性。葡萄酒中的類黃酮根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮和黃烷-3-醇等,主要包括槲皮素、楊梅素、兒茶素等組分。類黃酮物質(zhì)是葡萄酒中主要的苦味及澀味物質(zhì)[1-3],構(gòu)成了葡萄酒的基本骨架,有助于增強(qiáng)酒的結(jié)構(gòu)感。在葡萄酒成熟過(guò)程中,這些苦味、澀味和酸味物質(zhì)發(fā)生變化,形成復(fù)雜的聚合物,提高味感質(zhì)量。此外,類黃酮具有抗氧化的功效,通過(guò)自身氧化可降低葡萄酒變質(zhì)的速度,有利于葡萄酒成熟過(guò)程中醇香的產(chǎn)生。在植物體內(nèi)的多酚物質(zhì)中,多數(shù)類黃酮化合物具有生理或藥理活性,對(duì)人體健康有重要作用[4],除了可作為抗氧化劑和自由基清除劑[5]外,還能抗炎、抑菌、抗病毒、預(yù)防高血壓以及抑制血栓形成等[6-7]。越來(lái)越多的研究表明,類黃酮化合物具有很高的醫(yī)用價(jià)值,如山奈酚和槲皮素具有抗癌、心臟保護(hù)和抗炎作用[8];槲皮素對(duì)心血管疾病高危人群的健康有積極影響;柚皮素具有神經(jīng)保護(hù)和抗氧化特性[9]。因此,研究建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏并能夠同時(shí)測(cè)定葡萄酒中多項(xiàng)類黃酮組分的分析方法顯得尤為重要。
目前,檢測(cè)類黃酮的方法主要有分光光度法[10]、高效液相色譜法[11]、薄層色譜法[12]、毛細(xì)管電泳法[13]、核磁共振法[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]和紅外光譜法[17]等。近年來(lái),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以準(zhǔn)確度高、靈敏度好、分析速度快等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于類黃酮檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域,包括植物[18-19]、中成藥[20]和食品[21]等,如毛慧慧等[22]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分離鑒定了銀線蓮中兩種黃酮類化合物,白海玉等[23]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)野菊花中的黃酮成分進(jìn)行了分析,均取得良好的效果。但是,采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLCMS/MS),對(duì)葡萄酒進(jìn)行多指標(biāo)類黃酮化合物的定量分析卻少見(jiàn)報(bào)道。迄今為止,對(duì)葡萄酒中酚類物質(zhì)的研究報(bào)道仍以生物活性、感官特性等為主。本研究建立了一種測(cè)定葡萄酒中17種類黃酮物質(zhì)含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,對(duì)葡萄酒中類黃酮化合物的含量進(jìn)行了定量分析,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,可以作為葡萄酒中類黃酮物質(zhì)定量檢測(cè)的技術(shù)依據(jù),為葡萄酒中這類化合物的綜合分析提供參考。
TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司);賽多利斯CPA225D型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);Milli-Q型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。
標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):花旗松素(Taxifolin)、楊梅素(Myricetin)、楊梅苷(Myricitrin)、表兒茶素(Epicatechin)、兒茶素(Catechin)、表沒(méi)食子兒茶素(Epigallocatechin),購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、蘆?。≧utin)、刺槐苷(Robinin),購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司;柚皮素(Naringenin)、沒(méi)食子兒茶素(Gallocatechin),購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;金絲桃苷(Quercetin-3-galactoside)、異槲皮苷(Quercetin-3-O-glucodise),購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司;表兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epicatechin gallate)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate),購(gòu)自壇墨質(zhì)檢;水仙苷(Isorhamnetin-3-O-glucoside),購(gòu)自Panphy-chemicals。葡萄酒購(gòu)買于超市。
甲酸、甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Merck公司);實(shí)驗(yàn)用純水由Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)制備。
1.2.1 UPLC條件
色譜柱為HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相A為有機(jī)相(0.1%甲酸-乙腈溶液),B為水相(0.1%甲酸-水溶液);柱溫35 ℃;流速300 μL·min-1;進(jìn)樣量2 μL。洗脫程序見(jiàn)表1。
表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phases
1.2.2 MS條件
電噴霧離子源(ESI),同時(shí)采用ESI+(毛細(xì)管電壓3.5 kV)和ESI-(毛細(xì)管電壓2.9 kV)模式切換掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);離子源溫度為150 ℃,去溶劑氣溫度為500 ℃,去溶劑氣流量為1000 L·h-1,錐孔氣流量為150 L·h-1,碰撞氣流量為0.15 mL·min-1。類黃酮化合物的定性/定量離子對(duì)、碰撞能量(CE)及錐孔電壓(CV)見(jiàn)表2。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和模擬酒基的配制
