張淑華 張勇

（確山縣人民醫(yī)院病理科，河南 確山 463200）

約95%的結(jié)直腸癌是由結(jié)腸和直腸內(nèi)壁的腺細(xì)胞發(fā)展而來(lái)，癌癥通常開(kāi)始于內(nèi)壁最內(nèi)層，并緩慢生長(zhǎng)到外層。結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）早期癥狀包括排便習(xí)慣改變（如便秘或者腹瀉）、大便細(xì)窄、糞便中含有鮮紅或韓紅色血液、骨盆或下腹持續(xù)疼痛（如脹氣、腫脹或疼痛）、不明原因的體重減輕、惡心或偶遇及精神不振等表現(xiàn)，隨著疾病發(fā)展，其腫瘤增大導(dǎo)致腸腔狹窄，從而造成機(jī)械性腸梗阻，還可能發(fā)生腸穿孔和出血等并發(fā)癥，對(duì)患者生命造成嚴(yán)重的威脅。

近年來(lái)，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。通過(guò)mRNA差異展示、雜合性丟失等研究方法，發(fā)現(xiàn)了100多種抑癌基因，通過(guò)對(duì)這些抑癌基因的研究，可以闡述腫瘤形成機(jī)制，為未來(lái)抗腫瘤治療新方法提供理論依據(jù)[1]。人宮頸癌癌基因（Human Cervical Cancer Oncogene，HCCR）定位于人染色體12q，包括HCCR-1與HCCR-2。國(guó)內(nèi)有研究報(bào)道，HCCR在肝癌內(nèi)中過(guò)表達(dá)，逐漸成為肝癌診斷線索[2]。B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell Lymphoma-2，Bcl-2）可抑制多種原因引起的細(xì)胞凋亡，其過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞抵抗正常凋亡。

因此，為了進(jìn)一步探究其在CRC組織中的作用機(jī)制，本文對(duì)其CRC組織和癌旁正常組織中的HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，揭露HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，評(píng)價(jià)其表達(dá)在診斷、治療CRC中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年3月至2022年3月本院收治的CRC患者的臨床資料。其中女60例，男53例，年齡35-78歲，平均年齡55.76±3.88歲。以距癌組織邊緣5 cm以上無(wú)癌浸潤(rùn)的癌旁正常組織作為正常對(duì)照。

納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；均經(jīng)病理學(xué)確診；符合《NCCN結(jié)直腸癌診治指南（2017）》中CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重造血系統(tǒng)疾病和傳染病者；合并心、肺、肝、腎等其他臟器并發(fā)癥者；合并惡性腫瘤和全身感染者；存在認(rèn)知功能障礙和心理問(wèn)題者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意，且患者及家屬知情簽署《知情同意書(shū)》。

1.2 方法

1.2.1 HCCR-1、Bcl-2表達(dá)的檢測(cè)方法

均采用免疫組化法對(duì)HCCR-1、Bcl-2表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。選取手術(shù)后癌旁正常組織和CRC組織的石蠟塊（本院病理科提供）。4μm連續(xù)切片，60℃烤片1 h，切片脫蠟和水化，加0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液（pH6.4）于高壓鍋中，加熱至噴氣，持續(xù)2 min。冷卻后，蒸餾水沖洗，PBS溶液浸洗3次，每次5 min，用新鮮配置的3%雙氧水處理15 min，PBS浸洗3次，每次5 min，室溫封閉0.5 h。吸干液體，滴加鼠抗人HCCR-1、Bcl-2多克隆抗體，覆蓋標(biāo)本，將切片放入濕盒中孵育，PBS浸洗3次，每次5 min，滴加Envision試劑，覆蓋標(biāo)本，37℃保溫箱內(nèi)孵育1 h，PBS浸洗3次，每次5 min。室溫下顯色，復(fù)染，充分水洗，脫水透明，重型快干膠封片，在高倍顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照采用試劑公司提供的陽(yáng)性切片（試劑盒均購(gòu)自上海通蔚試劑有限公司，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。

