張 蒙，周經(jīng)明，馬 瑋，疏 琴，段 穎，王長林，3

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所·蔬菜生物育種全國重點實驗室 北京 100081； 2.岳陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院湖南岳陽 414000； 3.中蔬生物科技（壽光）有限公司 山東壽光 262700）

土壤鹽漬化是制約蔬菜作物生產(chǎn)的重要因素之一，設(shè)施栽培環(huán)境下，由于連作引起土壤離子失衡，造成鹽害和滲透脅迫，嚴(yán)重威脅設(shè)施栽培蔬菜的品質(zhì)和產(chǎn)量[1-2]。利用砧木能有效改善植株的抗逆性和抗病性，從而提高設(shè)施蔬菜生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益[3-5]。中國南瓜（Cucurbita moschataDuch.）是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬一年生蔓生草本植物，原產(chǎn)于中美洲地區(qū)，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。中國南瓜根系發(fā)達(dá)，是黃瓜、西瓜、甜瓜等瓜類蔬菜嫁接生產(chǎn)中的常用砧木。前人研究表明，選用耐鹽性強的砧用中國南瓜品種，能抑制黃瓜幼苗植株Na+濃度、提高葉片光合作用和抗氧化能力，從而降低鹽脅迫對產(chǎn)量的影響[6-8]。因此，選育抗鹽性強的砧用中國南瓜品種，對提高葫蘆科蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

建立高效而準(zhǔn)確的鑒定評價體系是篩選耐鹽性種質(zhì)資源、培育耐鹽新品種的前提[9-12]。目前，關(guān)于砧用中國南瓜耐鹽性篩選及機制研究主要集中于幼苗生長階段，而對萌發(fā)期階段的研究報道較少[13-15]。采用營養(yǎng)液水培法研究NaCl 對植株生長的影響，發(fā)現(xiàn)隨著NaCl 濃度的增加，中國南瓜幼苗植株生長呈現(xiàn)明顯的衰弱趨勢，葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率等光合參數(shù)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當(dāng)NaCl 濃度高于100 mmol·L-1時，中國南瓜存活率受到顯著抑制[16]。此外，在高濃度NaCl脅迫下，幼苗的鹽害指數(shù)、脯氨酸含量、可溶性糖含量、電解質(zhì)滲透率等指標(biāo)也受到顯著影響，這些指標(biāo)可用于幼苗期耐鹽性評價[10，17-18]。

與幼苗期相比，種子萌發(fā)階段是植株最先感知土壤鹽脅迫的階段，也是評價植物耐鹽性的重要時期之一[19-20]。在種子萌發(fā)期進(jìn)行種質(zhì)耐鹽性篩選，還具有高通量、鑒定周期短、容易操作等優(yōu)點[21]。目前砧用中國南瓜萌發(fā)期的鑒定評價以耐寒性、耐熱性為主，在耐鹽性鑒定評價研究方面，王清華等[22]以3 個品種砧木南瓜種子為試材，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對萌發(fā)時期的主根長度、側(cè)根數(shù)、下胚軸長度及平均鮮質(zhì)量等指標(biāo)的影響較為顯著。孫涌棟等[23]對22 份南瓜屬雜交種進(jìn)行耐鹽性研究，認(rèn)為隸屬函數(shù)法可以避免單一指標(biāo)的片面性，從而較為全面地評價南瓜的耐鹽性。盡管隸屬函數(shù)分析法經(jīng)常應(yīng)用于中國南瓜種質(zhì)的鑒定評價，但對于砧木耐鹽性的鑒定評價等相關(guān)報道尚不多見，一定程度上限制了砧用南瓜種質(zhì)耐鹽性種質(zhì)資源的挖掘和利用[23-24]。

筆者以65 份砧用中國南瓜種質(zhì)為試驗材料，研究了鹽脅迫對種子萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、初生根長度、下胚軸長度等指標(biāo)的影響，并利用相關(guān)性分析、隸屬函數(shù)分析和主成分分析對砧用中國南瓜耐鹽性進(jìn)行綜合評價，建立砧用中國南瓜種子萌發(fā)期耐鹽性的鑒定評價體系，以期為砧用中國南瓜種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