將標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶液配制成1000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于﹣20 ℃保存?zhèn)溆谩J褂脮r(shí),將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇溶液逐級(jí)稀釋成所需標(biāo)準(zhǔn)工作液,且現(xiàn)用現(xiàn)配。
取120 mL食用酒精和5 g食品級(jí)酒石酸,移到1 L容量瓶中,用去離子水定容,即得到模擬酒基。
1.3.2 樣品處理
葡萄酒在分析前室溫避光保存。開(kāi)瓶后,馬上轉(zhuǎn)移到棕色瓶中,以避免氧化,置于﹣4 ℃避光保存。上機(jī)前取2 mL樣品過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾,也可以根據(jù)實(shí)際測(cè)定結(jié)果取樣1 mL稀釋至適當(dāng)濃度,過(guò)濾膜后上機(jī)分析。
為獲得各待測(cè)化合物的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù),本研究利用注射泵直接進(jìn)樣,將1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液以0.01 mL·min-1流速注入離子源,分別測(cè)定了每一種化合物在ESI+和ESI-模式下的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度。由于類黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中既具有-OH基團(tuán),又具有堿性O(shè)原子[24],因此在正、負(fù)離子模式下均具有相應(yīng)的質(zhì)譜信號(hào)。通過(guò)對(duì)比后發(fā)現(xiàn),槲皮素、山奈酚、楊梅苷、蘆丁等在正離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度較強(qiáng),因此選擇ESI+電離模式;而柚皮素、楊梅素、兒茶素、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯等化合物在負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度較強(qiáng),因此選擇ESI-電離模式。在各化合物最優(yōu)的離子化模式下,分別對(duì)母離子進(jìn)行碰撞解離,二級(jí)掃描得到裂解碎片離子。通過(guò)對(duì)CE的優(yōu)化選取響應(yīng)值高、干擾小的碎片離子用于定性和定量分析。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
表2 類黃酮化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of flavonoid compounds
2.2.1 色譜柱
試驗(yàn)考察了待測(cè)物在HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)色譜柱和C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)色譜柱的保留情況,主要有峰形和響應(yīng)值兩個(gè)方面的差異。從峰形來(lái)看,除表兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷外,其它化合物在兩只色譜柱上相差不大。在T3色譜柱上,表兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷的分離效果明顯優(yōu)于C18,分別見(jiàn)圖1和圖2。從響應(yīng)值來(lái)看,所有待測(cè)物在T3色譜柱上的響應(yīng)信號(hào)均高于C18。其中,刺槐苷、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在T3上的響應(yīng)值比C18高約51%~100%;其余化合物在T3上的響應(yīng)值高約14%~47%。綜合考慮色譜峰的分離效果和響應(yīng)信號(hào),選擇T3作為分析用色譜柱。
圖1 表兒茶素在不同色譜柱中的峰形對(duì)比Figure 1 Peak comparison of epicatechin in different chromatographic columns
圖2 金絲桃苷和異槲皮苷在不同色譜柱中的峰形對(duì)比Figure 2 Peak comparison of quercetin-3-galactoside and quercetin-3-O-glucodise in different chromatographic columns
2.2.2 流動(dòng)相
考察了17項(xiàng)類黃酮化合物在不同流動(dòng)相條件下的分離情況,結(jié)果表明在僅含有乙腈和水的液相條件下,花旗松素、楊梅素、山奈酚、表兒茶素沒(méi)食子酸酯等化合物分離效果不佳,且峰形拖尾嚴(yán)重。在流動(dòng)相中添加甲酸后這些化合物的分離效果改善,色譜圖更窄、更對(duì)稱且多數(shù)化合物的響應(yīng)更強(qiáng)。待測(cè)物在3種流動(dòng)相Ⅰ(0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液,Vol,下同)、Ⅱ(乙腈-0.1%甲酸水溶液)和Ⅲ(乙腈-水)中的響應(yīng)值對(duì)比如圖3所示:以待測(cè)物在流動(dòng)相Ⅰ中的響應(yīng)強(qiáng)度為參照,柚皮素、刺槐苷、表兒茶素、兒茶素、水仙苷等5種化合物在流動(dòng)相Ⅲ中的響應(yīng)值高約29%~39%,但花旗松素、楊梅素、楊梅苷、沒(méi)食子兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在流動(dòng)相Ⅲ中的響應(yīng)值不足50%;待測(cè)物在流動(dòng)相Ⅰ和Ⅱ中的響應(yīng)差值在30%以內(nèi),17種化合物中僅楊梅苷、山奈酚、柚皮素在流動(dòng)相Ⅱ中的響應(yīng)值高于Ⅰ,其余14種化合物在流動(dòng)相Ⅱ中的響應(yīng)值低于Ⅰ。因此,最終選用含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相。
圖3 不同流動(dòng)相中的響應(yīng)值對(duì)比Figure 3 Comparison of response value in different mobile phases
