萬正洋，黃業(yè)傳*，彭春雷，李 寧，程雨姍，陳 丹，張克媛，程佳琪

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

從番木瓜中提取的木瓜蛋白酶能有效降解肉類中含有的肌肉纖維[1]，其原理在于肉中的部分彈性蛋白和膠原蛋白能被蛋白酶水解，使肉制品軟化，口感更嫩滑、細(xì)膩，利于咀嚼[2]。肉類腌制或加工時除了加入嫩化酶外，還會加入一些植物性輔料，其中可能含有VC、多酚、植物黃酮等[2]，這些小分子物質(zhì)會和木瓜蛋白酶結(jié)合，影響蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白酶的活性和嫩化效果，如木瓜蛋白酶與茶多酚[3]結(jié)合后其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活力增強；乙二醇[4]會抑制木瓜蛋白酶活性表達(dá)；殼聚糖[5]可使木瓜蛋白酶實現(xiàn)良好的固定化。很多學(xué)者就小分子對蛋白酶活性的影響機制進(jìn)行了較深入的研究。褚盼盼[6]發(fā)現(xiàn)，黑豆皮花青素對酪氨酸酶活性有抑制作用。肖會芝[7]發(fā)現(xiàn)，單寧酸對α-葡萄糖苷酶的抑制效果強于其他標(biāo)準(zhǔn)抑制劑（阿卡波糖）。王麗麗等[8]發(fā)現(xiàn)，白茶中乙酸乙酯層的小分子可抑制豬胰彈性蛋白酶的活性。目前使用的實驗手段雖然可以判斷小分子對蛋白酶活性的激活或抑制作用，但不能從微觀上探究蛋白酶活性改變的原因，而分子動力學(xué)模擬和分子對接技術(shù)可以呈現(xiàn)二者的結(jié)合機制，進(jìn)一步分析蛋白結(jié)構(gòu)的具體變化。分子對接是根據(jù)幾何匹配、能量匹配和化學(xué)環(huán)境匹配的原理，尋找受體和配體之間的最佳結(jié)合模式。如Kanakis[9]、Li Ti[10]等分別用分子對接研究茶多酚、黃酮與β-乳球蛋白的結(jié)合過程。分子動力學(xué)模擬能將小分子和蛋白的結(jié)合過程更直觀地呈現(xiàn)出來，如Gholami等[11]研究柚皮苷與β-乳球蛋白的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點在β-乳球蛋白的外表面。蛋白與多酚類物質(zhì)結(jié)合的分子模擬報道較多，如茶多酚、花青素等，而蛋白與抗壞血酸等小分子的結(jié)合機制卻鮮有報道。

不同小分子對各種蛋白酶的作用機制不同[12-14]，具體到木瓜蛋白酶，何平等[15]發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶在體積分?jǐn)?shù)小于10%的低疏水參數(shù)有機溶劑中酶活力提高。張存瀅等[16]發(fā)現(xiàn)，隨著木瓜蛋白酶分子構(gòu)象有序度的增加，其酶活性也相應(yīng)提高，且用鄒氏酶活性不可逆改變動力學(xué)模型能很好解釋雙金屬離子與木瓜蛋白酶結(jié)合的動力學(xué)規(guī)律。鑒于抗壞血酸和木瓜蛋白酶經(jīng)常存在于同一食品體系中，而目前關(guān)于抗壞血酸影響木瓜蛋白酶活性的報道較少，因此研究其與木瓜蛋白酶結(jié)合的相關(guān)分子機制對提高肉類的嫩化效果及品質(zhì)有重要意義。本研究考察3 種濃度（0.1、0.2、0.3 mmol/L）抗壞血酸處理木瓜蛋白酶后對其酶活性的影響，并采用分子動力學(xué)模擬和分子對接技術(shù)研究抗壞血酸和木瓜蛋白酶的結(jié)合機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（80 萬U/g） 北京索萊寶科技有限公司；DL-半胱氨酸、L-酪氨酸（均為99%生物技術(shù)級別）、L-抗壞血酸、二水合磷酸氫二鈉、三氯乙酸、干酪素、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TP-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 木瓜蛋白酶酶活力測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制100 μg/mLL-酪氨酸溶液，取0、1、2、3、4、5 mL于6 支試管中，依次加水至體積為10 mL，得到質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、 50 μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次于275 nm波長處測定吸光度，以L-酪氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力的測定：配制0.3 mg/mL的木瓜蛋白酶液，取1 mL酶液分別加入4 支帶塞試管（A、B、C、空白管），再配制濃度分別為0.1、0.2、0.3 mmol/L的3 種抗壞血酸溶液，每種濃度取0.2 mL對應(yīng)加入試管A、B、C與酶液混勻，加入5 mL 6.0 g/L酪蛋白溶液，在37 ℃條件下反應(yīng)10 min，用5 mL 0.1 mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)；空白管先加入5 mL 0.1 mol/L三氯乙酸溶液使木瓜蛋白酶失去活性，以阻止蛋白酶的水解反應(yīng)，再加入5 mL 6.0 g/L酪氨酸溶液混勻。4 支試管在37 ℃條件下放置40 min，最后過濾分離沉淀物，取濾液，用紫外分光光度計于275 nm波長處測定吸光度，純水作空白。木瓜蛋白酶酶活力按下式計算。

