楊金波，李培東，劉春國(guó)，范春艷

（ 1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038 ； 2.青島信得藥業(yè)有限公司，山東 青島 266100 ）

禽流感是由A型流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類疾病，嚴(yán)重危害畜禽業(yè)發(fā)展和人類健康。其中H9N2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，可在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期存在，也引起其他病原體的繼發(fā)感染。近年來(lái)已有人感染H9N2的相關(guān)報(bào)道[1]。因此，加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型AIV的監(jiān)測(cè)并分析其遺傳變異特點(diǎn)及跨種傳播機(jī)制十分重要。

A型流感病毒基因組有8個(gè)基因節(jié)段，其中第7個(gè)基因節(jié)段M能夠編碼翻譯多種蛋白，包括M1基質(zhì)蛋白、M2離子通道蛋白以及M42等。M1是維持病毒形態(tài)的基質(zhì)蛋白[2]，也是調(diào)節(jié)病毒形態(tài)表型的決定性遺傳因素[3-4]，可以與HA和NA相互作用，在病毒粒子出芽過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，影響其形成和釋放[5-6]。同時(shí)，M1蛋白具有型特異性，可結(jié)合內(nèi)部病毒蛋白NP，二者的抗原性不同是流感病毒分型（A~D）的依據(jù)[5,7]。研究表明，基于M1蛋白的核酸疫苗對(duì)同源或異源AIV感染均可起到保護(hù)作用[8]。此外，深入研究M1有助于為開(kāi)發(fā)流感病毒新治療靶點(diǎn)提供參考[9]。M2蛋白是一種典型的Ⅲ型囊膜蛋白，是AIV表面除HA、NA外的另一種抗原[10]。有研究指出，M2蛋白可以與M1蛋白N端的1~160個(gè)氨基酸相互作用，從而達(dá)到協(xié)助M1蛋白順利出芽的目的[11-12]。M2含量雖少但具有較高的同源性，是研制流感通用疫苗的主要候選免疫原之一[13-14]。M42蛋白從結(jié)構(gòu)與功能上均類似M2蛋白，但僅在一些流感病毒株中表達(dá)，并非流感病毒復(fù)制所必需[15]。本研究對(duì)2019—2022年分離的幾株不同來(lái)源的H9N2亞型AIV進(jìn)行M基因的遺傳演化分析，以期為AIV的M蛋白相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用病料采集自部分養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞的氣管及泄殖腔分泌物。SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒（康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司）、一步法RT-PCR試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）、2×Taq預(yù)混液（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）、反轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑等（寶生物工程（大連）有限公司），瓊脂糖、電泳緩沖液等（北京索萊寶科技有限公司）。

主要儀器：TP350型PCR儀（TaKaRa公司）、DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

引 物HA（Bm-HA-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG，Bm-NS-890R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT）、NA（Bm-NA-1：TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT，Bm-NA-1413R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGT TTTTT）、M（Bm-M-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG，Bm-M-1027R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT）參照自Hoffmann等[16]設(shè)計(jì)的通用引物，Uni-12（AGCAAAAGCAGG）反轉(zhuǎn)錄引物均交由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集與病毒分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取有呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降的病死雞氣管、泄殖腔中的分泌物。RT-PCR擴(kuò)增病毒HA和NA基因參照SuperRT One Step RT-PCR Kit進(jìn)行。

反 應(yīng)體 系（50 μL）：SuperRT OneStep EnzymeMix 2 μL、2×SuperRT OneStepBuffer 25 μL、上下游引物各2 μL、模板8 μL、RNase-Free Water 19 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃終止反應(yīng)。

測(cè)序比對(duì)后確定為H9N2亞型AIV后，將陽(yáng)性病料接種于SPF雞胚尿囊腔，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，72 h后收獲尿囊液。收集具有HA效價(jià)的尿囊液，分裝-80 ℃凍存。

1.4.2 M基因的RT-PCR擴(kuò)增

使用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取尿囊液中病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于PCR擴(kuò)增，使用2×Taq預(yù)混液擴(kuò)增病毒M基因。

新的時(shí)代呼喚新的教育觀和人才觀。正如加德納所說(shuō)：“時(shí)代已經(jīng)不同，我們對(duì)才華的定義應(yīng)該擴(kuò)大。教育對(duì)孩子最大的幫助是引導(dǎo)他們走入適應(yīng)的領(lǐng)域，使其因潛能得以發(fā)揮而獲得最大的成就感?！币粋€(gè)好的英語(yǔ)教學(xué)評(píng)價(jià)體系，應(yīng)該是多元的、綜合的、開(kāi)放的。作為一線的英語(yǔ)教師，我堅(jiān)信每個(gè)孩子身上都有獨(dú)特的閃光點(diǎn)，每個(gè)孩子都能在我們積極構(gòu)建的多元評(píng)價(jià)體系中發(fā)揮潛能，學(xué)有所成。

反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25 μL、上下游引物各2 μL、模板2 μL、Sterile ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃終止反應(yīng)。

1.4.3 序列測(cè)定及分析

PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，送至北京擎科生物科技有限公司利用測(cè)序引物進(jìn)行病毒的基因序列測(cè)定。基因測(cè)序結(jié)果使用DNAStar 7.1軟件包進(jìn)行序列拼接（Seqman軟件）、翻譯（Editseq軟件）、比對(duì)以及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)變異分析（MegAlign軟件）。

通過(guò)NCBI Blastn搜索和下載各病毒基因的最相似序列以及國(guó)內(nèi)H9N2亞型AIV各進(jìn)化分支的經(jīng)典參考序列，使用MEGA 7軟件以Neighbor-joining（NJ）法繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。8株H9N2亞型AIV以及其他相關(guān)毒株信息及縮寫見(jiàn)表1。