65 份中國南瓜種質(zhì)來源于4 個國家及中國13個省（直轄市），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南瓜育種課題組收集、保存和純化，除火鳳凰（Cmo12）為商業(yè)品種外，其他均為6 代以上純合自交系，編號為Cmo01～Cmo65，各種質(zhì)名稱及來源地見表1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019 年6—8 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗基地進(jìn)行。種子萌發(fā)試驗在一次性無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行。萌發(fā)濾紙、ddH2O、不同濃度的NaCl 溶液均在121 ℃條件下進(jìn)行高壓滅菌15 min。選取籽粒飽滿的種子，55 ℃溫湯浸種20 min 后，30 ℃溫水浸種5 h，然后在超凈工作臺上將種子浸泡于75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，再用6.5%NaClO 消毒液（含有0.5%Triton）振蕩消毒15 min，用滅過菌的ddH2O 沖洗5～6 遍。向培養(yǎng)皿中放入一張滅菌濾紙，以ddH2O 為對照，加入NaCl溶液5 mL，將種子用鑷子擺放于培養(yǎng)皿內(nèi)，封口膜密封，在28 ℃催芽箱中按照隨機區(qū)組排列放置，濕度保持為80%。每個培養(yǎng)皿中放10 粒種子，每處理3 次重復(fù)。種子萌發(fā)2 d 后，每日統(tǒng)計各處理種子出芽情況，并測定各生長指標(biāo)。

鹽脅迫濃度篩選：以5 份中國南瓜高代自交系方城白皮窩瓜（N1）、5Bb040（N2）、5Bb738（N3）、龍洲南瓜（N4）、古縣長南瓜（N5）為試材，以ddH2O 為對照，60、120、180、240、300 mmol·L-1NaCl 溶液為處理組進(jìn)行萌發(fā)試驗。萌發(fā)第7 天測定種子的萌發(fā)率和初生根長度，試驗設(shè)3 次重復(fù)。

耐鹽性鑒定：以65 份砧用中國南瓜種質(zhì)為試材，以ddH2O 處理為對照組，120 mmol·L-1NaCl 溶液為鹽脅迫梯度。每個培養(yǎng)皿中放置10 粒種子，每份種質(zhì)播種3 個培養(yǎng)皿。種子萌發(fā)2～7 d 后，對各項生長指標(biāo)進(jìn)行測定，試驗設(shè)2 次重復(fù)。

1.3 生長指標(biāo)測定方法

萌發(fā)以種孔開裂、胚根伸長至種子長度的一半為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計數(shù)。催芽后3～7 d，每隔24 h 記錄1 次種子發(fā)芽數(shù)，共記錄5 次。第7 天測定初生根長度和下胚軸長度。種子萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)參照孫洪助等[11]測定方法，并根據(jù)第3～5 天的萌發(fā)數(shù)計算發(fā)芽勢。初生根長度和下胚軸長度均用游標(biāo)卡尺測定（mm），每處理測定10 株。生長指標(biāo)計算公式如下：

其中Gt表示種子發(fā)芽第t（d）當(dāng)日萌發(fā)率，Dt表示發(fā)芽天數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析參照[25]的方法進(jìn)行，原始數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并運用Duncan’s 檢驗法進(jìn)行顯著性分析，采用Python 3.7 進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析及隸屬函數(shù)分析。首先計算各生長指標(biāo)的鹽脅迫耐受系數(shù)α，計算公式為：

鹽脅迫耐受系數(shù)α=處理組測定值/對照組測定值。 （6）

對各種質(zhì)不同性狀的鹽脅迫耐受系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和均一化處理，獲得0.0～1.0 之間的賦值。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)對鹽脅迫耐受系數(shù)α進(jìn)行相關(guān)性分析，采用主成分分析法進(jìn)行主因子分析。