式中：X為木瓜蛋白酶酶活力/（U/g）；V1為溶解木瓜蛋白酶所用容量瓶的體積/mL；A為木瓜蛋白酶樣品稀釋液的酶活力/（U/mL），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算；V2為試管中反應(yīng)液的總體積/mL；n為酶液稀釋倍數(shù)；t為酪蛋白與木瓜蛋白酶的作用時間（10 min）；m為稱取木瓜蛋白酶的質(zhì)量/g。

1.3.2 分子動力學(xué)模擬

從RCSB數(shù)據(jù)庫下載木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)（ID號：1ppn），手動去除結(jié)晶水和雜離子，并補全缺失的原子，再將抗壞血酸用分子對接的方法結(jié)合到木瓜蛋白酶中，探究最佳結(jié)合位置?？箟难嵊肅hemDraw Professional 17.1和Chem3D 17.1準(zhǔn)備，并用其自帶的MM2力場進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過AutoDock Tools軟件[17]對木瓜蛋白酶和抗壞血酸小分子進(jìn)行預(yù)處理，分別生成二者的pdbqt文件。然后進(jìn)行木瓜蛋白酶和抗壞血酸的分子對接，小分子設(shè)置為全柔性，盒子大小設(shè)定為32×32×32 ?，中心坐標(biāo)為默認(rèn)值，設(shè)置間隔為1 ?。對接時采用AutoDock Vina[18]搜索前20 個 得分最高的對構(gòu)象，對接參數(shù)Energy_Range設(shè)置為5，Exhaustiveness設(shè)置為100。

分子對接結(jié)束后，采用Gromacs軟件[19]，用最優(yōu)構(gòu)象進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，小分子的Top文件在ATB網(wǎng)站生成。本研究選用GROMOS54a7力場描述相互作用[20]，采用SPC水模型將結(jié)合體浸入立方體形狀的周期水盒中，利用最速下降法對體系進(jìn)行能量最小化，以緩解不利的相互作用[21-22]。先在NVT和NPT系綜下分別進(jìn)行400 ps的平衡，最后進(jìn)行150 ns的分子動力學(xué)模擬，模擬步長為2 fs，每10 ps儲存1 次數(shù)據(jù)。模擬結(jié)束后，使用gmx的rms命令分析模擬過程中體系的均方根誤差（root mean square deviation，RMSD）[23]；并用gmx的相應(yīng)命令分析木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)在0～150 ns內(nèi)的蛋白殘基均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）、二級結(jié)構(gòu)、蛋白溶劑可及表面積等，而對于氫鍵數(shù)量和RMSF，只分析蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后100～150 ns區(qū)間的數(shù)據(jù)，分析時每100 ps選取1 個數(shù)據(jù)點，所得數(shù)據(jù)結(jié)果用Origin 9.1軟件進(jìn)行圖表繪制，選用Excel 2019系統(tǒng)軟件比較多組數(shù)據(jù)的差異性，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗壞血酸對木瓜蛋白酶活性的影響

圖 1 不同濃度抗壞血酸對木瓜蛋白酶的激活率Fig. 1 Percentages of activation of papain by ascorbic acid at different concentrations

