馬麗娜，趙正偉，王 錦，馬 青

（ 寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002 ）

灘羊是我國特有的優(yōu)良輕裘皮綿羊品種，“二毛皮”更是久負盛名，享譽海內(nèi)外[1]。近年來，關(guān)于灘羊被毛卷曲的研究主要集中于彎曲密切相關(guān)的候選基因及信號通路的研究，通過灘羊mRNA和miRNA的綜合分析，提供了控制彎曲形成的潛在機制[2]。本研究基于前期利用基因組學和轉(zhuǎn)錄組學篩選出的與灘羊皮毛發(fā)育相關(guān)的候選基因Hoxc13基因，采用PCR和DNA測序方法，進行灘羊二毛皮Hoxc13基因與二毛性狀的關(guān)聯(lián)研究，為解析相關(guān)基因調(diào)控灘羊毛皮發(fā)育的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選擇100只灘羊頸靜脈采血，置于EDTA抗凝管，-20 ℃保存。灘羊來自寧夏鹽池朔牧灘羊有限公司。

1.2 二毛性狀測定方法

采用GB/T 2033—2008方法測定35日齡左右的灘羊羔羊毛長、毛股彎曲數(shù)。

1.3 灘羊全血DNA提取及濃度的檢測

采用血液基因組DNA提取試劑盒（DP318-03，天根生化科技公司）進行DNA提取，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度。

1.4 引物信息（見表1）

表1 Hoxc13基因引物Tab.1 Hoxc13 gene primer

根據(jù)Genebank提供的綿羊Hoxc13 基因序列，利用Primer5.0在線設(shè)計引物，引物由上海生工進行合成。

1.5 PCR擴增體系與反應(yīng)程序

PCR擴 增體系：20~50 μg/L模 板DNA 1~2 μL、10 μmol/L引物F 2 μL、10 μmol/L引物R 2 μL、10 mmol/L Dntp (mix) 2 μL、10×Taq Buffer (with MgCl2) 5 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL，添加ddH2O至50 μL。

PCR擴增反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性3~5 min；94 ℃變性30 s，55~60 ℃退火25~30 s， 72 ℃延伸30~50 s，35個循環(huán)；72 ℃修復延伸5~8 min。

1.6 PCR產(chǎn)物檢測

利用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行檢測，電泳參數(shù)：150 V、100 mA、10~20 min電泳觀察。

1.7 PCR產(chǎn)物測序分型

利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（批號：B518141，生工生物工程（上海）股份有限公司）對PCR條帶進行回收純化，并送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，根據(jù)序列比對，進行Hoxc13基因基因型分型。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.8.1 基因頻率與基因型頻率統(tǒng)計

1.8.2 基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析

采用SAS 8.02統(tǒng)計軟件的GLM程序?qū)蛐团c二毛性狀進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊全基因組DNA電泳檢測結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳對灘羊基因組DNA進行檢測，結(jié)果表明，提取的基因組DNA無降解，DNA純度可達到后續(xù)試驗要求。

圖1 灘羊全基因組DNA電泳檢測結(jié)果Fig.1 DNA electrophoresis detection results of whole genome of Tan Sheep

2.2 Hoxc13基因多態(tài)性檢測結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測Hoxc13基因擴增產(chǎn)物，結(jié)果與圖1條帶一致。

圖2 Hoxc13基因多態(tài)性檢測結(jié)果Fig.2 Hoxc13 gene polymorphism detection results

2.3 Hoxc13基因PCR產(chǎn)物測序結(jié)果（見圖3~圖5）

由圖3~圖5可知，通過Hoxc13基因PCR擴增產(chǎn)物測序分析，發(fā)現(xiàn)Hoxc13基因在灘羊群體中存在3種基因型：CC型、CT型和TT型。

圖3 Hoxc13基因CC型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of Hoxc13 gene CC type PCR products

圖4 Hoxc13基因CT型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of Hoxc13 gene CT type PCR products

圖5 Hoxc13基因TT型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of Hoxc13 gene TT type PCR products

2.4 Hoxc13基因的等位基因和基因型頻率（見表2）

由表2可知，灘羊群體中TT基因型頻率17%，CT基因型頻率為38%，CC基因型為45%；等位基因頻率為C（64%）、T（36%）。

表2 灘羊Hoxc13基因等位基因和基因型頻率Tab.2 Allele and genotype frequency of Hoxc13 gene in Tan sheep

2.5 Hoxc13基因多態(tài)性與二毛性狀關(guān)聯(lián)（見表3）

由表3可知，Hoxc13基因不同基因型的彎曲數(shù)差異不顯著（P>0.05）。CT基因型灘羊毛長比CC基因型多1.06 cm（P<0.01），比TT基因型多1.84 cm（P<0.01）；CC基因型灘羊平均毛長比TT基因型多0.24 cm（P>0.05）。結(jié)果表明，C等位基因與灘羊二毛期毛長呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