隸屬函數(shù)分析中采用的公式如下：

Xj表示根據(jù)主成分分析所計算的綜合指標(biāo)值；Xmax和Xmin分別表示各種質(zhì)在該綜合指標(biāo)計算值中的最大值和最小值。

權(quán)重計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫處理濃度的確定

以5 份中國南瓜高代自交系N1～N5 為試材，種子萌發(fā)7 d 后分別統(tǒng)計不同NaCl 濃度處理下的相對萌發(fā)率和相對下胚軸長度。圖1-A 顯示了不同種質(zhì)在鹽脅迫下的耐鹽性差異。由圖1-B～C 可知，與對照組相比，5 份種質(zhì)的萌發(fā)率和下胚軸長度均受到不同程度的抑制。120 mmol·L-1NaCl 處理時，各種質(zhì)相對萌發(fā)率為21%～100%，相對下胚軸長度為17%～46%，不同種質(zhì)之間的耐鹽性差異較大（圖1-B～C）；而180 mmol·L-1NaCl 處理時，5 份種質(zhì)的相對萌發(fā)率為7%～100%，相對下胚軸長度僅為9%～16%；240 mmol·L-1NaCl 處理時，僅有1份種質(zhì)（N2）表現(xiàn)為耐鹽性較強，萌發(fā)率為87%，其他4 份種質(zhì)萌發(fā)率均低于23%。由此可見，當(dāng)NaCl處理濃度高于180 mmol·L-1時，種質(zhì)之間表型差異不明顯，因此選擇120 mmol·L-1NaCl 進(jìn)行砧用中國南瓜萌發(fā)期耐鹽性鑒定。

圖1 中國南瓜種質(zhì)耐鹽性篩選NaCl 濃度的確定

2.2 鹽脅迫耐受系數(shù)變異幅度及相關(guān)性分析

以65 份中國南瓜種質(zhì)為供試種質(zhì)，分別用ddH2O 和120 mmol·L-1NaCl 進(jìn)行萌發(fā)試驗，計算各生長指標(biāo)的鹽脅迫耐受系數(shù)（α）。5 項生長指標(biāo)鹽脅迫耐受系數(shù)的平均值介于0.28～0.83 之間，變異系數(shù)介于0.23～0.64 之間，離散程度較高，說明選擇120 mmol·L-1NaCl 處理能使不同供試種質(zhì)表現(xiàn)出較為明顯的耐鹽性差異。由表2 可知，中國南瓜種子萌發(fā)率的鹽脅迫耐受系數(shù)（α）最大值為1.00，最小值為0.33，平均值為0.83，表明中國南瓜種質(zhì)在萌發(fā)初始階段對鹽脅迫表現(xiàn)出較大的差異。Cmo38（德豐C06）的發(fā)芽指數(shù)（α發(fā)芽指數(shù)=1.37）和Cmo12（火鳳凰）的發(fā)芽勢（α發(fā)芽勢=1.20）均超過1.00，說明NaCl 處理在一定程度上促進(jìn)了胚根突破種皮的萌發(fā)。初生根長和下胚軸長的鹽脅迫耐受系數(shù)分別在0.09～0.97 和0.05～0.80 之間，表明鹽脅迫也影響了萌發(fā)后初生根的生長。其中，Cmo65（黃狼）和Cmo10（火鳳凰B）初生根長度的鹽脅迫耐受系數(shù)分別為0.97 和0.93，說明這2 份種質(zhì)在萌發(fā)后初生根伸長期表現(xiàn)出較強的耐鹽性。

表2 鹽脅迫對中國南瓜種質(zhì)各項生長指標(biāo)的影響

對各生長指標(biāo)的鹽脅迫耐受系數(shù)α進(jìn)行相關(guān)性分析顯示（表3），萌發(fā)率與發(fā)芽勢相關(guān)性達(dá)到0.80，與發(fā)芽指數(shù)、初生根長的相關(guān)性也分別達(dá)到0.57 和0.49，呈極顯著相關(guān)。如果僅僅選擇單一或其中1～2 個生長指標(biāo)對中國南瓜種質(zhì)進(jìn)行耐鹽性鑒定，可能會對同一份種質(zhì)存在不同的鑒定評價結(jié)果。因此，需要進(jìn)一步挖掘各生長指標(biāo)的內(nèi)在聯(lián)系，建立較為全面的評價方法。

