張宏如，陳靜，徐森磊，顧任鈞，白樺，盧圣鋒，潘玉璟，顧一煌

(1.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結合學院,江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學院·整合醫(yī)學院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院·養(yǎng)生康復學院，江蘇 南京 210023；4.南京中醫(yī)藥大學養(yǎng)老服務與管理學院，江蘇 南京 210023)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是世界范圍內(nèi)死亡率較高的一種心血管疾病[1]。梗死心肌組織中大量心肌細胞壞死,最終被纖維細胞代替從而導致心肌功能喪失[2]。有心肌梗死病史的患者進一步發(fā)生冠狀動脈疾病和腦部疾病的風險最高[3],同時,心梗幸存者更容易再度發(fā)生梗死[4]。目前,治療最有效的方法仍是冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary intervention, PCI),使缺血心肌很快重新恢復血液灌流及氧供應,該過程稱為缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)。然而,再灌注是一把“雙刃劍”,它在恢復心肌供血及供氧的同時也使其超微結構、代謝及功能的損傷更加嚴重,引起心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)[5]。血管新生即通過刺激心肌缺血區(qū)小血管生長,實現(xiàn)心肌缺血區(qū)的自我搭橋,從而建立缺血心肌的側支循環(huán),改善心肌缺血區(qū)的血流狀況。血管新生能夠改善心肌缺血狀態(tài),促進心肌梗死后恢復[6-8]。因此,促進血管新生對防治MIRI、治療心肌梗死至關重要。

MIRI病位在心,我國傳統(tǒng)醫(yī)學中屬“胸痹”“真心痛”的范疇,為本虛標實之癥?，F(xiàn)代臨床試驗和循證醫(yī)學研究表明,針灸對再灌注損傷具有良好的治療效果[9]?；仡櫼酝樉闹委熜呐K疾病的案例,取穴多以內(nèi)關穴疏通心脈、鎮(zhèn)痛安神[10]。梁繁榮和趙凌教授在2019 年發(fā)表于JAMAInternalMedicine的研究報告指出,以內(nèi)關穴為主的針刺療法治療慢性穩(wěn)定性心絞痛時,可顯著減少患者心絞痛發(fā)作次數(shù),降低心絞痛發(fā)作程度[11]。此外,足三里為陽明經(jīng)之合穴、胃之下合穴,能夠調(diào)補脾胃,益氣養(yǎng)血,可治胸痹氣血不足之本,也是臨床治療胸痹的重要腧穴之一。近年來,選用內(nèi)關、足三里標本配穴治療胸痹的報道日趨增多,強調(diào)治標與治本同時進行,效果顯著[12-13]。同時,關于電針內(nèi)關、足三里對心肌損傷等的修復作用也被發(fā)現(xiàn)[14]。然而,電針內(nèi)關、足三里對于MIRI后血管重塑的作用及相關機制仍然有待研究。

血管新生是在缺血、缺氧的條件下,從預先存在的血管中形成新的毛細血管,它是機體的適應性反應,受多種環(huán)境因素的調(diào)控。新生血管可以重新供養(yǎng),改善MIRI后心肌重塑。由于血管新生在心肌梗死后早期搶救缺血性心肌的潛在作用,促血管新生治療成為治療心肌梗死患者的新策略[15-17]。本研究擬通過構建MIRI動物模型,著重比較和探討針灸內(nèi)關、足三里雙穴位對大鼠MIRI后的血管重塑作用,以期為針刺在臨床心血管疾病治療中的應用提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及造模

采用SPF級雄性SD大鼠50只,8周齡,體質(zhì)量(280±20) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心,飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃,濕度為 (50±5)%,給予普通光照(12 h 光照/12 h 黑暗),自由獲取食物和水。實驗過程中所有對動物的處置都嚴格遵守中華人民共和國科學技術部2006 年發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批通過(批準號：202209A046)。