表1 8株H9N2亞型AIV以及其他相關(guān)毒株信息及縮寫Tab.1 Eight strains of H9N2 subtype AIV and information and abbreviations of other related strains

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定（見(jiàn)圖1）

由圖1可知，8株分離株的PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)M特異性目的條帶，片段大小約為1 027 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 8株H9N2亞型M基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of eight strains of H9N2 subtype M gene PCR products

2.2 M核苷酸一致性分析（見(jiàn)表2、表3）

由表2可知，分離株與經(jīng)典株、疫苗株在M基因中核苷酸一致性主要在98%以上，為98.88%~99.90%，其中XD1與XD6、XD4與XD7對(duì)應(yīng)的序列相同，但一致性仍存在差異。分析結(jié)果顯示，與各分離株核苷酸一致性最高的參考序列最早來(lái)自2012年，其他毒株主要為2017年以來(lái)的病毒。

表2 與分離株的核苷酸一致性最高的參考毒株信息Tab.2 Reference viruses with highest genetic identities to H9N2 viruses 單位：%

由表3可知，一致性比較結(jié)果顯示，8個(gè)分離株M之間的核苷酸一致性為88.0%~99.7%，氨基酸一致性為89.7%~99.7%；XD1和XD6的核苷酸與氨基酸一致性均為最高達(dá)到99.7%；XD2和XD8的核苷酸一致性最低為88.0%，氨基酸一致性為90.0%；XD5和XD8的氨基酸一致性則最低為89.7%。8株分離株與2株經(jīng)典株進(jìn)行M基因序列比對(duì)分析核苷酸一致性表明，XD1~XD7與G1株的一致性最高為92.7%~94.2%，XD8與BJ94株的一致性最高為93.0%；與目前市場(chǎng)上的疫苗株（F98株、SD696株、WJ57株）進(jìn)行序列對(duì)比分析核苷酸一致性表明，XD1~XD7與WJ57株的一致性最高為96.7%~98.5%，XD8與SD696株的一致性最高為92.0%。

表3 分離株與經(jīng)典株、疫苗株的M基因之間的核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的一致性比較Tab.3 Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequences of M gene among isolates, classical strains and vaccine strains

2.3 H9N2亞型AIV M基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖2）

圖2 H9N2亞型AIV M基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of M genes of H9N2 avian influenza viruse

2.4 分離株的M基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析（見(jiàn)表4）

流感病毒的M基因包含1 027個(gè)核苷酸，其中M1蛋白由252個(gè)氨基酸編碼組成，M2蛋白由97個(gè)氨基酸殘基組成[13]。

由表4可知，在M1與M2蛋白中，8株分離株的10個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)相對(duì)保守；其余6個(gè)位點(diǎn)中，XD1~XD7均與經(jīng)典株不同，但與近年新出的疫苗株WJ57相同，XD8所有位點(diǎn)都與經(jīng)典株相同。

表4 分離株M基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析Tab.4 Analysis of key amino acid loci in M gene of isolates

3 討論

本研究對(duì)2019—2022年中國(guó)不同省份已接種過(guò)疫苗的養(yǎng)殖場(chǎng)分離到的8株H9N2亞型AIV進(jìn)行了M序列測(cè)定、進(jìn)化分析與重要位點(diǎn)分析。通過(guò)對(duì)8株分離株的M基因進(jìn)行分析得出，從分離時(shí)間來(lái)看，一致性最高毒株最早來(lái)自2012年；從核苷酸一致性來(lái)看，8株分離株與NCBI網(wǎng)站上序列的一致性均在98%以上，其中與XD8的核苷酸一致性最高的毒株序列來(lái)自H5N8亞型，表明其可能是一株重組病毒。與市面上的疫苗株一致性相比，XD1~XD7與WJ57株M基因的一致性最高，XD8與SD696株的一致性最高；8個(gè)分離株M之間的核苷酸與氨基酸一致性分別為88.0%~99.7%、89.7%~99.7%。由進(jìn)化樹(shù)分析可知，XD1~XD7屬于G1-like分支，XD8屬于BJ94-like分支。

Zhang等[17]對(duì)M蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，M1蛋白中的95K、224N和242N殘基和M2蛋白中的21G均有可能增加AIV的感染性。而本試驗(yàn)分離株與經(jīng)典株相比，XD1~XD7的M1蛋白發(fā)生T37A、R95K、S224N和K242N突變，M2蛋白發(fā)生D21G突變，與上述研究結(jié)論相符。研究顯示，當(dāng)M1蛋白的N30D和T215A發(fā)生突變時(shí)，不同病毒在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)高低不同的致病性[18]。本研究中，所有分離株的M1蛋白30位均為D，215位均為A，所以8株分離株在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的致病性也應(yīng)存在差異，具體差異情況還需要進(jìn)一步研究。

金剛烷類藥物可以靶向于M2蛋白，進(jìn)而起到抗流感作用[10]，S31N則是最常見(jiàn)的金剛烷抗性標(biāo)記[19]。XD1~XD7的M2蛋白第31位氨基酸存在S轉(zhuǎn)變?yōu)镹的變異，表明均具有金剛烷胺類藥物的抗性[19]；而XD8在31位氨基酸為S，顯示對(duì)金剛烷胺類藥物敏感。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究分離出8株禽源的H9N2亞型AIV，并對(duì)病毒的M基因進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增及基因序列分析。結(jié)果顯示，XD1~XD7分離株M基因?qū)儆贕1-like分支，XD8分離株M基因?qū)儆贐J94-like分支。XD1~XD7分離株顯示金剛烷胺類藥物抗性，并發(fā)生增加病毒感染性的突變，而XD8則顯示對(duì)金剛烷胺類藥物敏感。