有相關(guān)研究[24]表明，木瓜蛋白酶的激活劑多具有還原性，這些還原性化合物能將酶活性中心的反應(yīng)基團還原，使其被激活。由圖1可知，選取3 種濃度的抗壞血酸（0.1、0.2、0.3 mmol/L）加入到酶反應(yīng)體系中，平均激活率分別為10%、21%、28%，均呈激活作用，且抗壞血酸濃度越高，激活作用越明顯。與之類似的還有邵法都等[25]發(fā)現(xiàn)，低濃度的抗壞血酸能有效促進(jìn)木瓜蛋白酶活性。Ol’Shannikova等[26]發(fā)現(xiàn)，在殼聚糖微粒與木瓜蛋白酶復(fù)合前加入抗壞血酸，能使木瓜蛋白酶活力增強。這些都與本研究的分析基本一致。Ockerman等[27]發(fā)現(xiàn)，2.5 mmol/L抗壞血酸會抑制木瓜蛋白酶活性，這與本研究的結(jié)果不一致，這可能與該研究添加的抗壞血酸濃度約為本研究的10 倍有關(guān)，本研究選用的抗壞血酸最高濃度為0.3 mmol/L。

2.2 木瓜蛋白酶與抗壞血酸結(jié)合的分子動力學(xué)

2.2.1 木瓜蛋白酶與抗壞血酸的結(jié)合位點

圖 2 抗壞血酸與木瓜蛋白酶結(jié)合構(gòu)象Fig. 2 Binding conformation between ascorbic acid and papain

圖 3 抗壞血酸與木瓜蛋白酶的結(jié)合位點Fig. 3 Binding sites between ascorbic acid and papain

由圖2可知，抗壞血酸主要結(jié)合在木瓜蛋白酶的活性中心附近。由圖3可知，213號位為小分子抗壞血酸，活性位點由3 個氨基酸構(gòu)成：Asp158、His159、Cys25。相關(guān)研究[25-26]也表明，在木瓜蛋白酶的活性位點中，Cys25在催化反應(yīng)中發(fā)揮主要作用?？箟难崤c木瓜蛋白酶結(jié)合后，與活性中心的距離較近，易對活性中心產(chǎn)生一定作用，進(jìn)而影響木瓜蛋白酶的酶活性。

2.2.2 RMSD在模擬過程中的變化

圖 4 木瓜蛋白酶和抗壞血酸模擬分子對接過程中RMSD的變化Fig. 4 Changes in RMSD during molecular docking between papain and ascorbic acid

RMSD可體現(xiàn)蛋白質(zhì)原始構(gòu)象與在特定時間其結(jié)構(gòu)的平均偏差[27]，是評價研究體系是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)。由圖4可知，結(jié)合前木瓜蛋白酶的RMSD變化程度最小，在0.2 nm左右。而小分子抗壞血酸前期波動較大，在70 ns后基本保持穩(wěn)定，其總體波動明顯高于木瓜蛋白酶分子。與抗壞血酸結(jié)合后，木瓜蛋白酶的RMSD變化可分為2 個階段：前70 ns，結(jié)合體的RMSD與木瓜蛋白酶很接近；70～150 ns時，由于抗壞血酸波動較大，引起結(jié)合體后期波動略大于木瓜蛋白酶，曲線整體呈略微上升的趨勢，并趨于平穩(wěn)，說明木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)此時已得到充分弛豫，但總體看來，加入抗壞血酸沒有影響到木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，原因可能是木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)較小，只含有212 個氨基酸[28]，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，抗壞血酸并不會影響木瓜蛋白酶的α-螺旋和β-折疊，木瓜蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)在與抗壞血酸結(jié)合過程中保持較好?？讘c新等[29]進(jìn)行茶多酚與β-乳球蛋白結(jié)合的分子模擬，發(fā)現(xiàn)結(jié)合過程中小分子僅在有限pH值范圍內(nèi)波動，不會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。鐘姝凝[30]模擬人參皂苷與β-葡萄糖苷酶的分子對接時發(fā)現(xiàn)，結(jié)合較平穩(wěn)，RMSD較小。這些都與本研究的結(jié)論相似。

2.2.3 RMSF在模擬過程中的變化

RMSF可體現(xiàn)蛋白質(zhì)中各氨基酸殘基的波動情況[31]，反映相比于平均構(gòu)象蛋白質(zhì)中每個氨基酸殘基的位置變化?？箟难岷湍竟系鞍酌附Y(jié)合100 ns后結(jié)構(gòu)才比較穩(wěn)定，所以取100～150 ns數(shù)據(jù)進(jìn)行計算。

