陳營營,毛瑞峰

(淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 淮安 223300)

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是一類異質(zhì)性革蘭氏陽性菌,它們的使用歷史悠久,被認(rèn)為是安全的,其中一些物種具有對人類健康有益的影響,因此被用作益生菌。此外,在描述其特征時(shí),LAB通常被聲稱具有“公認(rèn)安全”(Generally Recognized as Safe,GRAS)狀態(tài),這也證明了其安全性[1]。然而,盡管一些LAB物種對人類無害,但從監(jiān)管的角度來看,并非所有LAB都可以被描述為GRAS。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)負(fù)責(zé)GRAS狀態(tài)批準(zhǔn),因此要求在授予特定菌株GRAS狀態(tài)之前評估其安全性。迄今為止,只有非基因修飾(非轉(zhuǎn)基因)的乳酸菌菌株獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)。

LAB的基因工程提供了各種工具來改進(jìn)菌株,提高其生存能力和穩(wěn)定性,提高產(chǎn)量和生長速度。有效表達(dá)治療蛋白和將LAB用作疫苗的可能性進(jìn)一步加強(qiáng)了其潛在用途[2]。然而,無論一種特定的轉(zhuǎn)基因LAB可能有多有效,阻礙其營銷的一個(gè)缺點(diǎn)是它受到了基因操縱;這主要是由于消費(fèi)者對轉(zhuǎn)基因微生物的接受度低(特別是在歐盟)以及對其使用的監(jiān)管限制。在2018年國際益生菌協(xié)會世界大會上,有人指出,從科學(xué)角度來看,轉(zhuǎn)基因益生菌是完美的,在歐洲食品安全局注冊時(shí)可能不會遇到問題。然而,消費(fèi)者和工業(yè)界對轉(zhuǎn)基因生物的差異阻礙了它們的接受,因此,只有天然產(chǎn)生的菌株才能獲得批準(zhǔn)。 本文討論了將基因工程LAB推向市場時(shí)可能遇到的障礙,以及它們獲得更好接受所需的步驟。

1 GRAS狀態(tài):定義與確定

GRAS狀態(tài)表明,當(dāng)一種物質(zhì)被添加到食品中時(shí),美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)為它是安全的。美國食品藥品監(jiān)督管理局可以將微生物及其衍生物歸類為批準(zhǔn)用于特定用途的食品添加劑,也可以將其歸類為GRAS物質(zhì)。自1997年以來,一種物質(zhì)被認(rèn)為是GRAS,如果:1)1958年之前在食品中使用過(即,GRAS狀態(tài)是基于在食品中安全使用的歷史,要求大量消費(fèi)者有大量的食品消費(fèi)史);或2)已采取科學(xué)程序,要求與滿足食品添加劑法規(guī)所需的證據(jù)數(shù)量和質(zhì)量相同。GRAS物質(zhì)和食品添加劑是根據(jù)評估專家來區(qū)分的。對于食品添加劑,美國食品藥品監(jiān)督管理局確定該成分的安全性,而對于GRAS物質(zhì),可以由美國食品藥品管理局以外的合格專家進(jìn)行確定。

鑒于GRAS狀態(tài)適用于美國和歐洲的監(jiān)管框架,歐洲食品安全局使用合格安全假設(shè)程序來評估含有微生物的產(chǎn)品,并評估與人類、動物和環(huán)境使用相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)[3]。關(guān)于歐洲監(jiān)管框架和合格安全假設(shè)程序所需的步驟,請參閱參考文獻(xiàn)[4],其中提供了詳細(xì)描述。

2 基因修飾的后果

LAB的基因組修飾可以導(dǎo)致細(xì)胞功能的失活或引入新功能。為了實(shí)現(xiàn)功能的失活,可以刪除或突變基因以削弱其功能。約翰遜乳桿菌具有三個(gè)活性膽汁鹽水解酶(bsh)基因,可以在小鼠腸道中持續(xù)存在;另一方面,瑞士乳桿菌不能持續(xù)存在,因?yàn)樗腷sh基因發(fā)生了框架移位,導(dǎo)致其失活[5]。該領(lǐng)域的發(fā)展帶來了新的技術(shù),現(xiàn)在可以精確去除或替換遺傳元素,并且已經(jīng)成功應(yīng)用于LAB[6],通常目的是實(shí)現(xiàn)生物防護(hù),避免不需要的遺傳元素傳播到環(huán)境中。當(dāng)引入新功能時(shí),可以通過啟動子的突變(例如,允許或增加蛋白質(zhì)表達(dá))或通過逐點(diǎn)突變改變基因(例如,增加酶的催化活性)來激活基因[7]。還可以通過新基因的穩(wěn)定基因組整合來引入新功能。