葡萄酒樣品不經(jīng)處理直接進(jìn)樣時(shí),樣品中的雜質(zhì)會(huì)對(duì)色譜柱和儀器造成污染。因此,選擇將酒樣稀釋適當(dāng)倍數(shù)后過(guò)0.22 μm微孔濾膜處理較好。濾膜在去除雜質(zhì)的同時(shí),也會(huì)吸附部分待測(cè)物。不同材質(zhì)的濾膜吸附能力不同。本文選用聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)和尼龍(Nylon)三種型號(hào)的濾膜進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。在模擬酒基中添加固定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)濾膜過(guò)濾后,計(jì)算目標(biāo)物的回收率,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,山奈酚在PTFE上的回收率最低,為70.9%,其余待測(cè)物在PTFE上的回收率均大于80%。除刺槐苷、沒(méi)食子兒茶素和水仙苷外,其它待測(cè)物在PTFE上的回收率均高于PVDF。Nylon對(duì)待測(cè)物的吸附效果最強(qiáng),通過(guò)率最低。因此,本試驗(yàn)選擇過(guò)0.22 μm PTFE濾膜作為樣品的前處理方式。
圖4 濾膜類型對(duì)回收率的影響Figure 4 Effect of membrane type on recovery rate
2.4.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限
將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制成系列濃度工作溶液后按1.2實(shí)驗(yàn)條件上機(jī)檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),儀器響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得出線性方程和相關(guān)系數(shù),以3倍信噪比為檢出限(LOD),10倍信噪比為定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,待測(cè)物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.99,LOD和LOQ分別為0.1~5 μg·L-1和0.3~12 μg·L-1。
表3 線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients, the limits of detection and quantification
2.4.2 精密度與重復(fù)性
取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液于同日不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣7次以及連續(xù)7 d重復(fù)測(cè)定3次,按照本方法測(cè)定類黃酮化合物的峰面積,計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,分析待測(cè)物的日內(nèi)精密度及日間精密度,結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出,各待測(cè)物峰面積的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別在0.92%~3.94%和1.75%~5.66%,表明該儀器具有良好的精密度。在1.3.1模擬酒基溶液中定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備7份供試品,按1.3.2處理后進(jìn)樣分析,計(jì)算各待測(cè)物的重復(fù)性RSD為1.42%~5.05%(表4),表明該方法的重復(fù)性良好。
表4 精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision and repeatability
2.4.3 加標(biāo)回收率
對(duì)實(shí)際樣品的分析表明,不同樣品中各組分濃度差異較大,因此在進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)時(shí),依據(jù)各組分在實(shí)際樣品中的含量高低,在1.3.1模擬酒基溶液中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別制成不同質(zhì)量濃度水平的供試品溶液,每個(gè)水平做7個(gè)平行,按照1.3.2處理后進(jìn)樣分析,計(jì)算各待測(cè)物的加標(biāo)回收率和RSD,結(jié)果見(jiàn)表5。表5顯示,加標(biāo)回收率在69.2%~99.8%之間,RSD在0.90%~4.58%之間,表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
表5 方法的回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Recovery test results of the method
從市場(chǎng)購(gòu)買10個(gè)葡萄酒樣品,包括6個(gè)‘赤霞珠’干紅葡萄酒和4個(gè)‘霞多麗’干白葡萄酒。使用新建立的方法對(duì)樣品中的類黃酮物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知,葡萄酒中檢出的化合物有花旗松素、槲皮素、楊梅素、楊梅苷和表兒茶素等13種組分。僅在干紅葡萄酒中檢出的化合物有槲皮素、楊梅素和山奈酚。所有樣品中均未檢出蘆丁、刺槐苷、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和水仙苷。由此可知,該方法適用于葡萄酒中類黃酮化合物的定性和定量分析。
表6 葡萄酒中類黃酮化合物的測(cè)定Table 6 Determination of flavonoid compounds in wine μg·L-1
本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了葡萄酒中17項(xiàng)類黃酮化合物含量的測(cè)定方法,并對(duì)建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明,該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏度好,可以滿足葡萄酒中類黃酮物質(zhì)的準(zhǔn)確定性和定量分析。實(shí)際樣品的分析結(jié)果表明,該方法適用于葡萄酒中類黃酮化合物的檢測(cè)。該方法的建立為進(jìn)一步加強(qiáng)葡萄酒質(zhì)量及品質(zhì)控制提供了科學(xué)的方法參考。