1.2.2 HCCR-1、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)的判定

陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜上可見(jiàn)棕黃或棕褐色顆粒。100×光鏡下取腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)，400×光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性=0，弱陽(yáng)性=1，中等陽(yáng)性=2，強(qiáng)陽(yáng)性=3。染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為：≤10%（陰性=0），11%-30%（弱陽(yáng)性=1），31%-50%（中等陽(yáng)性=2），＞50% （強(qiáng)陽(yáng)性=3）。當(dāng)兩者分?jǐn)?shù)之和≥3時(shí)判定HCCR-1、Bcl-2為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）對(duì)比CRC組織和癌旁正常組織間HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平；（2）對(duì)比不同臨床特征CRC組織的HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況；（3）分析CRC組織中HCCR-1、Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，n（%）表示，χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearnan相關(guān)性分析；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織與癌旁正常組織間HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平對(duì)比

HCCR-1在癌旁正常組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，在113例CRC組織中有83例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為73.45%。

Bcl-2在113例CRC組織中有62例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為54.87%；且CRC組織HCCR-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性率均顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 Bcl-2、HCCR-1免疫組化代表圖（×100）

2.2 不同臨床特征CRC組織的HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

CRC組織中HCCR-1、Bcl-2的表達(dá)均與Dukes分期相關(guān)（P＜0.05）；均與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織類型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征CRC組織的HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況比較（例(%)）

2.3 CRC組織中HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示在CRC組織中，HCCR-1蛋白表達(dá)與Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.298，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 CRC組織中HCCR-1、Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)性

3 討論

CRC是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其具體病因目前尚未完全明確，有專家認(rèn)為，可能是遺傳、環(huán)境、飲食習(xí)慣及消化道疾病等多種因素共同作用的結(jié)果，且我國(guó)CRC近幾年病死率呈明顯上升。

HCCR是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的致癌基因，與人類多種腫瘤密切相關(guān)，可作為診斷肝癌、乳腺癌的標(biāo)志物。有研究表明，HCCR-1編碼的細(xì)胞膜外蛋白可造成線粒體功能障礙，以抵抗和抑制短波紫外線（Ultra Violet C，UVC）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[4]。有學(xué)者認(rèn)為，HCCR-1通過(guò)與人宮頸癌癌基因結(jié)合蛋白-1（Human Cervical Cancer Oncogene Binding Protein -1，HCCRBP-1）相互作用來(lái)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[5]。陳粉合等發(fā)現(xiàn)卵巢漿液性惡性腫瘤組患者的HCCR陽(yáng)性表達(dá)率為70.00%，高于對(duì)照組的8.00%，臨床分期III、IV期、組織學(xué)分級(jí)為中、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢漿液性惡性腫瘤患者HCCR蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平較高，且通過(guò)單因素分析得出，組織學(xué)分級(jí)是影響卵巢漿液性惡性腫瘤患者HCCR蛋白水平的因素[6]。

潘云翠等學(xué)者采用免疫組化法檢測(cè)HCCR-1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCCR-1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中呈現(xiàn)高表達(dá)（66.9%，107/160），且HCCR-1表達(dá)與臨床分期，組織學(xué)分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，雌激素受體表達(dá)，孕激素受體表達(dá)相關(guān)[7]。

Bcl-2基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[8]。熊見(jiàn)等發(fā)現(xiàn)胃癌中細(xì)胞凋亡率及Bcl-2表達(dá)率在胃黏膜癌變進(jìn)展中呈上升趨勢(shì)，且Bcl-2的過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞凋亡受抑，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展[9]。本研究結(jié)果中HCCR-1蛋白在正常結(jié)腸粘膜組織中無(wú)表達(dá)，在CRC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為73.45%，這一結(jié)果與陳粉合、潘云翠等研究結(jié)果基本一致，提示HCCR-1蛋白過(guò)量表達(dá)與CRC早期發(fā)生及病程進(jìn)展有關(guān)。另一方面，HCCR-1、Bcl-2的表達(dá)均與Dukes分期有關(guān)，且CRC組織HCCR-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性率均顯著高于癌旁正常組織，說(shuō)明HCCR-1、Bcl-2與腫瘤侵襲有關(guān)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示在CRC組織中，HCCR-1與Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，原因可能是Bcl-2的抑制作用導(dǎo)致HCCR-1過(guò)表達(dá)，與熊見(jiàn)等研究結(jié)果類似。另外，HCCR-1、Bcl-2的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織類型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與陳粉合、潘云翠等研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)楸狙芯康臉颖玖刻　?/p>

綜上，HCCR-1、Bcl-2蛋白在CRC組織中存在過(guò)表達(dá)狀態(tài)，與其臨床病理特征顯著相關(guān)，并能作為一種新的預(yù)后判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，為疾病診斷、預(yù)后判斷提供參考價(jià)值。