圖 5 木瓜蛋白酶和抗壞血酸模擬分子對接過程中RMSF的變化Fig. 5 Changes in RMSF during molecular docking between papain and ascorbic acid

由圖5可知，在結(jié)合前，木瓜蛋白酶大部分氨基酸的RMSF較小，自由程度低，表明主體結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，這一模擬結(jié)果與劉金珂[32]研究木瓜蛋白酶在弛豫過程中RMSF的變化趨勢一致。而與抗壞血酸結(jié)合后，木瓜蛋白酶RMSF波動程度明顯增大，第193～197號位殘基波動相對較大，第195號位殘基波動最大，其RMSF在結(jié)合前后增大0.423 nm，而木瓜蛋白酶活性中心上的3 個氨基酸的RMSF也都在結(jié)合后略微變大，說明在與小分子結(jié)合后蛋白質(zhì)分子內(nèi)部有部分作用力會丟失，導(dǎo)致天然構(gòu)象的穩(wěn)定性降低。周冠宇等[33]發(fā)現(xiàn)，角蛋白酶的部分殘基RMSF變大后，蛋白酶的靈活性會提高，進(jìn)而增強酶活力，這與本研究的結(jié)論基本一致。

2.2.4 抗壞血酸對木瓜蛋白酶回旋半徑的影響

圖 6 木瓜蛋白酶與木瓜蛋白酶-抗壞血酸結(jié)合體的回旋半徑Fig. 6 Comparison of gyration radius between papain and papainascorbic acid conjugate

回旋半徑越小，表明蛋白結(jié)構(gòu)越致密，反之則越膨脹。由圖6可知，整體來看，木瓜蛋白酶與抗壞血酸結(jié)合后的回旋半徑隨模擬時間的延長緩慢下降。回旋半徑曲線在0～70 ns波動較為劇烈，整體呈下降趨勢，在70 ns之后波動減小，逐漸趨于穩(wěn)定。而木瓜蛋白酶在0～70 ns的回旋半徑曲線雖然也呈下降趨勢，但波動與結(jié)合體相比更平緩。整體來看，0～150 ns，木瓜蛋白酶與結(jié)合體的回旋半徑相差不大，回旋半徑均較小，蛋白結(jié)構(gòu)較致密。Sahihi等[34]發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白與黃酮類化合物絡(luò)合時，蛋白的回旋半徑較平穩(wěn)，變化較小，結(jié)合前后都穩(wěn)定在1.40～1.45 nm，這與本研究的結(jié)論基本一致。

2.2.5 抗壞血酸對木瓜蛋白酶氫鍵的影響

圖 7 木瓜蛋白酶與木瓜蛋白酶-抗壞血酸結(jié)合體的氫鍵數(shù)量Fig. 7 Comparison of the number of hydrogen bonds between papain and papain-ascorbic acid conjugate

氫鍵是一種重要的非共價結(jié)合力，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由圖7可知，對100～150 ns區(qū)間數(shù)據(jù)計算得到，與抗壞血酸結(jié)合后，木瓜蛋白酶之間的氫鍵數(shù)量變少，結(jié)合前氫鍵數(shù)量的平均值為146，而加入抗壞血酸之后的平均值為143?？赡苁请S著模擬進(jìn)程的不斷推進(jìn)，抗壞血酸和木瓜蛋白酶之間能夠形成氫鍵的原子發(fā)生位移，其距離或角度只要到達(dá)形成氫鍵的范圍內(nèi)就可以進(jìn)一步形成氫鍵。根據(jù)以上結(jié)果可合理推斷出，木瓜蛋白酶與抗壞血酸結(jié)合后，木瓜蛋白酶與抗壞血酸間也形成氫鍵，導(dǎo)致木瓜蛋白酶間的氫鍵數(shù)量減少，結(jié)合后 木瓜蛋白酶內(nèi)部分子間部分作用力丟失。李有花[35]經(jīng)過統(tǒng)計也發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶上多種氨基酸殘基在對接過程中可與配體分子形成氫鍵。Rao等[36]發(fā)現(xiàn)，配體色素可與木瓜蛋白酶上的268位酪氨酸相互作用形成氫鍵，鐘姝凝[30]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可與β-葡萄糖苷酶在結(jié)合過程中形成14 個氫鍵，這些都與本研究的分析結(jié)果相一致。