表3 Hoxc13基因多態(tài)性與二毛性狀關(guān)聯(lián)Tab.3 Association of Hoxc13 gene polymorphism with hirsute traits

3 討論

作為同源異型盒基因（Homeobox，Hox）基因家族Abd-B類成員，Hoxc13基因在動物毛囊發(fā)育、毛發(fā)的生長過程中的表達直接影響毛發(fā)的特性。尤其是在哺乳動物毛囊的周期性發(fā)育過程中，Hoxc13基因通過控制毛發(fā)結(jié)構(gòu)蛋白角蛋白（KP）和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（KAP）在毛囊不同時期的不同表達，進行毛囊生長期、退行期和休止期之間轉(zhuǎn)換，進而直接控制毛發(fā)性狀的形成和改變[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，Hoxc13基因在蘇博美利奴羊皮膚組織的表達量高于其他器官組織，表明Hoxc13基因參與皮膚毛囊發(fā)育過程[5]。在陜北白絨山羊羊絨周期生長過程中，轉(zhuǎn)錄因子Hoxc13通過對KRT38、KRT84基因正調(diào)控和對KRT1基因負調(diào)控直接影響毛囊發(fā)育[6]。

馬朝[7]通過擴增絨山羊和蒙古羊Hoxc13基因片段，并進行序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哺乳動物Hoxc13基因非常保守，同源性非常高，出生兩周后的絨山羊羔羊皮膚中Hoxc13基因的表達量比70 d胚胎的皮膚中多。張燕軍等[8]研究構(gòu)建絨山羊Hoxc13基因過表達載體，分離并克隆了內(nèi)蒙古絨山羊Hoxc13基因的cDNA序列，并構(gòu)建該基因的過表達載體pECFP-Hoxc13。Hoxc13基因具有比較保守的遺傳特性，雖然在陜北白絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊中未發(fā)現(xiàn)Hoxc13基因與KAP16.2和KAP16.6基因的相關(guān)突變[9]，但獲得了西藏絨山羊Hoxc13基因的CDS序列，并揭示了西藏絨山羊Hoxc13基因的多態(tài)性和表達研究[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Hoxc13基因SNPs位點與西藏絨山羊纖維直徑性狀有關(guān)，并可作為高效選育超細型西藏絨山羊纖維直徑性狀相關(guān)的分子標記[11]。Hoxc13基因在陜北白絨山羊高產(chǎn)和低產(chǎn)絨量皮膚組織在生長期平均相對表達量低于休止期。Hoxc13基因可通過對KAP9.2基因的表達調(diào)控抑制絨毛生長[12]。在毛發(fā)生長發(fā)育過程中，Wnt信號通路可調(diào)控Hoxc13基因的表達，Hoxc13基因可以增強毛發(fā)角蛋白的啟動子活性，抑制非毛發(fā)角蛋白的啟動子活性。因此Hoxc13基因通過對毛發(fā)角蛋白和非毛發(fā)角蛋白的不同調(diào)控功能參與毛囊分化的分子機制[13]。

灘羊二毛皮是灘羊出生后35 d左右表現(xiàn)的毛發(fā)性狀，有研究表明，其性狀形成可能與胚胎期控制毛囊與毛纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達及其調(diào)控有關(guān)[14]。灘羊二毛期毛長的平均值為8.08 cm，二毛期彎曲數(shù)平均值為6個，二毛期毛長與側(cè)部彎曲呈極顯著中等正相關(guān)[1]。在應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析灘羊初生期與二毛期的差異蛋白的研究中，結(jié)果顯示，灘羊二毛期皮膚有高表達差異蛋白122個，不同蛋白的表達對二毛期毛囊發(fā)育和毛發(fā)彎曲形成有關(guān)[15]。

綜上所述，Hoxc13基因可能為控制灘羊毛纖維發(fā)育相關(guān)基因，通過調(diào)控二毛期皮膚蛋白的表達從而影響毛囊發(fā)育和毛發(fā)彎曲的形成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，Hoxc13基因在灘羊群體中存在3種基因型，即CC型、CT型和TT型；群體中CC基因型頻率17%，CT基因型頻率為38%，TT基因型為45%，等位基因頻率為C（64%）、G（36%）；基因型CT個體毛長顯著高于基因型CC、TT（P<0.05）。結(jié)果表明，Hoxc13基因可以作為灘羊二毛性狀分子標記輔助選育的關(guān)鍵基因，在育種工作中可以選擇Hoxc13基因CT基因型個體進行灘羊串子花品系選育。