表3 中國南瓜各單項生長指標(biāo)的鹽脅迫耐受系數(shù)（α）相關(guān)性分析

2.3 主成分分析

利用主成分分析對各生長指標(biāo)的鹽脅迫耐受系數(shù)進(jìn)行降維，將原始指標(biāo)信息轉(zhuǎn)變?yōu)? 個綜合因子，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到87.05%，表明這3 個綜合因子可代表原始指標(biāo)的大部分信息（表4）。其中第1 主成分以萌發(fā)率和發(fā)芽勢為主，貢獻(xiàn)值分別為0.504 和0.498，發(fā)芽指數(shù)的貢獻(xiàn)值也較高。第2 主成分以初生根長度和下胚軸長度為主，貢獻(xiàn)值分別為-0.468 和-0.709，第3 主成分仍以初生根長度和下胚軸長度為主，其方差貢獻(xiàn)率較小。主成分分析表明，種子萌發(fā)初始階段相關(guān)的生長指標(biāo)（萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢）與種子萌發(fā)后期相關(guān)的生長指標(biāo)（初生根長度、下胚軸長度）均表現(xiàn)出較高的貢獻(xiàn)率，共同決定了種質(zhì)的耐鹽性。

表4 主成分分析各綜合指標(biāo)及因子貢獻(xiàn)率

2.4 隸屬函數(shù)分析

根據(jù)主成分分析的貢獻(xiàn)率計算各種質(zhì)生長指標(biāo)鹽脅迫耐受系數(shù)的隸屬函數(shù)值和綜合評價值D（表5）。65 份種質(zhì)耐鹽性綜合評價值D介于0.77～0.13 之間，根據(jù)D值將種質(zhì)耐鹽性劃分為4 類。第1 類群共7 個種質(zhì)，D值介于0.63～0.77，分別為Cmo37（0.77）、Cmo33（0.72）、Cmo14（0.72）、Cmo23（0.64）、Cmo10（0.63）、Cmo47（0.63）、Cmo45（0.63），該類群種質(zhì)在種子萌發(fā)初期和萌發(fā)后生長期均表現(xiàn)出較強的抗性，可作為耐鹽性砧用南瓜品種選育的親本資源；第2 類群共27 個種質(zhì)，D值0.46～0.61，表現(xiàn)為中等耐鹽性；第3 類群共25 個種質(zhì)，D值0.30～0.45，表現(xiàn)為中等鹽敏感性；第4 類群共6個種質(zhì)，D值為0.13～0.29，分別為Cmo32（0.29）、Cmo34（0.29）、Cmo60（0.27）、Cmo57（0.26）、Cmo39（0.25）和Cmo29（0.13），表現(xiàn)為較強的鹽敏感性，不適宜作為耐鹽性砧木品種選育的候選種質(zhì)。

表5 中國南瓜種質(zhì)耐鹽性隸屬函數(shù)值

續(xù)表5

3 討論與結(jié)論

3.1 砧用中國南瓜萌發(fā)期耐鹽性綜合評價體系的建立與優(yōu)化

種子萌發(fā)過程可分為2 個相對獨立的階段，第1 階段為種子吸脹萌動、胚根突破種皮，第2 階段為胚根、下胚軸伸長以及地上部生物量的積累[26-27]。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、初生根和下胚軸長度是評價種子萌發(fā)的重要指標(biāo)，反映了種子發(fā)芽的速度、整齊度和幼苗健壯程度[14]。前人研究表明，鹽脅迫下中國南瓜種質(zhì)各生長指標(biāo)之間存在一定的相關(guān)性，這些指標(biāo)能夠從不同的角度反映出耐鹽性的強弱，但是僅憑單一指標(biāo)所反映的耐鹽性，往往不能代表種質(zhì)在整個萌發(fā)過程中的耐鹽性，難以同時對多份種質(zhì)的耐鹽性強弱開展較為客觀的評價[20，22]。也有一些研究采用了綜合評價方法，但限于砧木種質(zhì)多樣性不夠豐富等客觀情況，難以從中選擇典型的耐鹽性種質(zhì)[23]。

筆者的研究選用了65 份砧用中國南瓜高代自交系材料，種質(zhì)遺傳多樣性較為豐富，通過計算鹽脅迫耐受系數(shù)，消除了不同遺傳背景種質(zhì)之間存在的生長差異。相關(guān)性分析和主成分分析顯示，種子的耐鹽性由萌發(fā)初期和初生根伸長期2 個過程共同決定，主成分分析顯示3 個綜合因子代表5 個原始指標(biāo)約87%的信息，通過對降維后的綜合因子進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)初期（3～5 d）和萌發(fā)后期（5～7 d）2個階段的生長指標(biāo)都表現(xiàn)出較高的貢獻(xiàn)率，進(jìn)一步說明了采用綜合評價法的科學(xué)性和必要性，也確保了種質(zhì)耐鹽性評價的客觀性，這種綜合評價方法目前也廣泛應(yīng)用于黃瓜等其他葫蘆科蔬菜的耐鹽性鑒定評價中[28-29]。