將大鼠分為空白對照組(10只)、MIRI組(10只)、內(nèi)關組(10只)、足三里組(10只)以及內(nèi)關+足三里組(10只)。構建MIRI動物模型[18],采用5%異氟烷伴70%氮氣+30%氧氣將大鼠快速誘導吸入麻醉,并維持在1%～2%的濃度,使大鼠仰臥位于(37±3) ℃的實驗板上,使用呼吸機進行氣管插管和機械通氣(呼吸頻率為45～60次·min-1,潮氣量為10 mL·g-1。接心電監(jiān)護儀,標準Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電圖。剔除胸前毛發(fā),用75%乙醇消毒,于胸骨下端與左腋窩連線相交于4、5肋間處破皮,逐層分離肌肉和筋膜,暴露肋間,以止血鉗鈍性穿破3、4肋間,左手迅速擠出心臟,右手持針,在左心耳右緣下2～3 mm處結扎冠狀動脈,寬度、深度約2 mm,缺血30 min后打開絲線結,使再灌注240 min。關胸逐層縫合,斷開呼吸機,清除呼吸道分泌物。術后予常規(guī)青霉素以預防感染。模型構建過程中MIRI對照組3只,內(nèi)關組和足三里組各有1只大鼠死亡,內(nèi)關+足三里組2只大鼠死亡。

1.2 主要試劑和儀器

CD31抗體(1/100,#AF3628,美國R&D system公司),α-SMA抗體(1/100,# MAB1420,美國R&D system公司),VEGFA抗體(1/1000,ab155944,美國Abcam公司),p-eNOS(1/1000,ab215717,美國Abcam公司),GAPDH抗體(1/1000,ab8245,美國Abcam公司),Goat Anti-Mouse IgG H&L二抗(1/2000,ab96879,美國Abcam公司),DAPI染色液(DA0004,北京雷根生物技術有限公司)。

韓氏電針儀(HANS-200,南京濟生科技有限公司);線性陣列換能器超聲儀(H-300,美國Visualsonics公司);圖像分析儀 Image pro plus 7.0 軟件(美國國立衛(wèi)生研究院);熒光顯微鏡(DMI8,德國徠卡公司)。

1.3 內(nèi)關、足三里穴位選擇與電針治療

參照《實驗針灸學》穴位定位方法選取大鼠內(nèi)關穴和足三里穴。采用0.18 mm×13 mm一次性不銹鋼毫針制成雙極電針(用醫(yī)用絕緣膠帶將2根一次性針灸針針柄并列纏繞,保持兩針身相隔 1 mm,露出針柄末端和針身),在雙側內(nèi)關穴(PC6)和足三里穴(ST36)直刺 2～3 mm,接韓氏電針儀,疏密波,頻率 2 Hz/100 Hz,電流強度 2 mA,針刺 20 min。于再灌注后第2天行電針治療,每日1次,共14 d。MIRI對照組不予電針治療。

1.4 心肌功能檢測

于MIRI造?；螂娽樦委?4 d后對大鼠進行吸入麻醉后仰臥固定,左胸前區(qū)褪毛。采用配備10 MHz的線性陣列換能器的超聲儀,通過二維及 M 型模式進行測定。在 2D 模式下,在胸骨旁短軸切面深度 2 cm 處可見心臟成像,通過 100 mm·s-1的掃描速度測量左心室射血分數(shù)(LVEF)及左心室內(nèi)徑縮短率(LVFS)。

1.5 TTC染色法檢測心肌梗死面積

實驗結束后,取各組大鼠心臟于-20 ℃冰箱凍存 1 h,由心尖至心底部橫向均勻切片(厚度為1 mm),于1%TTC 中 37 ℃ 孵育 15 min,10%福爾馬林固定 10 min,數(shù)碼照相機拍照,蒼白色為梗死區(qū)。用圖像分析儀 Image pro plus 7.0 軟件處理得心梗面積百分比。