2.2.6 抗壞血酸對木瓜蛋白酶可及表面積的影響由表1可知，與抗壞血酸結(jié)合后，木瓜蛋白酶的總可及表面積和疏水表面積均增加，這可能是由于加入抗壞血酸后木瓜蛋白酶上肽鏈延伸，暴露出結(jié)構(gòu)中的親水基團，從而提高活性部位與底物的接觸面積，酶的水解效率提高。疏水區(qū)域的可及表面積變化較小，抗壞血酸結(jié)合后基本不會影響木瓜蛋白酶的疏水性。木瓜蛋白酶的親水表面積始終大于疏水表面積，因此木瓜蛋白酶與抗壞血酸結(jié)合的過程中表現(xiàn)出親水性大于疏水性，相關(guān)研究[28,37]也表明，木瓜蛋白酶表面有較多極性基團，疏水性區(qū)域較少。木瓜蛋白酶在整個模擬過程中為水溶性，表明與抗壞血酸結(jié)合并沒有改變木瓜蛋白酶的溶解性。宣紅霞[38]發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶與激活劑銅離子作用后，可及表面積增大，這與本研究的結(jié)論基本一致。

表 1 抗壞血酸對木瓜蛋白酶可及表面積的影響Table 1 Effect of ascorbic acid on the accessible surface area of the protease

2.2.7 抗壞血酸對木瓜蛋白酶活性中心氨基酸間距離的影響

表 2 抗壞血酸與木瓜蛋白酶活性中心3 個氨基酸殘基的距離Table 2 Distance between ascorbic acid and three amino acid residues at the enzyme’s active center nm

由表2可知，0～100 ns內(nèi)，抗壞血酸與3 個氨基酸的距離均隨時間延長而變小，抗壞血酸與His159和Cys25殘基的距離在100～150 ns內(nèi)略微變大，但整體來看，0～150 ns內(nèi)依舊呈隨時間延長而縮小的趨勢?？箟难崤c活性中心的結(jié)合逐漸緊密，可能結(jié)合后能更有效地發(fā)揮活性中心的催化作用，酶活力也相應(yīng)增強。

表 3 木瓜蛋白酶活性中心3 個氨基酸殘基間距隨時間 （100～150 ns）的變化Table 3 Change in spacing of three amino acid residues at papain’s active center with time (100–150 ns) nm

由表3可知，Asp158與His159距離在結(jié)合抗壞血酸后略微變大，而Cys25到Asp158和His159的距離均縮小，由此可推斷，抗壞血酸對木瓜蛋白酶的激活作用可能與活性中心3 個氨基酸之間距離的變化有關(guān)，氨基酸間距縮小使蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)更緊密，從而更好地發(fā)揮酶活性。宣紅霞[38]通過分子動力學(xué)模擬結(jié)合主成分分析發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶與銅離子交聯(lián)時，蛋白結(jié)合位點附近的氨基酸間距縮小，使蛋白構(gòu)象變得更緊密，進(jìn)而促進(jìn)酶活力；而胰蛋白酶與抑制劑作用后，蛋白結(jié)構(gòu)會變得更松散，這與本研究的計算結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

考察3 種濃度（0.1、0.2、0.3 mmol/L）抗壞血酸處理木瓜蛋白酶對酶活性的影響，結(jié)果表明：抗壞血酸提高了木瓜蛋白酶水解酪蛋白的能力，且抗壞血酸濃度越高，激活作用越明顯；通過分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶在與抗壞血酸結(jié)合后的回旋半徑和RMSD變化不明顯，氨基酸殘基波動程度明顯增大，說明抗壞血酸并沒有對木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)造成大的影響，但可使活性中心的柔性增強，木瓜蛋白酶呈現(xiàn)為被激活的效果；木瓜蛋白酶內(nèi)部的氫鍵數(shù)量平均減少3 個，這可能是由于木瓜蛋白酶與抗壞血酸之間形成了氫鍵所導(dǎo)致；隨著抗壞血酸與木瓜蛋白酶的結(jié)合逐漸緊密，發(fā)揮主要催化作用的Cys25與另外2 個輔助氨基酸殘基（Asp158、His159）的間距縮小，輔助作用增強，因此木瓜蛋白酶能更有效地發(fā)揮催化作用。本研究探討了抗壞血酸與木瓜蛋白酶的結(jié)合機理，為促進(jìn)木瓜蛋白酶在食品中的進(jìn)一步使用和提高嫩肉粉的嫩化效果提供了一定的理論參考。