張家瑞，剡文亮，宋 潔，龐 路，田江亞，何 軍，李智星，魏 勇*

（ 1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆 烏魯木齊 830063 ； 2.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830063 ）

隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)規(guī)?；同F(xiàn)代化，奶牛受到自身免疫能力下降、飼養(yǎng)環(huán)境不良、天氣驟然變化、日糧營養(yǎng)攝入失衡以及致病菌侵入等諸多因素影響均可能引起奶牛乳房炎，對養(yǎng)牛業(yè)造成一定經(jīng)濟(jì)損失[1]。對于奶牛臨床型乳房炎，獸醫(yī)可通過觀察奶牛乳頭狀況和乳汁的顏色、氣味、黏稠度以及有無絮片、凝塊等臨床癥狀進(jìn)行診斷。有研究發(fā)現(xiàn)，能夠引起奶牛乳房炎的常見致病菌有二十多種，其中包括許多易產(chǎn)生耐藥性的菌株；無法較準(zhǔn)確獲知主要致病菌，會對后續(xù)針對性的臨床治療和處置方案制定造成巨大障礙[2]?；茧[性乳房炎的奶牛一般不會表現(xiàn)明顯的臨床體征變化，但牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量會受到嚴(yán)重影響。為快速、準(zhǔn)確地篩選出可能患有隱性乳房炎的牛，需結(jié)合多種快速檢測方法進(jìn)行判定才更具科學(xué)性和實(shí)用性。

近年來，運(yùn)用快檢方法和致病菌分離鑒定法對當(dāng)?shù)氐哪膛Ｈ榉垦谆疾∏闆r和主要致病菌種類的研究逐漸受到重視。羅金印等[3]應(yīng)用蘭州乳房炎檢測法（MT）診斷法進(jìn)行蘭州地區(qū)奶牛乳房炎流行病學(xué)調(diào)查及病原菌的分離鑒定。胡海燕等[4]先采用美國加州乳房炎（CMT）方法篩選出天津某牧場患乳房炎病奶牛，再通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對乳房炎奶樣、患病牛畜舍及奶廳樣品進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，了解了牧場奶牛乳房炎奶樣及環(huán)境中細(xì)菌的種類和流行性。奶牛乳房炎的快速診斷和主要致病菌的鑒定會提高牧場奶牛乳房炎的治愈率，降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的概率。本試驗(yàn)采用CMT和體細(xì)胞數(shù)檢測（SCC）對隱性型乳房炎進(jìn)行快速診斷，臨床外觀法診斷臨床型乳房炎并進(jìn)行主要致病菌分離鑒定，以期為該場奶牛乳房炎后續(xù)治療和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腦心浸出液肉湯（BHI）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂基均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，伊紅美藍(lán)瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，30%過氧化氫溶液購自西安化學(xué)試劑廠，革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，CMT檢測試劑購自生泰爾（內(nèi)蒙古）科技有限公司。

Ⅲ型體細(xì)胞檢測儀購自華誠睿光（中國）生物科技有限公司、電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海鴻都電子科技有限公司、超凈工作臺購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.2 樣品來源

該某規(guī)?；膛鼋刂怪?022年7月存欄量為1 771頭，其中泌乳牛728頭、干奶牛118頭、青年牛698頭、犢牛227頭。泌乳牛基本飼養(yǎng)于封閉式圈舍，犢牛飼養(yǎng)于犢牛島和半開放式牛棚，其他牛群飼養(yǎng)于開放式牛棚。

本試驗(yàn)對該規(guī)?；膛龅?28頭荷斯坦泌乳牛進(jìn)行臨床觀察，從每頭患臨床乳房炎奶牛的患病乳區(qū)采集乳樣15 mL，共采集臨床型乳房炎牛乳汁12份。從每頭CMT陽性奶牛的患病乳區(qū)采集乳樣15 mL，共采集隱性乳房炎牛乳汁39份。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 臨床型乳房炎診斷

該牛場擠奶廳采用全自動套杯式擠奶機(jī)，棄頭三把奶時檢查乳汁是否存在顏色、性狀等的變化，若出現(xiàn)氣味惡臭、清水樣、絮片和凝塊等典型的乳房炎癥狀則可診斷為臨床型乳房炎。