1.6 血管生成情況檢測

取心肌組織,采用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測心肌組織中 CD31、α-SMA共表達。將各組大鼠左心室組織固定脫水后橫切成20 μm厚的連續(xù)切片。將組織放置在玻片上進行染色。一半切片在室溫下用1% PBS中的5% BSA阻斷1 h,采用一抗(CD31, α-SMA, 1∶100)在4 ℃孵育過夜。隨后,采用二抗(1∶500)在室溫下孵育1 h。采用DAPI染核。最后,采用×400熒光顯微鏡觀察CD31和α-SMA熒光。

采用Western blot技術檢測心肌組織中VEGFA、CD31、α-SMA、p-eNOS表達情況,充分評價心肌損傷后血管生成及成熟情況。具體實驗步驟參考以往研究[19]。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠的超聲心動圖檢查結果比較

采用超聲心動圖分析造模前后大鼠的心電情況。結果顯示造模后的小鼠ST段抬高,提示發(fā)生心肌梗死(圖1)。對電針處理前后心肌梗死大鼠的LVEF和LVFS參數(shù)進行比較，表明相對空白組,MIRI模型組的大鼠LVEF和LVFS參數(shù)顯著降低(P<0.000 1)。針刺內(nèi)關或足三里穴位的大鼠LVEF和LVFS參數(shù)較未進行針刺的MIRI大鼠顯著升高(P<0.000 1),而針刺內(nèi)關和足三里雙穴位的大鼠LVEF和LVFS參數(shù)相比MIRI模型組(P<0.000 1)及針刺單穴位組(P<0.01)均有顯著升高(圖2)。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積變化

TTC染色結果顯示MIRI組的梗死面積顯著高于空白組(P<0.000 1),提示造模成功。單獨針刺內(nèi)關穴(P<0.001)和足三里穴(P<0.01)能顯著縮小梗死面積,而針刺內(nèi)關穴和足三里雙穴位相比針刺單個穴位能更有效的縮小梗死面積(P<0.05vs內(nèi)關組,P<0.001vs足三里組)。見圖3。

注:**P<0.01,****P<0.000 1。圖2 超聲心動圖檢測各組大鼠的LVEF及Fig.2 Detect the LVEF and LVFS by ECG

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。圖3 TTC染色檢測各組大鼠心肌梗死面積Fig.3 Detect the infarct area in each groups using TTC staining

2.3 各組大鼠心肌組織中α-SMA、CD31等蛋白表達變化

免疫熒光法檢測結果顯示,與空白組比較,MIRI組大鼠心肌組織中α-SMA和CD31表達陽性顯著減弱。相較MIRI組,單獨針刺內(nèi)關或足三里穴位組的大鼠心肌組織中α-SMA和CD31表達陽性增強,而針刺內(nèi)關和足三里雙穴位組的表達陽性強于MIRI對照組以及針刺單穴位組。見圖4。

Western blot結果表明,MIRI組的α-SMA、CD31、VEGFA和p-eNOS蛋白表達水平相對空白組顯著降低(P<0.000 1)。單獨針刺內(nèi)關或足三里穴位組的大鼠心肌組織中α-SMA(P<0.001,P<0.000 1vsMIRI組)、CD31(P<0.000 1vsMIRI組)、VEGFA(P<0.001,P<0.000 1vsMIRI組)和p-eNOS(P<0.001,P<0.001vsMIRI組)蛋白表達水平顯著高于MIRI組,而針刺內(nèi)關和足三里雙穴位組的α-SMA、CD31、VEGFA和p-eNOS蛋白表達水平相對針刺單穴位組(P<0.000 1)和MIRI組(P<0.000 1)均顯著升高。見圖5。

圖4 免疫熒光法檢測各組大鼠心肌組織中CD31和α-SMA共表達情況Fig.4 Test the co-expression of α-SMA and CD31 protein in each groups by IF

注:***P<0.001,****P<0.000 1。圖5 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中VEGFA、CD31、α-SMA和p-eNOS蛋白表達變化Fig.5 Measure the protein levels of VEGFA, α-SMA and CD31 in each groups by Western blot