3 關(guān)于轉(zhuǎn)基因乳酸菌的主要問題及其解決方案

從監(jiān)管立法角度和消費(fèi)者角度來看,基因改造本身都被認(rèn)為是有問題的。到目前為止,還沒有一種轉(zhuǎn)基因LAB菌株被推向市場用于治療或作為食品補(bǔ)充劑。相反,該行業(yè)專注于避免使用重組DNA技術(shù),而是應(yīng)用了自發(fā)誘變。

3.1 生物防護(hù)

生物防護(hù)是一種策略,用于防止遺傳物質(zhì)向其他細(xì)菌的橫向傳播和工程菌株的環(huán)境傳播,以及隨后在環(huán)境中的積累。任何突變體逃逸的頻率必須足夠低,以確保突變體不可能存活。生物防護(hù)系統(tǒng)可以是主動的,也可以是被動的。主動遏制系統(tǒng)能夠通過激活殺死基因或抑制必需基因來殺死宿主,該基因的表達(dá)受到環(huán)境響應(yīng)元件的嚴(yán)格控制[8]。然而,可能發(fā)生使殺傷基因失活或?qū)е卤匦杌蚪M成型表達(dá)的突變。此外,在主動系統(tǒng)中,引入的外源DNA的量通常大于被動系統(tǒng)中的外源DNA?；钚韵到y(tǒng)通常依賴于質(zhì)粒,質(zhì)粒需要整合到細(xì)菌染色體中。隨后,在質(zhì)粒整合到細(xì)菌染色體中之后,需要證明LAB的功能。另一方面,被動遏制系統(tǒng)是穩(wěn)健的,設(shè)計(jì)非常簡單,它們主要基于通過補(bǔ)充環(huán)境中通常不存在的另一種基因或必需代謝產(chǎn)物來補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷或基因缺陷。被動系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是它們通常是抑菌的,而不是殺菌的。然而,殺菌作用可以通過兩種營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)因子的組合獲得[8]。

新的生物防護(hù)策略使用合成基因回路來控制細(xì)胞增殖,以應(yīng)對環(huán)境條件,這是由變構(gòu)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子檢測到的[9]。為了開發(fā)合成營養(yǎng)缺陷型,在大腸桿菌中構(gòu)建了依賴于外源合成小分子表達(dá)必需基因的菌株。生物防護(hù)系統(tǒng)包含重疊的保障措施:用于控制基本基因表達(dá)的工程核糖調(diào)節(jié)劑;以及基于切割宿主基因組的核酸酶的工程成癮模塊[10]。這些新的生物防護(hù)策略可以從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到LAB。

3.2 乳酸菌的抗生素耐藥性及其在篩選轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用

抗生素耐藥性涉及活性抗生素分子直接失活的幾種機(jī)制,以及通過改變靶位點(diǎn)或減少抗生素?cái)z取而喪失對抗生素的易感性的幾種機(jī)制。頻繁使用抗生素會導(dǎo)致耐藥細(xì)菌微生物將其耐藥機(jī)制轉(zhuǎn)移到其他微生物身上,并對公共健康和環(huán)境構(gòu)成威脅。因此,2017年,世界衛(wèi)生組織發(fā)起了一項(xiàng)運(yùn)動,作為全球計(jì)劃的一部分,提高人們對抗生素耐藥性(包括抗生素耐藥性)的認(rèn)識[11]。