值得注意的是，由于設(shè)施栽培環(huán)境下的土壤鹽漬化是非常復(fù)雜的復(fù)合脅迫[30-32]，而筆者的綜合評價體系建立在NaCl 單一處理條件下，因此篩選獲得的耐鹽性種質(zhì)還需進(jìn)行田間評價，同時應(yīng)考慮繼續(xù)優(yōu)化和完善中國南瓜砧木在復(fù)合因子脅迫下的耐受性綜合評價體系，從而提高該評價體系在田間實踐中的應(yīng)用意義。

3.2 耐鹽性種質(zhì)資源的篩選與利用

我國南瓜種質(zhì)資源豐富，但目前砧用南瓜優(yōu)良品種相對匱乏[33-36]。筆者在研究中采用的65 份種質(zhì)，來源地較為廣泛，種質(zhì)遺傳多樣性較高。根據(jù)隸屬函數(shù)分析計算各種質(zhì)耐鹽性的綜合評價值D進(jìn)行排序，共獲得7 份耐鹽性強的種質(zhì)和6 份耐鹽性弱的種質(zhì)。7 份耐鹽性強的種質(zhì)中，火鳳凰B、砧木4-2、白籽南瓜I-5、砧木18-4 等均為從常見砧木品種中分離出來的高代自交系，而德豐C05、商縣小北瓜-2、商縣小北瓜-3 均為新創(chuàng)制的種質(zhì)，具有較高的砧木育種應(yīng)用價值。前人研究指出，中國南瓜種質(zhì)耐鹽性在萌發(fā)期和幼苗期的表現(xiàn)并不一致，這可能是由萌發(fā)期和苗期不同的耐鹽機制引起的[37]。因此，后續(xù)研究將繼續(xù)圍繞苗期耐鹽性、抗病性、去蠟粉能力等一系列砧木性狀，進(jìn)一步篩選表現(xiàn)優(yōu)良的砧用種質(zhì)，評價其耐鹽性砧木品種的育種潛力。

關(guān)于植物耐鹽性調(diào)控機制已經(jīng)在擬南芥、水稻等模式植物中研究得較為明確。擬南芥初生根耐鹽性與根尖氧化還原信號途徑密切相關(guān)[38-40]。在中國南瓜砧木中的研究也進(jìn)一步揭示了活性氧對黃瓜嫁接苗耐鹽性的調(diào)控作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，H2O2信號參與調(diào)控嫁接苗根尖Na+、K+轉(zhuǎn)運及向地上部運輸，并通過介導(dǎo)氣孔運動降低蒸騰速率，從而使細(xì)胞中的的離子濃度、碳水化合物代謝有關(guān)的重要分子信號等維持在一定水平，避免嫁接苗受到鹽脅迫的影響[40]。在鹽脅迫下，施加外源H2S 可以通過活性氧清除機制提高南瓜幼苗抗氧化酶SOD 和CAT 酶活力，并提高脯氨酸含量以緩解滲透脅迫，從而保護(hù)幼苗膜質(zhì)穩(wěn)定性[41]。遺傳分析結(jié)果表明，南瓜耐鹽性是受到多個基因共同控制的復(fù)雜性狀，然而目前，尚未在南瓜中通過圖位克隆的方式鑒定出參與耐鹽性狀形成的主效基因[42]。筆者的研究通過綜合評價體系篩選獲得一批耐鹽性差異顯著并且遺傳背景較為清晰的砧木種質(zhì)資源，后續(xù)將繼續(xù)利用這些種質(zhì)進(jìn)行遺傳群體構(gòu)建，解析中國南瓜耐鹽性遺傳規(guī)律，并對重要QTL 或基因調(diào)控位點進(jìn)行定位并開發(fā)分子標(biāo)記，以期提高耐鹽性砧木的品種選育效率，為解決設(shè)施栽培瓜菜作物土壤鹽堿化問題提供一定的理論依據(jù)。