1.3.2 CMT檢測及結(jié)果判定

擠奶前進(jìn)行乳區(qū)藥浴，隨后用經(jīng)過消毒的熱毛巾擦拭待檢乳頭，擦拭完一頭牛后立刻更換毛巾再擦拭下一頭。待檢乳頭隨后經(jīng)碘伏溶液藥浴35 s后，棄頭三把奶，檢測員將檢測盤水平放置于對應(yīng)待檢乳頭下，將乳汁分別擠在對應(yīng)的檢測盤內(nèi)。棄去多余乳汁，使各檢測盤內(nèi)的乳汁量基本一致，向每個檢測杯中加入與乳汁等量的CMT檢測液，水平搖勻兩種液體，按照CMT試劑判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行隱性乳房炎判定。

CMT檢測結(jié)果判定：乳汁和CMT檢測液混合后，無明顯變化且不出現(xiàn)沉淀，或少許沉淀但不久即消失判為陰性（-）；出現(xiàn)少量凝膠沉淀判為弱陽性（+）；出現(xiàn)大量凝膠塊呈凹凸附著于盤底判為陽性（++）；出現(xiàn)整塊凝膠塊，無法回轉(zhuǎn)攪動附著于盤底判為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3.3 SCC檢測及結(jié)果判定

采用15 mL乳樣收集管收集CMT檢測結(jié)果為“+”以上的乳區(qū)乳汁樣品，送至牛場化驗(yàn)室，按照Ⅲ型體細(xì)胞檢測儀操作說明書進(jìn)行乳樣SCC診斷檢測。

SCC檢測結(jié)果判定：根據(jù)國際乳業(yè)聯(lián)合會（IDF）牛乳體細(xì)胞數(shù)推薦分級標(biāo)準(zhǔn)的具體規(guī)定，牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)在50萬個/mL以上的牛可判斷為隱性乳房炎[5]。

1.3.4 細(xì)菌分離鑒定

無菌采集患臨床型奶牛乳房炎的乳汁樣品，在超凈工作臺內(nèi)用無菌槍頭吸取100 μL乳汁滴加并涂布至BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24 h，觀察培養(yǎng)基中菌落形態(tài)、顏色和大小，逐一挑取單個菌落進(jìn)行純化。細(xì)菌被純化至只能觀察到單一形態(tài)的菌落時進(jìn)行革蘭氏染色，100倍油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

根據(jù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌分別無菌挑取BHI培養(yǎng)基中的單個菌落劃線于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24 h后，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征按照奶牛乳房炎細(xì)菌分離鑒定程序[6]進(jìn)行初步鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件、SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計待檢奶牛胎次與奶牛隱性乳房炎頭陽性率的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛場臨床型乳房炎和隱性乳房炎患病率（見表1、表2）

由表1可知，本試驗(yàn)對728頭泌乳奶牛進(jìn)行乳房炎患病率調(diào)查，發(fā)現(xiàn)12頭奶牛的12個乳區(qū)患臨床型乳房炎，該規(guī)?；膛龅呐R床型乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為1.65%（12/728）和0.41%（12/2 896），瞎乳頭率為0.55%（16/2 912）。

表1 奶牛場奶牛臨床型乳房炎患病情況Tab.1 Prevalence of clinical mastitis in dairy cows

由表2可知，運(yùn)用CMT法從剩余未表現(xiàn)出臨床乳房炎癥狀的716頭奶牛中檢測出隱性乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為5.45%（39/716）和1.46%（42/2 884）。為避免肉眼觀察造成的失誤，將39頭奶牛的42個乳區(qū)的乳樣進(jìn)行SCC法檢測，結(jié)果均為隱性乳房炎。

表2 奶牛場奶牛隱性乳房炎患病情況Tab.2 Prevalence of latent mastitis in dairy cows

2.2 不同胎次的奶牛隱性奶牛乳房炎的患病情況（見表3）

由表3可知，該規(guī)?；膛霾煌ゴ伍g的奶?；茧[性乳房炎的頭陽性率存在明顯差異，其中4胎泌乳牛隱性乳房炎的患病頭數(shù)明顯高于其他胎次的泌乳牛，6胎及以上泌乳牛的頭陽性率明顯高于其他胎次。