乳酸菌可能是抗生素耐藥性基因的宿主?？剐曰蜣D(zhuǎn)移是垂直的,因此它本身并不存在安全問題。然而,外部因素可以誘導(dǎo)有利于通過食物鏈水平轉(zhuǎn)移對病原體的抗性基因的變化,這是人類和動物健康關(guān)注的一個(gè)主要原因。LAB的安全性研究表明,它們很容易對抗生素產(chǎn)生耐藥性。大多數(shù)可用數(shù)據(jù)都是從機(jī)會致病性腸球菌中收集的,尤其是耐萬古霉素的腸球菌,它會導(dǎo)致反復(fù)的醫(yī)院獲得性感染[12]。對于攝入益生菌后人類消化道中抗生素耐藥性基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)考慮向免疫受損的患者添加益生菌乳酸桿菌。

3.3 無抗生素選擇系統(tǒng)

目前,已經(jīng)開發(fā)了不含抗生素耐藥性基因的表達(dá)和基因遞送載體來提高產(chǎn)品的安全性。根據(jù)其作用機(jī)制,這些系統(tǒng)可以基于營養(yǎng)缺陷型、非抗生素顯性和互補(bǔ)標(biāo)記、分離后殺傷、RNA干擾或?qū)Ρ匦杌虻娜ヒ种芠13]。非抗生素顯性選擇標(biāo)記是直接的,并且取決于它們在感興趣的質(zhì)粒中的存在。顯性選擇標(biāo)記的例子取決于細(xì)菌素抗性或重金屬抗性[14]。細(xì)菌素的一個(gè)典型代表是乳鏈菌素,它是由某些乳酸乳桿菌菌株產(chǎn)生的,在食品工業(yè)中被廣泛用作一種安全天然的防腐劑?；诩?xì)菌素抗性的第一個(gè)食品級質(zhì)粒含有乳酸鏈球菌素抗性基因[15]。

3.4 毒力因素

每種生物工程菌株都需要仔細(xì)評估毒力因素,即可能引起致病性的基因。外源DNA的引入可能導(dǎo)致新物質(zhì)的合成,如蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)也可能具有毒性或致敏性。對于新的蛋白質(zhì),必須將氨基酸序列與已知蛋白質(zhì)進(jìn)行比較,以獲得潛在的同源性。它們的抗?fàn)I養(yǎng)活性(例如,作為蛋白酶抑制劑、凝集素)以及對加熱、加工和降解的穩(wěn)定性必須在適當(dāng)?shù)拇硇晕负湍c模型系統(tǒng)中進(jìn)行評估。到目前為止,還沒有關(guān)于這種新表達(dá)的蛋白質(zhì)預(yù)測人類過敏反應(yīng)的有限測試報(bào)告[16]。

3.5 延遲的不良影響

產(chǎn)品的安全性和個(gè)人對產(chǎn)品的反應(yīng)取決于其應(yīng)用模式(例如局部、系統(tǒng))和消費(fèi)者的基因檔案。特定亞群體可能特別敏感,如免疫受損的個(gè)體、嬰兒和老年人。因此,必須對新型食品進(jìn)行上市后監(jiān)測,以避免潛在的嚴(yán)重不良影響。在任何此類新型食品投放市場后,需要對其對消費(fèi)者的影響進(jìn)行長期監(jiān)測。由于攝入不一致導(dǎo)致的技術(shù)問題可能是一個(gè)缺點(diǎn),并且可能難以長期監(jiān)測變化[16]。在轉(zhuǎn)基因LAB投放市場后,建議對其進(jìn)行密切監(jiān)測,以防止延遲的不良影響,并確保安全消費(fèi)。

3.6 表面展示

重組蛋白與未分化細(xì)菌表面的異源結(jié)合將使非轉(zhuǎn)基因和不太復(fù)雜的調(diào)控程序得以使用[17];然而,需要確認(rèn)缺乏重組DNA和活的重組細(xì)菌細(xì)胞。已經(jīng)在LAB中成功開發(fā)了幾種異源蛋白質(zhì)展示系統(tǒng)。與GFP融合并在大腸桿菌中表達(dá)的內(nèi)溶素Lyb5附著在各種LAB的表面,包括乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌[18]。此外,與AcmA融合的“設(shè)計(jì)錨蛋白重復(fù)蛋白”已顯示出與嗜酸乳桿菌表面的異源結(jié)合。源于活性LAB的細(xì)菌樣顆粒同樣可以作為表面展示的載體,通過利用大腸桿菌等異源表達(dá)體系,獲得含有錨定域的融合重組蛋白,再通過與LAB細(xì)菌樣顆?；旌?可實(shí)現(xiàn)將目的蛋白質(zhì)展示于細(xì)菌樣顆粒表面,進(jìn)而獲得顆粒型疫苗等制劑,從而可避免轉(zhuǎn)基因組分的使用[19]。