3 討論

針灸療法治療心血管疾病歷史悠久,針灸對心肌損傷后修復作用顯著。本次研究基于前期研究中針刺內(nèi)關對MIRI的良好療效,結合祖國醫(yī)學“治病必求于本”的理念增加足三里穴。溫和針灸內(nèi)關和足三里可以發(fā)揮心臟保護效應以減輕再灌注損傷[20]?，F(xiàn)代醫(yī)學采用電針處理能夠有效治療MIRI,促進損傷后心肌功能恢復。動物研究表明,內(nèi)關穴針刺處理能顯著改善慢性心衰小鼠的心衰程度[21]。臨床研究表明,針刺內(nèi)關穴對改善運動中的心肌缺血有顯著作用[22]，針刺內(nèi)關穴能影響大鼠心肌梗死區(qū)心肌重構[23]，針刺足三里穴也被報道能夠有效保護大鼠心臟功能[24]，電針刺足三里穴位有助于恢復膿毒癥大鼠心臟損傷[25]。足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴和胃下合穴,能夠調(diào)理脾胃,補益氣血以榮養(yǎng)心脈。內(nèi)關為手厥陰心包經(jīng)之絡穴,通陰維脈,素有“心胸內(nèi)關謀”之說,具有寬胸理氣,活血通絡的功效。治療MIRI時,足三里為本穴,以補為主;內(nèi)關為標穴,以攻為主,兩穴合用共奏標本兼治之功。由此可見,針刺治療MIRI等心臟疾病已取得了一定成效,并處于不斷發(fā)展和深入探索之中。本研究通過單刺內(nèi)關或足三里穴位、針刺內(nèi)關和足三里雙穴多組條件下觀察大鼠MIRI后恢復狀況以及血管再生的變化。本研究中的實驗結果表明,單刺內(nèi)關或足三里均能有效升高大鼠左心室的LVEF和LVFS參數(shù),而針刺雙穴效果較針刺單個穴位更顯著。此外,單刺內(nèi)關或足三里穴位能夠顯著減緩大鼠的心肌梗死面積,而針刺雙穴效果更為顯著。

血管新生指在原有血管基礎上生長形成新血管的過程,是機體對缺氧狀態(tài)的一種自然響應過程[26]。血管新生可在MIRI早期搶救缺血心肌,恢復心肌細胞生長、存活和收縮功能,促進慢性左室重構,防止向心力衰竭過渡。心肌梗死再灌注后刺激血管新生有助于改善心臟灌注和心肌功能[27];增加血管新生能夠提高梗死區(qū)域周邊細胞存活率從而改善心室重構[28]。因此,血管新生在心肌缺血再灌注治療中的作用越來越受到重視。然而,到目前為止,有前景的臨床前研究未能滿足臨床試驗的期望[29-30],這也進一步擴大了對新型促血管生成藥物開發(fā)的需求。血管內(nèi)皮生長因子VEGFA被廣泛認為能夠有效促進血管生成[31-32];CD31作為血管生成標記物被報道能夠參與血管新生[33];α-SMA被認為是血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的標志[34-35]；eNOS通路激活能夠促進血管新生[36-37]。本研究中,我們通過檢測VEGFA、α-SMA、CD31和p-eNOS在各組大鼠心肌組織中表達確定針刺內(nèi)關和足三里對血管生成的作用。結果發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關和足三里雙穴的大鼠心肌組織中VEGFA, α-SMA、CD31和p-eNOS蛋白表達水平顯著高于單刺內(nèi)關和足三里穴位組以及MIRI對照組。實驗結果證實,針灸內(nèi)關、足三里雙穴能有效促進大鼠MIRI后的血管重塑。

綜上所述,針刺內(nèi)關或足三里能夠有效減緩大鼠的心肌缺血再灌注造成的心肌損傷,并且促進血管重塑,而針刺內(nèi)關和足三里雙穴能夠達到比針刺單個穴位更佳的治療效果。然而,當前研究也存在局限性。例如,本研究未探索針刺內(nèi)關和足三里穴對MIRI后血管生成影響的具體機制。因此,課題組計劃后續(xù)研究將圍繞血管生成相關分子機制進行深入探索。