表3 不同胎次的奶牛隱性奶牛乳房炎的患病情況Tab.3 Prevalence of recessive mastitis in cows with different parity

2.3 細(xì)菌分離鑒定試驗(yàn)結(jié)果（見圖1）

由圖1（a）~圖1（c）可知，挑取BHI瓊脂中經(jīng)分離純化出的單一菌落，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察到呈圓形或橢圓形，單個菌體較大，多成簇、成對或單個存在的革蘭氏陽性菌。單個菌體稍小，多為鏈狀排列，鏈的長短不一，長者可多達(dá)十幾乃至近百個菌體相連；短者為成對出現(xiàn)的革蘭氏陽性菌和兩端圓，中等大，單個或兩個菌體相連出現(xiàn)的革蘭氏陰性短桿菌。

由圖1（d）可知，甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基上的菌落生長良好，呈黃玉米色且不透明，菌落下的瓊脂也呈黃玉米色。由圖1（e）可知，哥倫比亞血瓊脂上的菌落灰白色不透明，出現(xiàn)β溶血。由圖1（f）可知，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落生長旺盛，菌落呈粉紅色，不透明，菌落下的瓊脂也呈粉紅色。由圖1（g）可知，伊紅美藍(lán)瓊脂中觀察到帶有金屬光澤的單個菌落。由圖1（h）可知，圓圈中3%過氧化氫溶液中出現(xiàn)氣泡，方框中3%過氧化氫溶液中無氣泡。

圖1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 Results of bacterial isolation and identification

3 討論

如今，奶牛乳房炎仍然是阻礙養(yǎng)牛業(yè)良性發(fā)展的因素之一。快速、準(zhǔn)確地篩選出可能患有隱性乳房炎的牛及較準(zhǔn)確地獲知引起奶牛乳房炎的主要致病菌，以減少制定后續(xù)針對患乳房炎牛的臨床治療和處置方案的障礙，從而降低其對牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量方面造成的經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)[7]。

3.1 該牛場奶牛乳房炎的患病率較低但仍需改善

本試驗(yàn)通過采用CMT和SCC對隱性型乳房炎進(jìn)行診斷，臨床外觀法診斷臨床型乳房炎。結(jié)果顯示，該規(guī)?；膛龅呐R床型乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為1.65%（12/728）和0.41%（12/2 896）；隱性乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為5.45%（39/716）和1.46%（42/2 884）；瞎乳頭率為0.55%（16/2 912）。

宋家騏等[8]對兗州區(qū)某規(guī)模牛場進(jìn)行隱性乳房炎和臨床型乳房炎實(shí)地調(diào)查，奶牛隱性乳房炎的陽性率為23.7%，臨床型乳房炎發(fā)病率為4.3%。劉鴿等[9]采用SCC法對石河子某奶牛場奶牛隱性乳房炎的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，頭陽性率高達(dá)39.81%（164/412），乳區(qū)陽性率為26.95%（436/1 618）。雖然本研究中牛場奶牛乳房炎的患病率低于上述調(diào)查結(jié)果，但該牛場的奶牛乳房炎患病情況和國內(nèi)一流奶牛養(yǎng)殖企業(yè)的養(yǎng)殖水平仍存在一定距離，還需具體分析復(fù)雜的患病原因，方可有效改善泌乳牛的健康情況。

3.2 不同胎次的奶?；茧[性乳房炎的主要風(fēng)險因素不同

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該牛場不同胎次間的奶牛患隱性乳房炎的頭陽性率均差異顯著，其中6胎及以上的泌乳牛的隱性乳房炎的患病頭數(shù)均顯著高于其他胎次的泌乳牛。劉鴿[10]對新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；膛龅?12頭澳系荷斯坦泌乳牛進(jìn)行的乳房炎患病情況調(diào)查，使用LMT法和SCC法統(tǒng)計分析出奶牛的生產(chǎn)胎次和奶牛乳房炎患病率呈正相關(guān)，奶牛乳房炎患病率與年齡增長基本呈正相關(guān)，與本研究得出的結(jié)果相似。