4 將LAB作為細(xì)胞工廠進(jìn)行基因改造

經(jīng)過基因改造的LAB可以在封閉系統(tǒng)中作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)所需的化合物,這降低了微生物不必要地釋放到環(huán)境中的可能性和污染風(fēng)險(xiǎn)。因此,從監(jiān)管的角度來看,此類應(yīng)用的問題要小得多。LAB的基因工程使其能夠應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)。這里使用的最常見的屬是乳球菌屬和乳桿菌屬。LAB的代謝工程允許修改現(xiàn)有的代謝途徑,以改善LAB作為食品發(fā)酵起始物的特性。不同的代謝工程策略已被用于改變生產(chǎn)甜味劑、風(fēng)味、香氣、胞外多糖和維生素的代謝途徑[20]。LAB的主要工業(yè)應(yīng)用是發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,乳酸也是其碳水化合物代謝的主要產(chǎn)物。乳酸在食品、化妝品、制藥、化工和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用歷史悠久。此外,由于乳酸被用作生產(chǎn)可生物降解和生物相容性聚乳酸的前體,對乳酸的需求正在增長,在纖維、紡織、塑化和包裝行業(yè)具有商業(yè)價(jià)值。感興趣的化合物的內(nèi)在生產(chǎn)是優(yōu)選的,但這通常會導(dǎo)致數(shù)量不足。基因修飾提供了提高感興趣化合物產(chǎn)量以及提高化合物特性(例如純度)的可能性。除了乳酸的生產(chǎn)外,LAB還在非食品(如乙醇生產(chǎn))和功能成分(如維生素、低熱量甜味劑、胞外多糖和抗菌劑)的工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用。代謝工程乳桿菌已用于從乳制品和玉米加工廢料中進(jìn)行乙醇的工業(yè)生物轉(zhuǎn)化[21]。乳酸菌可用于生產(chǎn)營養(yǎng)品,如多元醇(如糖醇)和維生素,尤其是B族維生素,如核糖和葉酸。

5 結(jié)語

LAB的基因修飾可以產(chǎn)生具有廣泛應(yīng)用的改良菌株,包括用于治療、食品工業(yè)和代謝產(chǎn)物生產(chǎn)(例如作為生物催化劑、細(xì)胞工廠)。這些應(yīng)用程序在所需監(jiān)管程序的可接受性和嚴(yán)格性方面存在差異。作為生物催化劑,LAB可用于生產(chǎn)乳酸、醫(yī)藥中間體、營養(yǎng)品和一系列化學(xué)品。它們代表了重組蛋白生產(chǎn)和隨后分離的有前景的細(xì)胞工廠,因?yàn)樗鼈冃纬砂w的趨勢很低,并且缺乏內(nèi)毒素。如果不涉及基因工程,則通過過表達(dá)所需蛋白質(zhì)來改善LAB作為細(xì)胞工廠是更可接受的。轉(zhuǎn)基因LAB在食品制造中的使用是最有問題的,因?yàn)槿藗儞?dān)心改良的染色劑、質(zhì)粒和重組基因的傳播,尤其是公眾接受度低。為了使轉(zhuǎn)基因LAB在食品工業(yè)中的實(shí)施成為可能,已經(jīng)開發(fā)了食品級表達(dá)系統(tǒng),其確保用替代標(biāo)記物和同源DNA的使用來取代抗生素耐藥性標(biāo)記物。然而,用于食品的菌株開發(fā)仍然依賴于經(jīng)典的非轉(zhuǎn)基因方法。鑒于公眾對轉(zhuǎn)基因LAB安全性方面的擔(dān)憂,相關(guān)新型研究工具應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步優(yōu)化與完善,盡可能規(guī)避或降低出現(xiàn)意外風(fēng)險(xiǎn)的可能性,進(jìn)而提高公眾對其的認(rèn)知和接受能力。