初步分析出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是年齡偏大的奶牛乳房韌帶松弛，下墜的乳頭會增加擠奶工檢查乳汁性狀變化的難度，難以及時發(fā)現(xiàn)處于乳房炎初期的牛乳汁異常情況，導(dǎo)致患病奶牛不能及時得到治療，后續(xù)增加了發(fā)展成隱性乳房炎的概率，患牛還會變?yōu)椴粩嗯哦镜膫魅驹?，威脅同群其他健康牛[11]。此外，日常的生產(chǎn)中，年齡偏大的奶牛乳房受傷的概率會大大增加，加之年齡偏大的奶牛自身免疫力下降，感染乳房炎致病菌的機(jī)會增加。因此，在奶牛場的實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)有計劃地淘汰年齡偏大的奶牛，適時調(diào)整泌乳牛年齡結(jié)構(gòu)。

本研究中，頭胎牛的隱性乳房炎的頭陽性率稍低于4胎牛，分析原因可能是頭胎牛攻擊性強(qiáng)，對待擠奶員的刺激會有激烈的自衛(wèi)性反應(yīng)，擠奶員出于對個人安全的考慮會放棄對其進(jìn)行細(xì)致消毒。此外，若擠奶前消毒不規(guī)范，未做到在擦完前一頭奶牛后及時更換毛巾；擠奶員在擠完患病牛后不及時清洗雙手或更換橡膠手套，只在一批牛擠奶完畢后才進(jìn)行手套的消毒工作，不規(guī)范操作極易造成健康牛受到病原微生物侵害而患病[12]。

3.3 致病菌的感染依然是主要風(fēng)險因素之一

本試驗(yàn)從12份臨床型乳房炎乳汁樣本中初步分離鑒定出2株金黃色葡萄球菌、5株大腸桿菌和5株鏈球菌屬。本研究結(jié)果與羅金印[3]的蘭州地區(qū)無乳鏈球菌和大腸桿菌檢出率最高，金黃色葡萄球菌檢出率其次的結(jié)論基本一致。由于某些因素造成奶牛乳頭受損或奶牛機(jī)體發(fā)生比較嚴(yán)重的感染時，機(jī)體的防御平衡被打破，病原微生物趁機(jī)入侵；或原本寄居于乳房內(nèi)的條件性病原微生物開始活化，并大量增殖而使乳房致病[13]。

大多數(shù)奶牛場只重視隱性乳房炎對乳品質(zhì)檢測中體細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)的影響，但對引發(fā)奶?；寂R床型乳房炎的主要致病菌的危害性認(rèn)識不足。金黃色葡萄球菌廣泛分布于日常環(huán)境中，具有很強(qiáng)的傳染性、對抵御環(huán)境和外部壓力的耐受能力強(qiáng)等特點(diǎn)，對抗生素的耐藥性十分明顯，是導(dǎo)致奶牛患乳房炎的主要致病菌[14]。隨著細(xì)菌變異、耐藥菌株增多，奶牛乳房炎臨床治療和淘汰處置難度增加，需要對患牛進(jìn)行有針對性的治療，方可達(dá)到更好的治療效果，有效規(guī)避產(chǎn)生耐藥菌產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可在偏酸性的環(huán)境下進(jìn)行增殖。當(dāng)泌乳牛的飼料配方中出現(xiàn)蛋白質(zhì)含量偏高，脂肪含量偏低等營養(yǎng)失衡的情況時，可能會導(dǎo)致乳房內(nèi)出現(xiàn)偏酸性環(huán)境，大腸桿菌可大量定植[15]。只有當(dāng)奶牛自身免疫力降低時，鏈球菌才會引起奶牛患乳房炎，但單純由鏈球菌誘發(fā)的奶牛隱性型乳房炎仍然會使產(chǎn)奶量急劇下降。因此，若牛場未對泌乳牛進(jìn)行分段飼喂可能會增加大腸桿菌和鏈球菌等條件致病菌的侵入，進(jìn)而誘發(fā)奶牛乳房炎[16]。

4 結(jié)論

綜上所述，該奶牛場奶牛乳房炎患病率較低但仍需進(jìn)一步加強(qiáng)預(yù)防管理，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌屬可能是該牛場乳房炎主要致病菌。